莫日根，杜艷，呂娟，王寧，朱葉青

（呼和浩特市食品檢驗(yàn)所，呼和浩特 010090）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是僅次于小麥、稻谷和玉米的全球第四大重要的糧食作物［1］，與小麥、稻谷、玉米、高粱并稱為世界五大作物。中國主要薯類作物年種植占全國可用耕地8%左右，其中，馬鈴薯和甘薯的種植面積和總產(chǎn)量均居世界第一位［2］。馬鈴薯含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、膳食纖維、礦物質(zhì)元素和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)。馬鈴薯中的蛋白質(zhì)除了由非必需氨基酸構(gòu)成外，也含有大量的必需氨基酸。必需氨基酸指人體不能自己合成，需要從食物中獲取的氨基酸，共有8 種：賴氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。必需氨基酸攝入不足會(huì)影響機(jī)體的生理機(jī)能，造成代謝紊亂、機(jī)體抵抗力下降等［3］。世界衛(wèi)生組織（WHO）把氨基酸列為人體必須的營養(yǎng)素之一。2015 年1 月，在北京舉辦的馬鈴薯主糧化發(fā)展戰(zhàn)略研討會(huì)，以馬鈴薯主糧化與國家糧食安全為主題，深入研討了馬鈴薯主糧化的戰(zhàn)略意義、發(fā)展思路、目標(biāo)任務(wù)和推進(jìn)途徑，突顯出馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的新機(jī)遇［4］，因此針對馬鈴薯中的必需氨基酸進(jìn)行檢測分析，對于優(yōu)選馬鈴薯品種具有重要意義。

目前，馬鈴薯中氨基酸的研究已有報(bào)道，趙鳳敏等［5］對不同品種的馬鈴薯進(jìn)行了氨基酸營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)，并篩選出6 種氨基酸營養(yǎng)價(jià)值較高的品種；曾凡逵等［6］研究了馬鈴薯淀粉加工過程中，分離汁水回收的蛋白質(zhì)氨基酸的組成，并對其進(jìn)行了分析，必需氨基酸占總氨基酸的40.80%；黃闖等［7］研究了馬鈴薯蛋白水解液的氨基酸組成和含量，結(jié)果表明氨基酸組成比較平衡。雖然以上研究在馬鈴薯氨基酸分析檢測方面做出一定成果，但均采用了氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行分析。在氨基酸分析方面，也有研究者采用柱前衍生-高效液相色譜法進(jìn)行分析，如測定靈芝孢子粉［8］、新鮮煙葉［9］、野芭蕉［10］、保健食品［11］等物質(zhì)中氨基酸的含量。除此之外，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法近年來發(fā)展迅速，在醫(yī)學(xué)、食品、藥品等方面被廣泛應(yīng)用，并且作為一種優(yōu)秀的分析技術(shù)被應(yīng)用于測定不同物質(zhì)中的氨基酸成分，如測定天南星［12］、橄欖果實(shí)［13］、植物酵素［14］、茶葉［15］等物質(zhì)中氨基酸含量。相比較氨基酸自動(dòng)分析和柱前衍生-高效液相色譜法，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高靈敏度、反應(yīng)條件簡單、節(jié)約操作時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)。

目前，在采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定馬鈴薯中氨基酸含量方面的研究仍屬空白，因此筆者建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定馬鈴薯中纈氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸8 種必需氨基酸的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

超高效液相色譜儀：Ultimate 3000 型，美國賽默飛世爾科技公司。

三重四級桿質(zhì)譜儀：TSQ Endura 型，配備電噴霧離子源（ESI），美國賽默飛世爾科技公司。

高速冷凍離心機(jī)：5430 R 型，德國艾本德股份公司。

超聲波振蕩器：FB 15065 型，美國賽默飛世爾科技公司。

渦旋混合器：Multi Reax 多通道型，德國海道爾夫公司。

圓周振蕩器：MS 3 digital 型，德國艾卡公司。

電子天平：ME 204E 型，萬分之一，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

刀式混合研磨儀：Grindomix GM 200 型，德國萊馳公司。

均質(zhì)機(jī)：T18 digital 型，德國艾卡公司。

超純水機(jī)：Milli-Q 型，美國默克公司。

17 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、脯氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、賴氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸的質(zhì)量濃度均為2.50 μmol／mL，日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。

色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品：純度為99.9%，中國食品藥品檢定研究院。

甲醇：色譜純，德國CNW 公司。

甲酸：色譜純，天津市福晨化學(xué)試劑廠。

馬鈴薯樣品：品種分別為福瑞特、226、黑心一號和青九，分別采自烏蘭忽洞村、吉恒太村、紅崖灣和新民村。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Accucore HILIC 柱（150 mm×2.1 mm，2.6 μm，美國Thermo Fisher 公司）；保護(hù)柱：AJO-4287 C18柱（4 mm×3 mm，美國Phenomenex 公司）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣室溫度：10 ℃；流動(dòng)相：含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的55%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇水溶液；等度洗脫；流量：0.20 mL／min；進(jìn)樣體積：2 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離（ESI）源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；離子源溫度：350 ℃；離子傳輸管溫度：350 ℃；離子噴霧電壓：4 500 V；鞘氣流量：8.0 L／min；輔助氣流量：3.0 L／min；碰撞氣：氬氣；8 種必需氨基酸的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 8 種必需氨基酸的MRM 質(zhì)譜參數(shù)

1.3 溶液配制

1.3.1 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL 容量瓶中，加入0.1 mol／L 鹽酸溶液溶解并定容至標(biāo)線，上下顛倒混勻，制得質(zhì)量濃度為2.50 μmol／mL 的色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.3.2 氨基酸系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

吸取17 種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液150 μL，再吸取1.3.1 中色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液150 μL，用超純水定容至10 mL，得到質(zhì)量濃度均為37.5 μmol／L 的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，再根據(jù)需要，采用超純水配制成纈氨酸、蘇氨酸、亮／異亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸的質(zhì)量濃度均分別為0.2、0.9、1.9、2.8、3.8、4.7、5.7 μmol／L，色氨酸質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、0.7、0.9、1.4、1.9 μmol／L，賴氨酸質(zhì)量濃度分別為0.9、2.4、3.8、5.2、6.6、8.0、9.4 μmol／L 的氨基酸系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品處理

馬鈴薯洗凈切塊，研磨并勻漿，精密稱取1 g（精確至0.000 1 g）混合均勻的樣品，置于50 mL 離心管中，加入25 mL 超純水，渦旋，振蕩，混合，超聲提取10 min，以10 000 r／min 速率于4 ℃條件下離心10 min，吸取上清液200 μL，用水定容至10 mL，上下顛倒，搖勻，溶液過0.22 μm 微孔濾膜，注入液相色譜質(zhì)譜儀，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 色譜柱

親水作用色譜（HILIC）在針對強(qiáng)極性及強(qiáng)親水性化合物的保留方面具有優(yōu)勢，可以較好地分離氨基酸等具有生物活性的極性物質(zhì)。經(jīng)過對多個(gè)色譜參數(shù)的優(yōu)化，HILIC 色譜柱分離必需氨基酸的效果要優(yōu)于C18柱，且降低了基質(zhì)效應(yīng)的影響，峰形得到優(yōu)化，拖尾現(xiàn)象明顯減少，因此最終選擇Accucore HILIC 色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相

甲酸和高比例水相均可提高離子化率，通過對比發(fā)現(xiàn)等度洗脫與梯度洗脫無明顯差異，所以采用含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的55%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇水溶液進(jìn)行等度洗脫。

2.2 質(zhì)譜條件優(yōu)化

采用蠕動(dòng)針泵，以10 μL／min 的流量，依次將1 μg／mL 單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液與流量為200 μL／min的流動(dòng)相通過三通接頭混合后，直接注入質(zhì)譜儀，在質(zhì)荷比m／z為100～500 掃描范圍內(nèi)，以ESI+模式，進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描，調(diào)節(jié)離子源溫度、噴霧電壓、離子傳輸管溫度和氣體流量等質(zhì)譜參數(shù)，確定8 種必需氨基酸的母離子。結(jié)果表明，8 種必需氨基酸的母離子均為［M+H］+峰。確定母離子后，分別對其進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，選擇合適的轟擊能量，確定定量離子和定性離子。優(yōu)化后8 種必需氨基酸的MRM質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 樣品前處理方法優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑的選擇

在樣品中分別加入0.01 mol／L 鹽酸（pH=2）、60%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液、含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸的25%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇溶液和超純水，再經(jīng)過1.3樣品處理步驟進(jìn)行提取，檢測后發(fā)現(xiàn)超純水的提取效率更高，因此選用超純水為提取液。

2.3.2 稱樣質(zhì)量的選擇

分別測試了0.2 g、0.5 g 和1 g 3 種取樣量，由于馬鈴薯中氨基酸含量較大，為避免取樣量過小而導(dǎo)致誤差增大，所以最終確定取樣量為1 g，然后增大稀釋倍數(shù)。

2.4 線性方程和檢出限

將1.3.2 中8 種必需氨基酸的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按照1.2 色譜及質(zhì)譜工作條件進(jìn)行測定，以各物質(zhì)的峰面積為縱坐標(biāo)（y）、8 種必需氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。當(dāng)取樣量為1 g 時(shí)，以信噪比分別為3 和10 時(shí)的進(jìn)樣濃度為方法的檢出限和定量限。8 種必需氨基酸的線性范圍、線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和定量限見表2。由表2 可知，8 種必需氨基酸在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 0～0.999 6，檢出限為0.04～1.50 mg／kg，定量限為0.12～4.99 mg／kg，表明該方法具有較高的靈敏度。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5 精密度與加標(biāo)回收試驗(yàn)

按照1.3 方法對樣品進(jìn)行處理，在1.2 儀器工作條件下測定馬鈴薯樣品中8 種必需氨基酸的含量，作為本底值。再精密稱取已處理好的馬鈴薯樣品18 份，分別進(jìn)行3 個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，在1.2 儀器工作條件下，對每個(gè)水平進(jìn)行6 次平行測定，8 種必需氨基酸的精密度與加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3 可知，8 種必需氨基酸的平均加標(biāo)回收率為89.9%～115.1%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～4.6%，表明該方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度，滿足分析要求。

表3 8 種必需氨基酸的精密度與加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.6 實(shí)際樣品測定

選取4種不同品種及產(chǎn)地的馬鈴薯，按照1.3方法進(jìn)行樣品處理與制備，在1.2 儀器工作條件下進(jìn)行測定，馬鈴薯樣品中8 種必需氨基酸試驗(yàn)結(jié)果如表4 所示。由表4 可知，不同產(chǎn)地的4 種馬鈴薯均含有豐富的必需氨基酸，其中，賴氨酸的含量高于其它幾種必需氨基酸，而賴氨酸被譽(yù)為人體第一必需氨基酸，2007 年，WHO／FAO／UNU 專家委員會(huì)確定成人賴氨酸每天需要量為30 mg／kg［16］，食用馬鈴薯可以很好地提高賴氨酸及其它必需氨基酸的攝入量。

表4 馬鈴薯樣品中8 種必需氨基酸試驗(yàn)結(jié)果 g／kg

3 結(jié)語

建立了同時(shí)測定馬鈴薯中8 種必需氨基酸的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法樣品處理簡單、靈敏度高、檢測效率高，有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度，可為其它種類的馬鈴薯及其食品中必需氨基酸的檢測提供參考，并可為馬鈴薯品種育種及優(yōu)選提供重要依據(jù)。