武月冉，包暄，尹鑫濤，馮雪，董明盛

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，江蘇 南京，210095)

姜黃素是一種天然來(lái)源的多酚類(lèi)化合物，主要從姜黃類(lèi)植物的根莖中提取得到，目前作為調(diào)味料和食用色素被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)中[1]。大量研究表明，姜黃素具有抗炎癥[2]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]等生理活性，同時(shí)對(duì)糖尿病[5]、人體缺陷免疫綜合征[6]、心肌病[7]等疾病都有顯著的預(yù)防和治療效果。然而，姜黃素在水中溶解度極低[8]，在光照、加熱和化學(xué)處理時(shí)穩(wěn)定性差，易發(fā)生變性和降解[9]，這都造成了姜黃素的生物利用度較低，難以在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)揮其生理功能。因此，如何提高姜黃素的穩(wěn)定性和生物利用度成為了當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。

為解決上述問(wèn)題，微膠囊包埋技術(shù)被廣泛應(yīng)用于姜黃素等功能活性物質(zhì)的包埋和遞送。常見(jiàn)的包埋載體主要包括脂質(zhì)體、高分子納米顆粒、環(huán)糊精、納米乳液等[10]，它們通常為食品級(jí)運(yùn)載體系，具有來(lái)源廣泛、無(wú)毒副作用、致敏性低、生物相容性高等優(yōu)點(diǎn)[11]。更重要的是，包埋技術(shù)可以顯著改善姜黃素等生物活性物質(zhì)的水溶性和環(huán)境穩(wěn)定性[12]，提高生物利用度，保護(hù)其免受體內(nèi)的酶和其他物質(zhì)的分解，并實(shí)現(xiàn)靶向運(yùn)輸和可控性釋放[13]，最大限度地發(fā)揮生物活性功能。然而，這些包埋載體的制備過(guò)程較為復(fù)雜，且常常涉及到化學(xué)試劑(如戊二醛、丙酮等)的添加和高溫處理[14-15]，在安全性和經(jīng)濟(jì)性方面存在一定的局限性。

與上述包埋載體相比，酵母細(xì)胞基包埋載體在安全性、經(jīng)濟(jì)性和包埋效果方面都具有顯著的優(yōu)勢(shì)[16]。同時(shí)，酵母包埋材料可以顯著提高包埋物質(zhì)的穩(wěn)定性，防止活性物質(zhì)在食品加工過(guò)程中發(fā)生分解，這主要得益于酵母細(xì)胞所具有的結(jié)構(gòu)，即堅(jiān)固的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)、具有選擇透過(guò)性的細(xì)胞膜和包含抗氧化成分的細(xì)胞質(zhì)[17]。白地霉是一種性狀類(lèi)似酵母的的耐酸性霉菌，來(lái)源廣泛且環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)[18]，被廣泛應(yīng)用于奶酪發(fā)酵、污水治理和動(dòng)物飼養(yǎng)等領(lǐng)域[19-21]。白地霉和酵母菌在結(jié)構(gòu)和功能方面的相似性，以及開(kāi)菲爾源白地霉獨(dú)特的益生功能，使其成為了一種理想的姜黃素包埋材料，在功能性食品開(kāi)發(fā)和疾病預(yù)防治療方面有著廣闊的應(yīng)用前景，但目前仍然沒(méi)有關(guān)于白地霉在姜黃素包埋方面的研究。

本研究選用實(shí)驗(yàn)室保藏的1株從西藏開(kāi)菲爾中篩選出的白地霉(GeotrichumcandidumLG-8)作為包埋載體，確定了最佳包埋條件，表征了其對(duì)姜黃素的包埋能力，并探究了包埋產(chǎn)物的穩(wěn)定性，旨在為提高姜黃素的穩(wěn)定性和生物利用度提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

姜黃素(分析純)，上海麥克林生物公司；白地霉,開(kāi)菲爾源白地霉LG-8(G.candidumLG-8)，保藏于本實(shí)驗(yàn)室中；葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、甘油(分析純)、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、PBS緩沖液(pH 7)，上海阿拉丁生化試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-85L無(wú)油隔膜式真空泵，上海力辰儀器科技有限公司；μQuant微孔板掃描分光光度計(jì)，美國(guó)博騰儀器有限公司；Leica TCSSP8STED超高分辨共聚焦顯微鏡，德國(guó)徠卡儀器有限公司；UltraVIEW VoX活細(xì)胞高速激光共聚焦實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)，美國(guó)鉑金埃爾默公司；JEM2100透射電子顯微鏡，日本電子株式會(huì)社。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白地霉包埋載體的制備

取甘油管保藏的白地霉，經(jīng)酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基活化24 h后，以10%的接種量進(jìn)行18 h二次活化和20 h擴(kuò)大培養(yǎng)。離心得到白地霉菌體，用純水洗滌3次，得到的菌泥為白地霉包埋載體，密封貯存在4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 白地霉-姜黃素包埋產(chǎn)物的制備

參考YOUNG等[22]的方法，白地霉-姜黃素包埋產(chǎn)物(G.candidum-curcumin encapsulation products, GCEPs)的制備采用真空包埋法。稱(chēng)取1 g(濕重)白地霉菌泥加入5 mL乙醇溶液中制成懸濁液,并加入1 mL 1 mg/mL的姜黃素乙醇溶液，以90%的真空度對(duì)混合溶液進(jìn)行抽真空處理，離心得到的沉淀即GCEPs。

1.3.3 GCEPs中姜黃素的提取與含量測(cè)定

GCEPs中的姜黃素通過(guò)超聲處理的方法提取得到，并通過(guò)分光光度分析法計(jì)算姜黃素含量。將1 g GCEPs(濕重)加入5 mL無(wú)水乙醇中制成懸濁液，超聲處理10 min使GCEPs中的姜黃素溶解于無(wú)水乙醇中，離心后測(cè)量上清液在425 nm處的吸光值，并通過(guò)姜黃素乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算GCEPs中的姜黃素含量。

1.3.4 包埋率的計(jì)算

包埋率被用作表征載體包埋能力的指標(biāo)，具體是指姜黃素包埋量與姜黃素初始添加量的比值，計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：Vf，從GCEPs中提取得到的姜黃素溶液體積，5 mL；V0，姜黃素溶液初始添加體積，1 mL；ρf，從GCEPs中提取得到的姜黃素溶液質(zhì)量濃度，mg/mL；ρ0，姜黃素溶液初始添加質(zhì)量濃度，1 mg/mL。

1.3.5 包埋條件的優(yōu)化

單因素實(shí)驗(yàn)：以包埋率為指標(biāo)，探究包埋環(huán)境pH、包埋介質(zhì)乙醇體積分?jǐn)?shù)和真空處理時(shí)間對(duì)白地霉包埋姜黃素能力的影響。

包埋環(huán)境pH：稱(chēng)取1 g(濕重)白地霉菌泥，加入5 mL 體積分?jǐn)?shù)為35%的乙醇溶液中制成懸濁液，調(diào)節(jié)懸濁液pH分別為2、4、6、8、10、12，加入1 mL 1 mg/mL的姜黃素溶液，真空處理1 min，計(jì)算包埋率。

包埋介質(zhì)乙醇體積分?jǐn)?shù)：稱(chēng)取1 g(濕重)白地霉菌泥，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)分別為0%、10%、20%、30%、40%、50%的乙醇溶液中制成懸濁液，調(diào)節(jié)懸濁液pH為7，加入1 mL 1 mg/mL的姜黃素溶液，真空處理1 min，計(jì)算包埋率。

真空處理時(shí)間：稱(chēng)取1 g(濕重)白地霉菌泥，加入到5 mL體積分?jǐn)?shù)為35%的乙醇溶液中制成懸濁液，調(diào)節(jié)懸濁液pH為7，加入1 mL 1 mg/mL的姜黃素溶液，真空處理時(shí)間分別為0.5、1、5、10、20、30 min，計(jì)算包埋率。

響應(yīng)曲面優(yōu)化：基于上述單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以包埋率為指標(biāo)，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)，探究最佳包埋條件。各因素和水平編碼見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)曲面因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface

1.3.6 GCEPs的表征

1.3.6.1 激光共聚焦顯微鏡觀察

姜黃素可以在425 nm處產(chǎn)生綠色熒光，無(wú)需進(jìn)行二次染色。用于制片的樣品分別為：白地霉包埋載體、GCEPs和乙醇提取姜黃素處理后的GCEPs。制片方法為：取1 g(濕重)上述樣品，加入5 mL PBS緩沖液(pH 7)中制成懸濁液，吸取少量懸濁液滴在載玻片上制成樣片，蓋好蓋玻片并避光保存，防止發(fā)生熒光淬滅。將樣片放置于無(wú)激發(fā)光狀態(tài)下和425 nm激發(fā)光下分別拍攝照片，再將2張圖片重合。

1.3.6.2 透射電鏡觀察

用于透射電鏡的樣品為白地霉包埋載體和GCEPs。制樣方法為：將上述樣品用PBS緩沖液(pH 7)清洗3次后，用體積分?jǐn)?shù)為2.5%的戊二醛固定12 h，脫水處理并制備切片，再用檸檬酸鉛和醋酸鈾對(duì)超薄切片進(jìn)行染色后，用透射電鏡進(jìn)行觀察。

1.3.7 GCEPs的穩(wěn)定性分析

1.3.7.1 貯存時(shí)間對(duì)GCEPs穩(wěn)定性的影響

將1 g(濕重)GCEPs加入10 mL PBS緩沖液(pH 7)中制成懸濁液，靜置避光保存0、1、5、10、20、30 d后，參考1.3.3中的方法提取出GCEPs中殘留的姜黃素，并計(jì)算GCEPs中姜黃素的保留率。同時(shí)，未經(jīng)過(guò)包埋的游離姜黃素在PBS緩沖液(pH 7)中的保留情況也被研究，并用來(lái)與GCEPs中的姜黃素比較。姜黃素保留率的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A1，不同處理前從GCEPs中提取出的姜黃素在425 nm處的吸光值；A2，不同處理后從GCEPs中提取出的姜黃素在425 nm處的吸光值。

1.3.7.2 pH對(duì)GCEPs穩(wěn)定性的影響

將1 g(濕重)GCEPs加入10 mL PBS緩沖液(pH 7)中制成懸濁液，調(diào)節(jié)pH分別為2、4、6、8、10、12，靜置避光保存0.5、1、3、5 h后，參考1.3.3中的方法提取出GCEPs中殘留的姜黃素，并計(jì)算GCEPs中姜黃素的保留率，計(jì)算方法參考公式(2)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示；運(yùn)用Origin 2021軟件作圖；運(yùn)用SAS和Design Expert 8.0.6進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 表示存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 包埋條件的優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

包埋環(huán)境pH、包埋介質(zhì)乙醇體積分?jǐn)?shù)和真空處理時(shí)間對(duì)姜黃素包埋率的影響如圖1所示。總體來(lái)看，與堿性環(huán)境相比，白地霉在酸性環(huán)境中對(duì)姜黃素的包埋能力更強(qiáng)。當(dāng)包埋環(huán)境為酸性時(shí)，隨著酸性的減弱，包埋率逐漸增加，在pH為6時(shí)達(dá)到最大值，為(39.54±0.87)%。之后隨著堿性增強(qiáng)，包埋率顯著下降(P<0.05)，pH 12時(shí)包埋率低于1%。這主要是由于白地霉在弱酸性環(huán)境中活性更強(qiáng)，對(duì)堿性環(huán)境更為敏感[23]，當(dāng)包埋環(huán)境過(guò)酸或過(guò)堿時(shí)，白地霉細(xì)胞的活性受到影響，使其對(duì)姜黃素的包埋效率下降。同時(shí)，姜黃素在酸性環(huán)境中的穩(wěn)定性較強(qiáng)，而在堿性環(huán)境中極易發(fā)生降解[24]。隨著包埋介質(zhì)乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，包埋率先上升后下降，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)達(dá)到最大值，包埋率為(44.38±1.39)%。YOUNG等[22]的研究中也具有相似的結(jié)果：以釀酒酵母細(xì)胞為姜黃素包埋載體并使用真空包埋法，當(dāng)包埋介質(zhì)乙醇體積分?jǐn)?shù)為35%時(shí)包埋率最高。隨著真空處理時(shí)間的增加，白地霉的包埋率呈顯著上升趨勢(shì)(P<0.05)，當(dāng)真空處理時(shí)間為20 min時(shí)，白地霉對(duì)姜黃素的包埋能力趨于飽和，包埋率為(47.34±1.35)%。此后，隨著真空處理時(shí)間的繼續(xù)增加，包埋率顯著下降(P<0.05)，這是由于較長(zhǎng)時(shí)間的真空處理導(dǎo)致白地霉細(xì)胞受損，包埋能力下降。

a-不同包埋環(huán)境pH的包埋率；b-不同包埋介質(zhì)乙醇體積分?jǐn)?shù)的包埋率；c-不同真空處理時(shí)間的包埋率圖1 不同因素對(duì)姜黃素包埋率的影響Fig.1 The influence of different factors on curcumin encapsulation efficiency注：同組不同小寫(xiě)字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.1.2 響應(yīng)曲面優(yōu)化

利用Design Expert 8.0.6軟件，按照表1的編碼水平設(shè)計(jì)17組實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。得到的三元二次回歸方程為：Y=45.10-7.36A+4.05B+6.54C-1.90AB+2.02AC+1.19BC-13.87A2-8.02B2+2.42C2-0.94ABC

表2 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

通過(guò)表3的方差分析結(jié)果可知，此回歸模型極顯著(P<0.01)，模型R2=0.987 9，說(shuō)明模型擬合程度高，可用于預(yù)測(cè)白地霉包埋姜黃素的最佳條件。另外，根據(jù)F值可以看出，各因素對(duì)姜黃素包埋率影響的主次順序?yàn)椋喊癍h(huán)境pH(A)>包埋介質(zhì)乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)>真空處理時(shí)間(C)。根據(jù)P值可以看出，A和BC對(duì)包埋率的影響極顯著(P<0.01)，B、C和B2對(duì)包埋率有顯著影響(P<0.05)。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

通過(guò)Design Expert 8.0.6軟件分析可以得到，最佳包埋條件為：包埋環(huán)境pH 6.64，包埋介質(zhì)乙醇體積分?jǐn)?shù)46.84%，真空處理時(shí)間18.38 min，此條件下得到的理論包埋率為56.34%。結(jié)合實(shí)際操作情況，將最佳包埋條件調(diào)整為：包埋環(huán)境pH 6.5，包埋介質(zhì)乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，真空處理時(shí)間20 min，進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，得到的實(shí)際包埋率為(54.12±1.07)%，與理論值接近，說(shuō)明該回歸模型擬合度高，可用于優(yōu)化白地霉對(duì)姜黃素的包埋條件。

2.2 GCEPs的表征

2.2.1 激光共聚焦顯微鏡分析

圖2為白地霉包埋載體、GCEPs和乙醇提取姜黃素處理后的GCEPs的激光共聚焦顯微鏡圖像。在明場(chǎng)下，白地霉的輪廓清晰可見(jiàn)，呈圓柱形或棒狀，且在熒光場(chǎng)未看到白地霉，說(shuō)明白地霉自身沒(méi)有熒光性質(zhì)。GCEPs的圖像中，在熒光條件下可以觀察到姜黃素發(fā)出的明顯綠色熒光，同時(shí)，從合成圖像可以看出姜黃素在白地霉包埋載體中分布均勻，說(shuō)明真空包埋法可以用于制備GCEPs，且保持白地霉包埋載體自身的完整性。用乙醇提取GCEPs中的姜黃素后，白地霉包埋載體的形態(tài)未發(fā)生明顯變化，但熒光條件下觀察到的熒光強(qiáng)度明顯減弱，表明包埋在GCEPs中的大部分姜黃素都可以通過(guò)乙醇處理的方法提取得到，用于姜黃素包埋率的計(jì)算。

a-白地霉包埋載體；b-GCEPs；c-乙醇提取姜黃素處理后的GCEPs圖2 白地霉包埋載體和乙醇處理前后的GCEPs的激光共聚焦顯微鏡圖像Fig.2 CLSM images of G.candidum and GCEPs before and after extraction treatment by ethanol

2.2.2 透射電鏡分析

透射電鏡的結(jié)果如圖3所示。觀察可知，白地霉的細(xì)胞質(zhì)均勻分布在細(xì)胞中，且細(xì)胞壁較厚，共有3層，由外到內(nèi)分別為甘露聚糖、蛋白質(zhì)分子和葡聚糖[25]。經(jīng)過(guò)真空包埋處理后，白地霉的細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯變化，切面仍然保持圓形或橢圓形，說(shuō)明真空包埋法不會(huì)對(duì)白地霉的細(xì)胞形態(tài)造成破壞。同時(shí)，可以看到姜黃素均勻分散在細(xì)胞質(zhì)中，與激光共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果一致，驗(yàn)證了白地霉作為姜黃素包埋載體的可行性。

a-白地霉包埋載體;b-GCEPs圖3 白地霉包埋載體和GCEPs的透射電鏡圖像Fig.3 TEM images of G.candidum and GCEPs

2.3 GCEPs的穩(wěn)定性分析

2.3.1 貯存時(shí)間對(duì)GCEPs穩(wěn)定性的影響

隨著貯存時(shí)間的增加，GCEPs中的姜黃素有一定的損失，但總體來(lái)看具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。在室溫條件下避光貯存1 d后，GCEPs中大部分的姜黃素被保留，保留率高達(dá)(94.69±1.93)%；隨著貯存時(shí)間的增加，包埋產(chǎn)物中的姜黃素緩慢流失；30 d時(shí)，GCEPs的姜黃素保留率為(70.41±1.17)%，仍處于較高保留水平。然而，未包埋的游離姜黃素表現(xiàn)出了極差的穩(wěn)定性，僅在1 d時(shí)間內(nèi)就損失了約90%；10 d后，超過(guò)99%的姜黃素變性分解。馮甜華[26]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣也證實(shí)了未包埋姜黃素穩(wěn)定性差這一特點(diǎn)：自然條件下貯存72 h后，游離姜黃素的殘量百分比僅有(1.94±0.58)%。綜上所述，白地霉的包埋可以顯著提高姜黃素的貯存穩(wěn)定性。

圖4 不同貯存時(shí)間下GCEPs中的姜黃素和游離姜黃素的保留率Fig.4 Retention rates of curcumin in GCEPs and free curcumin at different storage time

2.3.2 pH對(duì)GCEPs穩(wěn)定性的影響

姜黃素在生理pH條件下極不穩(wěn)定，在堿性環(huán)境中易發(fā)生變性和降解，這都導(dǎo)致了姜黃素的生物利用度極低[27]。因此，探究不同pH條件下GCEPs中姜黃素的穩(wěn)定性對(duì)提高姜黃素的生物利用度具有重要意義。根據(jù)圖5可知，在酸性和弱堿性環(huán)境中，GCEPs中的姜黃素可以在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，當(dāng)pH分別為2、4、6、8時(shí)，GCEPs中的姜黃素在5 h后的保留率分別為(93.12±0.56)%、(93.87±0.19)%、(91.08±0.74)%和(87.17±2.42)%，均處于較高水平。然而，pH為10和12時(shí)，5 h后GCEPs中的姜黃素保留率僅有(41.82±0.56)%和(29.18±0.56)%，與酸性和弱堿性環(huán)境的保留率相比發(fā)生顯著降低(P<0.05)。因此，GCEPs中的姜黃素在酸性、中性和弱堿性環(huán)境下可以保持較好的穩(wěn)定性，但強(qiáng)堿性環(huán)境會(huì)加速包埋姜黃素的變性與降解。

圖5 不同pH條件下GCEPs中姜黃素的保留率隨時(shí)間的變化情況Fig.5 Retention rates of curcumin in GCEPs at different pH conditions for various incubation time

3 結(jié)論

開(kāi)菲爾源白地霉(G.candidumLG-8)作為包埋材料，可以有效地包埋姜黃素，在最佳包埋條件下，即包埋環(huán)境pH 6.5，包埋介質(zhì)乙醇體積分?jǐn)?shù)45%，真空處理時(shí)間20 min，包埋率高達(dá)(54.12±1.07)%，具有優(yōu)秀的包埋性能。同時(shí)，經(jīng)過(guò)白地霉包埋后，姜黃素的貯存穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)，尤其是在酸性和弱堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性。本文探究了開(kāi)菲爾源白地霉作為姜黃素包埋載體的可行性，為提高姜黃素的穩(wěn)定性和生物利用度提供了新思路。