梁曹雯，曹庸*，李俊，劉果，朱曉艾，馮孔龍，陳媛媛，李赟，羅珍

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642）（2.無限極(中國)有限公司，廣東廣州 510665）

多個研究已經(jīng)證明牛乳中含有能促進睡眠的肽[1,2]。2009 年Saint-Hilaire[3]研究的結(jié)果證明牛乳源促睡眠肽對人睡眠也有促進作用，長期施用牛乳源絡(luò)蛋白水解肽在4 周期間對睡眠的各個方面具有顯著影響，用牛乳源酪蛋白水解肽治療的受試者在治療14 d后顯示出PSQI-J（匹茨堡睡眠質(zhì)量指數(shù)量表）總得分顯著降低，治療28 d 后這種改善作用更大，并且在治療停止一周后仍然可以察覺。2016 年Dela[4]研究表明牛乳磷酸酪蛋白水解肽具有促進睡眠的特性，增強戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠。它還能促進慢波（δ）腦電圖大鼠活動；指示睡眠或放松的模式。通過實驗證明其促進睡眠的作用可能是通過介導的GABAA（γ-氨基丁酸A 型）受體-氯離子通道產(chǎn)生效果。有研究表明α酪蛋白能減輕貓的焦慮癥狀[5]。

DL-4-氯苯基丙氨酸（PCPA）是色氨酸羥化酶(TDH)的抑制劑，TDH 是5-HT（五羥色胺）合成的限速酶，PCPA 致失眠大鼠模型復(fù)制成功后失眠大鼠腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 顯著下降從而導致大鼠晝夜節(jié)律消失，導致大鼠失眠。酸棗仁與百合是兩種具有鎮(zhèn)靜催眠作用的藥食同源食材，常與其他有助眠作用的植物復(fù)配使用[7]。研究證實酸棗仁提取物能減少小鼠自主活動次數(shù)，對中樞神經(jīng)有抑制作用[8]，可提高小鼠神經(jīng)中樞神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 含量，更有研究認為酸棗仁提取物作用于GABA 系統(tǒng)[7]；有研究表明百合提取物對5-HT 通路起作用，對戊巴比妥鈉誘導的睡眠時間有延長作用[9,10]。

本實驗室在前期研究中已經(jīng)通過電生理膜片鉗技術(shù)對牛乳酪蛋白酶解物進行活性鑒定，判定牛乳睡眠肽抑制大鼠下丘腦VLPO區(qū)（視前腹外側(cè)核）神經(jīng)細胞自發(fā)放電的體外活性；將分離出的牛乳促睡眠肽通過協(xié)同戊巴比妥鈉實驗判定了牛乳促睡眠肽有協(xié)同戊巴比妥鈉促睡眠的效果，驗證了牛乳促睡眠肽大鼠體內(nèi)的促睡眠活性[4-6]。

本研究通過復(fù)制PCPA 致大鼠失眠模型探究復(fù)合物對失眠大鼠睡眠的改善作用。復(fù)合物由牛乳促睡眠肽、酸棗仁提取物、百合提取物按照一定比例復(fù)配而成。經(jīng)曠場實驗探究復(fù)合物對失眠大鼠行為學影響，探討復(fù)合物對失眠大鼠睡眠的改善作用；通過檢測下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物變化探究復(fù)合物對失眠大鼠睡眠的調(diào)控機制。為牛乳促睡眠肽的助眠效果、抑制焦慮作用提供依據(jù)；同時將古方酸棗仁、百合這兩種藥食同源物與促睡眠肽結(jié)合，通過多個神經(jīng)遞質(zhì)通路聯(lián)合改善失眠大鼠睡眠。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

1.1.1 實驗材料

原料：酶解牛乳多肽由廣州綠萃生物科技有限公司提供。

實驗動物：32 只體重約為150～200 g 健康的雄性成年SPF 級SD 大鼠，購自南方醫(yī)科大學，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2016-0041?；A(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，按體重平均隨機分成4 組（n=8）。試驗期間，每天早上9:00 觀察動物皮毛色澤、行為活動等情況，每天測量體重、攝食量各1 次。實驗期間，各組動物單籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度22±2℃，濕度50%± 10%，飼養(yǎng)環(huán)境實行12 h 光照、12 h 黑暗自動控制，期間動物自由攝食飲水。

主要試劑：乙腈（質(zhì)譜級）、甲醇（質(zhì)譜級）、甲酸（質(zhì)譜級），美國Fisher 公司；γ-氨基丁酸（GABA）標準品、5-羥色胺酸（5-HT）標準品、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）標準品、L-去甲腎上腺素（NE）標準品、多巴胺鹽酸鹽（DA）標準品、二羥苯乙酸（DOPAC）標準品，源葉生物；對氯苯丙氨酸（PCPA）標準品，美國Sigma 公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

AB SCIEX 4500 三重四極桿質(zhì)譜儀，美國SCIEX公司；LC-30A 液相色譜，日本島津公司；SMART v3.0.05 動物行為學視頻采集與分析系統(tǒng)，美國Panlab Harvard Apparatus 公司；Centrifuge 5415R 高速冷凍離心機，德國Eppendorf 公司；XW-80A 漩渦混合器，上海精科實業(yè)有限公司，DW-86L388 立式超低溫保存箱；青島海爾特種電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 低溫連續(xù)相變萃取促睡眠活性物

低溫連續(xù)相變萃取酸棗仁促睡眠活性物：將酸棗仁清理除雜后粉碎，把粉碎過20 目篩后的酸棗仁裝進連續(xù)相變萃取裝置的50 L 萃取釜中。參考前期研究的結(jié)果，在原料堆密度0.39 kg/L、萃取溫度70℃、萃取壓力0.7 MPa、75 L/h 流速、萃取時間3 h 的條件下進行低溫連續(xù)相變用70%乙醇萃取一次；萃取溫度70℃、萃取壓力0.2 MPa、75 L/h 流速、萃取時間3 h的條件下用三級水進行低溫連續(xù)相變萃取第二次[9,10]。

將提取液在60℃條件下減壓濃縮至固形物含量為30%，利用噴霧干燥技術(shù)干燥濃縮液得到酸棗仁提取物。噴霧干燥參數(shù)：進風溫度150℃，出風溫度90℃，轉(zhuǎn)速12000 r/min，進料速度3 L/h。

低溫連續(xù)相變萃取百合促睡眠活性物：將百合清理除雜后粉碎，將粉過10 目篩。因百合原料較硬，提取前需先用70%乙醇浸泡12 h 至原料變軟后再提取。將百合原料及浸泡液裝進連續(xù)相變萃取裝置的50 L萃取釜中，參考前期研究結(jié)果，在原料堆密度0.40 kg/L、萃取溫度70℃、萃取壓力0.2 MPa、75 L/h 流速、萃取時間3 h 的條件下進行低溫連續(xù)相變用70%乙醇萃取一次；萃取溫度70℃、萃取壓力0.2 MPa、100 L/h 流速、萃取時間3 h 的條件下用三級水進行低溫連續(xù)相變萃取第二次[10]。

將提取液在60℃條件下減壓濃縮至固形物含量為30%，利用噴霧干燥技術(shù)干燥濃縮液得到百合提取物。噴霧干燥參數(shù)：進風溫度150℃，出風溫度90℃，轉(zhuǎn)速12000 r/min，進料速度3 L/h。

1.2.2 構(gòu)建PCPA 致大鼠失眠模型

大鼠適應(yīng)7 d 后除正常對照組外，其余各組大鼠每日上午8:00～8:30 腹腔注射PCPA 300 mg/kg，灌胃量為10 mL/kg，每日灌胃1 次，連續(xù)注射2 d，正常對照組腹腔注射與PCPA同體積的弱堿性0.9%氯化鈉注射液。

1.2.3 給藥方法

大鼠失眠模型復(fù)制成功后，給藥組每天上午8:00給予樣品灌胃，將酸棗仁提取物、百合提取物、睡眠肽（2:2:1）復(fù)配成復(fù)合物給藥劑量為600 mg/kg·d；地西泮對照組給藥劑量為3 mg/kg·d。連續(xù)給藥7 d，最后一次（給藥第7 d）給藥前禁食12 h。最后一次給藥后觀察自主活動，于灌胃后60 min 用10%水合氯醛0.3 g/kg 劑量進行腹腔注射后取大鼠腦用以檢測。

1.2.4 大鼠行為學實驗

本研究用曠場實驗來評價大鼠在新環(huán)境中的焦慮度、自主及探究行為。通過以大鼠在曠場中某些行為發(fā)生的次數(shù)以及持續(xù)的時間來反應(yīng)檢測指標。曠場反應(yīng)箱高50 cm，底邊長50 cm，將曠場內(nèi)部區(qū)域設(shè)為4×4的方格，中間4 格聯(lián)合為中央?yún)^(qū)域，外周方格聯(lián)合為周邊區(qū)域。將曠場擺放在白熾燈正下方，調(diào)整相機位置于曠場正上方。曠場實驗于安靜的環(huán)境下進行。實驗人員將動物由統(tǒng)一角度放入箱內(nèi)底面中心后進行攝像和計時。通過攝像頭自發(fā)記錄大鼠活動情況。每只大鼠測試10 min，測試后清潔曠場擦拭、清洗方箱內(nèi)壁及底面防止留下氣味及排泄物等。

測試指標包括：大鼠曠場運動總路程、大鼠曠場中央停留次數(shù)、中央停留時間等[11-15]。

1.2.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定神經(jīng)遞質(zhì)

動物樣品前處理：在低溫手術(shù)臺上取大鼠下丘腦部位，置于5 mL 離心管中按每20 mg 腦400 μL 組織裂解液的比例加入組織裂解液，于冷凍珠磨機內(nèi)勻漿，放于-20℃冰箱中孵育20 min，冷凍離心20 min（13200 r/min，4℃），用0.22 μm 濾膜過濾，供分析。

試劑配制：腦組織裂解液：甲醇:乙腈:甲酸為1:9:0.02。

色譜條件：色譜柱為上海月旭welch ultimate C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相：0.1%甲酸水（A）和乙腈（B）。

梯度洗脫程序：流速0.5 mL/min，柱溫30℃，進樣量20 μL。2% B 0.1～2.5 min；2% B～30% B 2.5～8 min。

質(zhì)譜條件[16-21]氣簾氣（CUR）壓力：40.0 psi；碰撞氣體：N2；噴霧電壓：5500 V；離子源溫度：500℃；GS1：50 psi，GS2：50 psi；氣體流速：12 L/min。

1.3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 21.0 軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用平均值±方差（）表示，p<0.05 則有統(tǒng)計學意義，說明有顯著性差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠行為學的影響

2.1.1 復(fù)合物對大鼠運動軌跡的影響

圖1、圖2 為空白組大鼠、失眠模型組大鼠、復(fù)合物與陽性對照組的大鼠2D 及3D 運動軌跡圖，由圖1 可知，失眠模型組大鼠較空白組大鼠在曠場中的運動更頻繁，運動軌跡更密集，說明失眠大鼠在曠場焦慮感上升。失眠大鼠在經(jīng)過復(fù)合物及陽性藥物干預(yù)之后，運動軌跡相對失眠模型組稀疏，說明其在曠場中的焦慮感明顯減少。

圖1 大鼠運動軌跡2D 圖 Fig.1 Plan of rat trajectory

圖2 大鼠運動軌跡3D 圖 Fig.2 3D map of rat trajectory

2.1.2 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠曠場指標的影響

由表1，失眠模型組大鼠在中央停留次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間、運動總路程分別為18.67、37.88 s、5013.24 cm，與空白組有顯著差異（p<0.05），失眠模型組大鼠總靜止時間222.68 s 與空白組的145.05 s 無顯著差異（p>0.05），以上指標在一定的程度上反映了失眠模型大鼠在曠場中比較緊張、活動增加。復(fù)合物組大鼠在中央停留次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間、運動總路程分別為11.00、15.01 s、3309.71 cm，與失眠模型組相比有顯著差異（p<0.05），與空白組相比無顯著差異（p>0.05）。陽性藥物組與失眠模型組大鼠在曠場中央停留次數(shù)有顯著差異（p<0.05），該結(jié)果提示，復(fù)合物能改善失眠大鼠在曠場中央停留次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間、運動總路程，復(fù)合物與陽性藥物均能改善大鼠因失眠導致的在曠場中的焦慮狀況。

表1 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠曠場運動影響 Table 1 Effect of compound on open field exercise of insomnia rats

2.2 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)的影響

2.2.1 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)的影響

PCPA 是色氨酸羥化酶（TDH）的抑制劑，通過阻斷5-HT 合成，導致大鼠腦內(nèi)5-HT 含量降低，從而晝夜節(jié)律消失。由表2 結(jié)果可知，與空白組相比失眠模型組大鼠下丘腦中5-HT 含量顯著降低（p<0.05）提示PCPA 致大鼠失眠模型復(fù)制成功。失眠模型組大鼠與復(fù)合物組大鼠5-HT 無顯著差異（p>0.05），空白組與復(fù)合物組5-HT 無顯著差異（p>0.05）。

表2 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)的影響 Table 2 Effect of compound on neurotransmitters in hypothalamus of insomnia rats

失眠大鼠GABA、Glu、Gly、NE、DA、5-HT 含量為78.54 μg/mL、1514.56 μg/L、68.95 μg/L、53.94 μg/L、2.18 μg/L、1.42 μg/L；失眠模型組神經(jīng)遞質(zhì)GABA 含量顯著下降（p<0.05）、DA 的含量均顯著上升（p<0.05），Glu、Gly 無顯著變化（p>0.05），興奮性神經(jīng)遞質(zhì)NE 顯著上升（p<0.05）。給予灌胃給樣一周后，復(fù)合物組GABA、Glu、Gly、NE、DA、5-HT含量為94.96 μg/mL、1508.42 μg/L、74.59 μg/L、37.36 μg/L、1.76 μg/L、1.61 μg/L。復(fù)合物組與陽性對照組，與失眠模型組相比大鼠下丘腦抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA含量顯著上升（p<0.05），興奮性神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA含量顯著下降（p<0.05）；表明復(fù)合物組可通過調(diào)節(jié)大鼠下丘腦中的神經(jīng)遞質(zhì)，從而達到鎮(zhèn)靜催眠的效果。

2.2.2 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝產(chǎn)物的影響

2.2.2.1 復(fù)合物對PCPA致失眠大鼠下丘腦中5-HT 及其代謝產(chǎn)物5-HIAA 的影響

由表3 結(jié)果可知，失眠模型組大鼠下丘腦中5-HIAA 含量14.13 μg/L，與空白組相比顯著降低（p<0.05）；與復(fù)合物組大鼠無顯著差異（p>0.05），空白組5-HIAA 含量28.69 μg/L，與復(fù)合物組、牛乳睡眠肽組、陽性藥物組相比，5-HIAA 含量顯著降低，有顯著差異（p<0.05）。

由表3 空白組5-HIAA/5-HT 為13.06，與其他各組5-HIAA/5-HT 都有顯著差異（p<0.05）；復(fù)合物組5-HIAA、5-HT 含量分別為11.85 μg/L、1.42 μg/L，5-HT與空白組無顯著差異（p>0.05）；5-HIAA 與空白組相比顯著下降（p<0.05）。說明復(fù)合物影響了5-HT 及其代謝產(chǎn)物從而改善睡眠。

表3 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠下丘腦中5-HT、5-HIAA 的影響 Table 3 Effect of complex on 5-HT and 5-HIAA in hypothalamus of insomnia rats

2.2.2.2 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠下丘腦中GABA及其代謝產(chǎn)物的影響

表4 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠下丘腦中GABA、Glu 的影響 Table 4 Effects of compound on GABA and Glu in hypothalamus of insomnia rats

Glu 脫羧后的代謝產(chǎn)物為GABA，GABA 被認為在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是一種重要的抑制性遞質(zhì)；而Glu則是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。大鼠被剝奪睡眠后，失眠模型組GABA、Glu 含量分別為78.54 μg/mL、1514.56 μg/L。Glu 在失眠模型組與空白組中相差無顯著性（p>0.05），GABA 在失眠模型組與空白組中有顯著性（p<0.05），給予陽性藥物及復(fù)合物后GABA 含量在各樣品組中均上升。復(fù)合物組GABA、Glu 含量分別為94.96 μg/mL、1508.42 μg/L；陽性藥物組GABA、Glu含量、Glu/GABA 值分別為101.75 μg/mL、1448.69 μg/L、1.45，復(fù)合物組Glu/GABA 比值在與模型組、空白組比值無顯著差異（p>0.05）。陽性對照組Glu/GABA值相比失眠模型組有顯著變化（p<0.05），說明陽性藥物對GABA 及其代謝速率有影響，復(fù)合物能影響大鼠下丘腦內(nèi)GABA，但對其代謝無顯著影響。

2.2.2.3 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠下丘腦中DA 及其代謝產(chǎn)物DOPAC 的影響

DA 的代謝產(chǎn)物為DOPAC。由表5 可知，失眠模型組DA、DOPAC、DAPOC/DA 分別為2.18 μg/L、66.96 μg/L、31.79；與空白組相比，失眠模型組大鼠下丘腦中DOPAC 含量降低，不具有顯著性差異（p>0.05）。復(fù)合物組DA、DOPAC、DAPOC/DA 分別為1.76 μg/L、75.71 μg/L、41.78；空白組與復(fù)合物組相比，下丘腦中DOPAC 含量無顯著差異（p>0.05）。陽性藥物組DOPAC 含量相對于空白組降低（p<0.05）。提示復(fù)合物能降低DA 含量，但對其代謝速率無顯著影響（p>0.05）。

表5 復(fù)合物對PCPA 致失眠大鼠下丘腦中DA、DOPAC 的影響 Table 5 Effect of compound on DA and DOPAC in hypothalamus of insomnia rats

3 結(jié)論

3.1 動物的行為學及腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量在一定程度上反映了其生理狀況，這也是改善失眠實驗研究的主要入手方向，通過腹腔注射PCPA 復(fù)制失眠模型，腹腔注射PCPA 48 h 后，大鼠開始暴躁不安、體重減輕、白天也活動不停且具有攻擊性由此判定模型復(fù)制成功[22]。

3.2 在酸棗仁百合睡眠肽復(fù)合物的干預(yù)下，失眠大鼠在曠場中的中央停留次數(shù)、中央?yún)^(qū)停留時間、運動總路程降低，差異具有統(tǒng)計學意義（p<0.05），說明復(fù)合物可以減輕失眠大鼠在曠場中的焦慮感。在復(fù)合物干預(yù)大鼠下丘腦中5-HT 分別升高，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)DA、NE，抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA 含量升高（p<0.05），DA、GABA 代謝速率無顯著變化（p>0.05），5-HT 代謝產(chǎn)物5-HIAA 代謝途徑速率加快（p<0.05），說明復(fù)合方能通過影響大鼠下丘腦中神經(jīng)遞質(zhì)改善失眠大鼠的睡眠及焦慮。酸棗仁與百合為傳統(tǒng)治療失眠的藥食同源物質(zhì)，其有效促眠活性物質(zhì)為酸棗仁皂苷、百合皂苷等物質(zhì)，且其助眠機制與主要助眠活性成份為近期研究熱點。本研究將酸棗仁、百合促睡眠活性物與睡眠肽復(fù)配成復(fù)合物。結(jié)果表明酸棗仁百合復(fù)合物能改善失眠大鼠行為學與神經(jīng)遞質(zhì)，復(fù)合物對下丘腦神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用可能是其改善睡眠的作用機制。綜上所述，復(fù)合物能有效改善失眠大鼠睡眠并為促睡眠肽改善睡眠提供了理論依據(jù)。