肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)兔皮膚凍傷的治療作用及刺激性研究

崔亞玲，劉小虎，許子華，吳 瓊

0 引 言

凍傷是指機(jī)體受到寒冷刺激而表現(xiàn)出的局部組織病理結(jié)構(gòu)的改變，機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間在低溫環(huán)境中，能夠?qū)е缕つw和肌肉血管極度收縮、血流緩慢、動(dòng)脈搏動(dòng)減弱，進(jìn)而損傷神經(jīng)，出現(xiàn)神經(jīng)紊亂、意識(shí)模糊、周身疼痛，活動(dòng)能力、身體協(xié)調(diào)性下降，出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)的癥狀[1-2]。凍傷是我國(guó)的東北高寒地區(qū)或從事低溫作業(yè)人員的常見急癥，尤其是局部?jī)鰝顬槌Ｒ?，通常在?zhí)行任務(wù)的部隊(duì)中成批發(fā)生，造成非戰(zhàn)斗減員增加，嚴(yán)重削弱部隊(duì)?wèi)?zhàn)斗力。凍傷根據(jù)臨床損傷程度分為Ⅳ度，Ⅰ～Ⅱ度為輕度凍傷，主要損傷皮膚、肌肉，Ⅲ～Ⅳ度為重度凍傷，主要損傷肌肉和骨[3-6]。有研究結(jié)果表明，凍結(jié)性凍傷是一種免疫復(fù)合物相關(guān)性疾病，凍傷導(dǎo)致大量免疫復(fù)合物生成并且沉積于局部血管壁基底膜或組織間隙，通過(guò)激活補(bǔ)體、血小板及其他細(xì)胞，造成沉積部位的一系列炎癥性變化[7]。肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏由肝素鈉和肌醇煙酸酯組成，肝素鈉具有抗凝作用，而肌醇煙酸酯是周圍血管擴(kuò)張劑，兩者配伍聯(lián)合用藥，對(duì)提高機(jī)體冷刺激耐受力具有一定協(xié)同作用。本文對(duì)肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)兔皮膚輕度凍傷的治療作用和刺激性進(jìn)行了研究，以期為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料日本大耳白兔，普通級(jí)，雌雄各半，體重1.5～2.0 kg，由青島康大生物科技有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(魯)20122005。實(shí)驗(yàn)環(huán)境：溫度20～23 ℃，濕度40%～60%，通風(fēng)良好。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理號(hào)：21000092016008。肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏，由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院提供，批號(hào)：201508063，規(guī)格：每支20 g；肝素鈉乳膏，由山東博士化福瑞達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：150624031，規(guī)格：每支20 g；賦型劑，肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏基質(zhì)，由北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院提供，批號(hào)：201508062，規(guī)格：每支20 g。PBY-N6 Compact全自動(dòng)血液流變儀，北京普利生食品有限公司生產(chǎn)。CA1500全自動(dòng)凝血分析儀，SYSMEX生產(chǎn)。XN-1000全自動(dòng)模塊式血液液體分析儀，SYSMEX生產(chǎn)。FLPI2-MOOR激光散斑成像系統(tǒng)，MOOR生產(chǎn)。MOORVMS-OXY激光多普勒血流監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，MOOR生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏治療兔皮膚凍傷選取體重1.5～2.0 kg健康白兔36只，雌雄各半。按照體重排序，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏低、中、高劑量組(0.14 g/kg、0.28 g/kg、0.56 g/kg)，肝素鈉乳膏組(0.14 g/kg)，共6組，每組6只，單籠飼養(yǎng)。

兔皮膚凍傷模型的制備：采用20%烏拉坦麻醉，除空白對(duì)照組外，其余各組白兔剪去背部?jī)蓚?cè)實(shí)驗(yàn)部位被毛，用紗布蘸取10%硫化鈉溶液均勻涂抹于實(shí)驗(yàn)部位，2～3 min后待被毛溶解成糊狀，立即擦去。即刻用溫水徹底洗凈使皮膚裸露，備用。將直徑3 cm的紗布團(tuán)沾滿液氮(成飽和程度)，將其貼緊兔背部實(shí)驗(yàn)部位30 s，造成一個(gè)直徑3 cm的皮膚凍傷模型[8](Ⅰ度凍傷：傷及表皮，皮膚局部紅腫、充血，癥狀在暖和時(shí)緩慢消失，表皮脫落，水腫消退，不留瘢痕)。造模后，造模部位局部有充血、水腫和水皰形成，水皰液為漿液性或淡血性、水皰基底呈鮮紅色且潮濕，皮溫較高，吻合度≥90%即為造模成功。各組白兔于造模后第2天按劑量給藥治療。模型對(duì)照組涂賦型劑，每日1次；肝素鈉乳膏組涂陽(yáng)性對(duì)照藥肝素鈉乳膏，每日1次；低、中、高劑量組每日分別給藥1次、2次、4次，連續(xù)給藥14 d。根據(jù)《中藥外用藥理實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范(草案)》[9]，各組在給藥前以溫等滲鹽水清洗給藥部位，后采取外用棉簽點(diǎn)涂法給藥。造模成功后第15天進(jìn)行病理指標(biāo)、血液指標(biāo)的采樣，采樣前禁食12 h。每天觀察并記錄兔凍傷皮膚的恢復(fù)情況[10-12]。開始給藥后，每天觀察凍傷皮膚的觸感、厚度、結(jié)痂、皺縮變形等情況并做好記錄，根據(jù)局部皮膚表觀情況采取等級(jí)半定量積分法計(jì)算皮損恢復(fù)愈合率。末次給藥后1 h，耳緣靜脈取血，檢測(cè)血常規(guī)、血液生化學(xué)指標(biāo)、凝血酶指標(biāo)等指標(biāo)。

病理學(xué)檢查：用10%甲醛溶液對(duì)凍傷部位組織進(jìn)行固定，石蠟包埋，切片，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理觀察和病理評(píng)分。病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：(1)炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度：①皮下基本正常，記為(-)，記0分；②皮下輕度充血水腫，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，記為(+)，記1分；③皮下中度充血水腫，較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，記為(++)，記2分；④皮下重度充血水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)或有膿腫形成，記為(+++)，記3分。(2)潰瘍程度：①無(wú)潰瘍，記為(-)，記0分；②出現(xiàn)一個(gè)潰瘍，潰瘍面積相對(duì)較小，記為(+)，記1分；③出現(xiàn)一個(gè)潰瘍，潰瘍面積相對(duì)較大，記為(++)，記2分；④出現(xiàn)兩個(gè)以上潰瘍，記為(+++)，記3分。(3)肉芽組織形成：①無(wú)肉芽組織形成，記為(-)，記0分；②肉芽組織面積相對(duì)較小，記為(+)，記1分；③肉芽組織面積相對(duì)適中，記為(++)，記2分；④肉芽組織面積相對(duì)較大，記為(+++)，記3分。

1.2.2 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)兔皮膚刺激性試驗(yàn)研究取白兔24只，雌雄各半，實(shí)驗(yàn)前將兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按照體重排序，按隨機(jī)數(shù)字表法分成正常皮膚肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏低(0.07 g/kg)、中(0.14 g/kg)、高(0.28 g/kg)劑量組和破損皮膚乳膏低(0.07 g/kg)、中(0.14 g/kg)、高(0.28 g/kg)劑量組，共6組，每組4只，雌雄各半。采用賦形劑作對(duì)照，同體左右側(cè)自身對(duì)比法。試驗(yàn)前24 h對(duì)給藥區(qū)(背部)進(jìn)行脫毛處理(范圍左、右各3 cm×3 cm)，如皮膚有損傷則不宜進(jìn)行試驗(yàn)。進(jìn)行破損皮膚試驗(yàn)時(shí)，涂藥部位用針頭劃井字，皮膚破損程度以損傷表皮層為限，左右兩側(cè)皮膚的破損程度應(yīng)基本一致[13]。各組動(dòng)物均在左側(cè)去毛的皮膚上涂抹相應(yīng)劑量的受試藥肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏，右側(cè)涂抹賦形劑做對(duì)照。保持藥物停留時(shí)間4 h。涂藥結(jié)束后用等滲鹽水清潔給藥部位。每次給藥時(shí)間相同，連續(xù)在同一部位涂藥7 d。每天去除藥物后1 h以及次日涂抹前觀察及記錄紅斑及水腫程度，并按皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)打分[13]。同時(shí)觀察涂抹部位是否有色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙等情況及其發(fā)生時(shí)間及消退時(shí)間。末次涂抹后，在去除藥物后24 h、48 h、72 h肉眼觀察并記錄涂抹部位有無(wú)紅斑和水腫等情況。計(jì)算每一觀察時(shí)間點(diǎn)各組積分均值，計(jì)算觀察期限內(nèi)每天每只動(dòng)物刺激積分均值，按皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[13]對(duì)肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏進(jìn)行刺激性評(píng)價(jià)。

2 結(jié) 果

2.1 兔凍傷皮膚外觀凍傷造模后觀察發(fā)現(xiàn)皮膚發(fā)白，隨后慢慢變紅。1 d 后觀察凍傷面出現(xiàn)顏色發(fā)紅、水腫。4～9 d 后模型對(duì)照組顏色無(wú)明顯變化，部分水腫情況加重，肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏各給藥組及肝素鈉乳膏組凍傷面顏色開始變淺，水腫情況改善，創(chuàng)面結(jié)痂，開始出現(xiàn)毛發(fā)生長(zhǎng)現(xiàn)象。14 d 后，肝素鈉乳膏組顏色有所改善，輕微水腫，而肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏各給藥組顏色趨于正常，結(jié)痂逐漸愈合，毛發(fā)生長(zhǎng)趨于正常。見圖1。

圖1 各組凍傷造模兔凍傷皮膚的恢復(fù)情況

對(duì)皮損恢復(fù)愈合率結(jié)果進(jìn)行分析，傷后第7天，低、中、高劑量組和肝素鈉乳膏組皮膚愈合率分別為(35.83±2.08)%、(44.58±8.27)%、(38.42±6.76)%、(32.96±4.00)%。對(duì)傷后第14天結(jié)果觀察，低、中、高劑量組和肝素鈉乳膏組皮膚愈合率分別為(67.45±8.73)%、(65.65±8.18)%、(81.66±3.66)%、(60.05±12.16)%。造模7 d后，肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中劑量組和肝素鈉乳膏組皮膚損愈合率與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；造模14 d后，各給藥組的愈合率與模型對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏有較強(qiáng)的促進(jìn)輕度凍傷兔皮膚創(chuàng)面愈合作用，加速兔皮膚輕度凍傷的治愈。見圖2。

與模型對(duì)照組比較，*P<0.05、**P<0.01圖2 各組兔皮膚愈合率結(jié)果

2.2 血液學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)與分析肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)白兔實(shí)驗(yàn)性凍傷模型血常規(guī)的結(jié)果表明，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞比率、中性粒細(xì)胞比率有明顯改變(P<0.01)；肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中劑量組單核細(xì)胞比率與模型對(duì)照組比較有較明顯改變(P<0.05)；肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏高劑量組與模型對(duì)照組比較嗜酸性粒細(xì)胞比率有明顯改變(P<0.01)。見表1。

表1 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)白兔實(shí)驗(yàn)性凍傷模型血常規(guī)的影響

肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)白兔實(shí)驗(yàn)性凍傷模型血液生化學(xué)指標(biāo)的結(jié)果表明，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，血液生化指標(biāo)全血粘度低切、全血粘度中切、全血粘度高切、紅細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞聚集指數(shù)有明顯改變(P<0.01)；肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏中劑量和高劑量組與模型對(duì)照組比較，可使紅細(xì)胞壓積和紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯升高(P<0.01)。見表2。

表2 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)白兔實(shí)驗(yàn)性凍傷模型血液生化學(xué)指標(biāo)的影響

肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)白兔實(shí)驗(yàn)性凍傷模型凝血酶指標(biāo)的結(jié)果表明，造模14 d后，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，凝血酶時(shí)間有較明顯升高(P<0.05)；凝血酶原時(shí)間和纖維蛋白原與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；其余各劑量組與模型對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)白兔實(shí)驗(yàn)性凍傷模型凝血酶指標(biāo)的影響

2.3 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)白兔實(shí)驗(yàn)性凍傷模型病理指標(biāo)的影響造模14 d后，模型對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度和肉芽組織面積有明顯改變(P<0.01)，潰瘍程度有較明顯改變(P<0.05)，說(shuō)明造模成功。肝素鈉低劑量組潰瘍程度與模型對(duì)照組比較有較明顯改變(P<0.05)，肉芽組織面積與模型對(duì)照組比較有明顯改變(P<0.01)；肝素鈉中劑量組炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度與模型對(duì)照組比較有明顯改變(P<0.01)，潰瘍程度與模型對(duì)照組比較有較明顯改變(P<0.05)。見表4。

表4 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)白兔實(shí)驗(yàn)性凍傷模型病理指標(biāo)的影響

2.4 皮膚刺激性試驗(yàn)結(jié)果兔正常皮膚的刺激性試驗(yàn)結(jié)果顯示，肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏低、中、高劑量及賦形劑多次給藥對(duì)白兔正常皮膚各時(shí)間點(diǎn)均未見局部紅斑、水腫、色素沉著、出血點(diǎn)及皮膚粗糙等情況，表明肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏及賦形劑對(duì)白兔正常皮膚無(wú)刺激作用(0分)。兔破損皮膚的刺激性試驗(yàn)結(jié)果顯示，肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏高劑量多次給藥對(duì)白兔破損皮膚，在給藥第3天起出現(xiàn)紅斑現(xiàn)象，末次涂藥72 h后逐漸恢復(fù)，評(píng)分結(jié)果說(shuō)明高劑量肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏對(duì)白兔破損皮膚有輕度刺激作用(0～2.75分)，而肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏低劑量、中劑量及賦形劑均未發(fā)現(xiàn)對(duì)白兔破損皮膚有刺激作用(0～0.25分)。由此可知，低、中、高劑量肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏多次給藥對(duì)于白兔正常皮膚無(wú)刺激性作用，而對(duì)于白兔破損皮膚，高劑量(0.28 g/kg)有輕度刺激作用。見表5。

表5 肝素鈉肌醇煙酸酯乳膏高劑量給藥后白兔皮膚刺激反應(yīng)評(píng)分(n=4)

3 討 論

凍傷是機(jī)體的一部分組織因寒冷侵襲而出現(xiàn)局部損傷的癥候群。部分組織出現(xiàn)血液循環(huán)障礙，造成皮膚和肌組織的充血、水腫、壞死甚至形成壞疽，從而發(fā)生比較嚴(yán)重的局部或全身?yè)p傷[14]。凍傷分為四個(gè)等級(jí)：Ⅰ度凍傷傷及表皮，皮膚局部紅腫、充血，癥狀在暖和時(shí)緩慢消失，表皮脫落，水腫消退，不留瘢痕。Ⅱ度凍傷傷及真皮，皮膚局部明顯充血、水腫，12～24 h內(nèi)形成水皰，皰液呈血清樣，水皰在2～3周內(nèi)干燥結(jié)疤，以后脫痂愈合，可有輕度瘢痕形成。Ⅲ～Ⅳ度為重度凍傷，主要損傷全層皮膚、皮下組織、肌肉和骨骼[15]。凍傷初期血小板數(shù)增加，聚集率增高，局部組織出現(xiàn)短時(shí)充血，紅腫，血流加速[16]。

肝素鈉能干擾血凝過(guò)程中的許多環(huán)節(jié)，阻止血小板凝集和破壞，妨礙凝血激活酶的形成；阻止凝血酶原變?yōu)槟?；抑制凝血酶，從而妨礙纖維蛋白原變成纖維蛋白。肌醇煙酸酯，是一種溫和的周圍血管擴(kuò)張劑，解除血管痙攣，改善末稍血管循環(huán)，可選擇性地使寒冷刺激的病變部位和敏感部位的血管擴(kuò)張。肝素鈉和肌醇煙酸酯配伍聯(lián)合用藥能夠使白兔凍傷面皮膚顏色趨于正常，毛發(fā)生長(zhǎng)趨于正常，結(jié)痂逐漸愈合，大大提高皮膚愈合率，亦能明顯減輕白兔實(shí)驗(yàn)性凍傷模型的潰瘍程度、肉芽組織面積和炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度。因凍傷的組織血流不暢，肝素鈉長(zhǎng)期或過(guò)量使用會(huì)導(dǎo)致皮膚過(guò)敏、系統(tǒng)性凝血功能降低，反而容易形成血腫、血栓，這可能是抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)局部耗竭所致，兩藥合用，肌醇煙酸酯改善末梢血管循環(huán)機(jī)制，不但增效，還能因血管擴(kuò)張緩解長(zhǎng)期單純使用肝素鈉易導(dǎo)致的局部血腫血栓形成和皮膚刺激，有效降低系統(tǒng)性凝血功能低下的副作用，兩者合用具有相輔相成的效果，但對(duì)于白兔破損皮膚，高劑量(0.28 g/kg)用藥有輕度的刺激作用，故用藥時(shí)應(yīng)酌情控制用量。