紅掌松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

許丁帆，劉艷軍，邊一迪，董洪雨

紅掌松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

許丁帆，劉艷軍通信作者，邊一迪，董洪雨

（天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300392）

為獲得紅掌松散型胚性愈傷組織，采用不同紅掌外植體、不同激素處理組合及MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽倍數(shù)進(jìn)行紅掌胚性愈傷組織的誘導(dǎo)。結(jié)果顯示：紅掌葉片為愈傷組織誘導(dǎo)最適外植體，可在1/2MS＋2.0mg/L2,4-D＋0.2mg/LNAA的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出紅掌松散型愈傷組織；將松散型愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS＋1.0mg/LBA＋1.0mg/L2,4-D培養(yǎng)基上，每15 d繼代培養(yǎng)1次，繼代培養(yǎng)2～3次后可獲得紅掌松散型胚性愈傷組織，并可直接在MS培養(yǎng)基上再生。試驗(yàn)建立了紅掌松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系，可為紅掌組培快繁和離體誘變研究奠定一定基礎(chǔ)。

紅掌；胚性愈傷組織；外植體；激素；無機(jī)鹽

紅掌（），天南星科花燭屬多年生附生性草本花卉，是名貴的盆切兩用花，又名花燭、紅鶴芋、安祖花等，是當(dāng)前世界第二大熱帶花卉品種[1-3]。紅掌花型優(yōu)美，具有較高的觀賞價(jià)值，且空氣凈化能力強(qiáng)，當(dāng)前市場需求量大，產(chǎn)業(yè)價(jià)值高[4]。我國是世界紅掌主要生產(chǎn)基地和消費(fèi)市場之一。20世紀(jì)以來，我國紅掌育種研究陸續(xù)開展，但僅部分自主品種在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用[5]。與荷蘭等歐洲國家相比，我國紅掌品種少、品質(zhì)差且生產(chǎn)成本高[6-7]。目前，國內(nèi)紅掌優(yōu)質(zhì)種苗及新品種主要依賴進(jìn)口，紅掌產(chǎn)業(yè)發(fā)展受到一定程度的限制。新品種選育是我國紅掌產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展的動(dòng)力與基礎(chǔ)，對提高我國紅掌經(jīng)濟(jì)效益和國際競爭力具有重要意義。國內(nèi)紅掌新品種選育主要采用雜交育種等常規(guī)育種手段，但由于國內(nèi)紅掌種質(zhì)資源缺少、重要性狀遺傳規(guī)律不明等原因，效率低、耗時(shí)長、成本高[8]。

近年來，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，細(xì)胞工程育種在紅掌種質(zhì)資源創(chuàng)新方面發(fā)揮了重要作用，如在紅掌誘變育種、倍性育種、轉(zhuǎn)基因育種等方面已有不少研究，并培育出不少的育種材料及新品種[9]。利用松散型胚性愈傷組織進(jìn)行體細(xì)胞離體誘變是培育植物新品種的有效途徑之一。因此，紅掌胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系的建立是紅掌細(xì)胞工程和基因工程研究的重要基礎(chǔ)工作，對于紅掌組培快繁、離體誘變育種及基因轉(zhuǎn)化等具有重要意義。本試驗(yàn)針對紅掌胚性愈傷組織誘導(dǎo)這一關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，采用紅掌不同外植體、不同培養(yǎng)基進(jìn)行松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，建立紅掌松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系，可為紅掌離體誘變育種、基因轉(zhuǎn)化研究和愈傷組織脫毒培養(yǎng)等奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用紅掌組培苗由天津農(nóng)學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅掌愈傷組織的誘導(dǎo)

選取生長健壯的紅掌組培苗，以葉片、葉柄、莖段外植體，在超凈工作臺(tái)中選取剛展開的葉片，剪去其邊緣及葉柄，葉片剪成約0.5cm2小塊；葉柄約0.5cm；莖段不帶有腋芽，約0.5cm；分別接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS＋2.0mg/L2,4-D＋30g/L蔗糖，培養(yǎng)基pH5.8，瓊脂粉7g/L。試驗(yàn)采用100mL三角瓶為容器，加入40mL培養(yǎng)基。每個(gè)三角瓶中接種外植體8塊，每個(gè)處理重復(fù)5瓶。培養(yǎng)條件為（25±1）℃，連續(xù)光照，光照強(qiáng)度1000lx。每天觀察記錄不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)情況，50d后統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理愈傷組織的生長情況。

1.2.2 紅掌松散型愈傷組織的誘導(dǎo)

上述步驟中不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織類型不同，選擇質(zhì)地較硬的愈傷組織進(jìn)行紅掌松散型愈傷組織的誘導(dǎo)。將愈傷組織分割成0.25mm3左右大小，接種于不同的松散型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基分別為MS；1/2MS；MS＋2.0mg/L2,4-D；1/2MS＋2.0mg/L2,4-D；1/2MS＋2.0mg/L2,4-D＋0.5mg/LBA；1/2MS＋2.0mg/L2,4-D＋1.0mg/LBA；1/2MS＋2.0mg/L2,4-D＋0.2mg/LNAA；1/2MS＋2.0mg/L2,4-D＋1.0mg/LIAA，并依次編號為1～8。所有培養(yǎng)基采用7g/L瓊脂粉固化，添加30g/L蔗糖，調(diào)節(jié)pH為5.8。每個(gè)培養(yǎng)基接種10塊外植體，重復(fù)5次。培養(yǎng)條件為（25±1）℃，連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為2000lx。40d后統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理愈傷組織的生長情況。

1.2.3 紅掌松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)

將獲得的松散型愈傷組織分割為大小約0.25mm3的小塊，接種到不同培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的胚性化誘導(dǎo)。培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度NAA、BA、2,4-D，30g/L蔗糖、7g/L瓊脂，pH5.8。每個(gè)培養(yǎng)基接種8塊外植體，重復(fù)5次。培養(yǎng)條件為（23±1）℃，連續(xù)光照，光照強(qiáng)度為2000lx。每個(gè)處理采用相同的培養(yǎng)基每15d繼代培養(yǎng)一次，并鏡檢觀察愈傷組織胚性化情況，細(xì)胞個(gè)體較小、細(xì)胞質(zhì)濃度大、細(xì)胞核較大的細(xì)胞為胚性愈傷組織，每次繼代培養(yǎng)時(shí)選擇結(jié)構(gòu)松散且?guī)в信咝曰卣鞯挠鷤M織，繼代培養(yǎng)5次，記錄每個(gè)處理愈傷組織生長與胚性化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同紅掌外植體愈傷組織的影響

將紅掌的葉片、葉柄和莖段外植體接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，外植體膨大，具體愈傷組織誘導(dǎo)情況見表1。

表1 紅掌不同外植體對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

由表1可知，不同外植體在相同愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的誘導(dǎo)結(jié)果不同。以紅掌葉片為外植體愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)100.0%，葉柄愈傷組織誘導(dǎo)率次之，莖段最低。從愈傷組織類型看，不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織類型差異較大，葉片誘導(dǎo)的愈傷組織屬于松軟類型，顏色為白色或黃綠色；葉柄和莖段誘導(dǎo)的愈傷組織多為綠色、緊密型愈傷組織。從愈傷組織的生長速度看，以葉柄和莖段為外植體誘導(dǎo)愈傷組織，生長速度慢，約20d后才出現(xiàn)少量綠色愈傷組織，這類愈傷組織初期與外植體的表皮相似，不具備一般愈傷組織薄壁細(xì)胞的特性；以葉片為外植體時(shí)，培養(yǎng)10d后部分外植體上出現(xiàn)愈傷組織，且愈傷組織生長速度快。因此，葉片為誘導(dǎo)紅掌愈傷組織理想外植體。

2.2 激素與MS無機(jī)鹽倍數(shù)對紅掌愈傷組織特性的影響

從表2可以看出，在MS培養(yǎng)基上，愈傷組織生長緩慢，只在原來愈傷組織表面長出少量的綠色愈傷組織，且愈傷組織質(zhì)地較硬，結(jié)構(gòu)緊密；在1/2MS培養(yǎng)基上，愈傷組織生長速度較MS培養(yǎng)基上快且結(jié)構(gòu)略微松散，但生長仍緩慢，仍屬緊密型愈傷組織。在MS和1/2MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L2,4-D，愈傷組織生長速度均顯著增加，尤其在1/2MS＋2.0mg/L2,4-D培養(yǎng)基上愈傷組織生長迅速，但此時(shí)愈傷組織質(zhì)地較軟，結(jié)構(gòu)松散，屬于不可再生的愈傷組織，難以進(jìn)一步形成胚性愈傷組織。為增加愈傷組織硬度，試驗(yàn)在1/2MS＋2.0mg/L2,4-D培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別添加0.5mg/L和1.0mg/LBA后，愈傷組織的質(zhì)地變硬，但愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密、不易分散，不是理想的愈傷組織類型。而在1/2MS＋2.0mg/L2,4-D基礎(chǔ)上添加生長素，愈傷組織結(jié)構(gòu)變松散，具體來看：在1/2MS＋2.0mg/L2,4-D＋1.0mg/LIAA上，愈傷組織結(jié)構(gòu)松散，但質(zhì)地較軟；在1/2MS＋2.0mg/L2,4-D＋0.2mg/LNAA上，愈傷組織質(zhì)地較硬，結(jié)構(gòu)松散，是誘導(dǎo)松散型胚性愈傷組織的理想材料，因此誘導(dǎo)紅掌松散型愈傷組織的理想培養(yǎng)基為1/2MS＋2.0mg/L2,4-D＋0.2mg/LNAA。

表2 激素與MS無機(jī)鹽倍數(shù)對紅掌愈傷組織特性的影響結(jié)果

2.3 紅掌松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)果

將紅掌松散型愈傷組織繼代于1/2MS＋2.0mg/L 2,4-D＋0.2mg/LNAA時(shí)，隨繼代次數(shù)增加，愈傷組織逐漸變軟，最終褐變死亡，鏡檢時(shí)未見胚性細(xì)胞。將獲得的松散型愈傷組織轉(zhuǎn)接到不同的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每隔15d繼代一次，每次繼代時(shí)結(jié)合鏡檢，具體情況見表3。

表3 不同培養(yǎng)基對紅掌愈傷組織胚性化的影響結(jié)果

由表3可知，當(dāng)增加MS培養(yǎng)無機(jī)鹽倍數(shù)后，即在MS＋2.0mg/L 2,4-D＋0.2mg/L NAA上，愈傷組織變軟現(xiàn)象得以改變，但愈傷組織未胚性化，隨著繼代次數(shù)增加，愈傷組織逐漸老化。在0.5mg/L BA或1.0mg/L BA配合2.0mg/L 2,4-D使用的情況下，愈傷組織生長速度較快，且隨著繼代次數(shù)的增加愈傷組織結(jié)構(gòu)與質(zhì)地仍可保持理想狀態(tài)，但始終未見愈傷組織胚性化，這類愈傷組織無法進(jìn)行其他試驗(yàn)。在0.5mg/LBA或1.0mg/LBA配合使用較低濃度2,4-D（1.0mg/L）時(shí)，愈傷組織胚性化情況明顯改變，在MS＋0.5mg/L BA＋1.0mg/L 2,4-D培養(yǎng)基上，愈傷組織部分胚性細(xì)胞，但隨著繼代次數(shù)增加，胚性化愈傷組織未見明顯增多；而在MS＋1.0mg/L BA＋1.0mg/L 2,4-D，第一次繼代時(shí)愈傷組織部分胚性化，第二次繼代培養(yǎng)后愈傷組織全部為胚性細(xì)胞組成，并隨著繼代次數(shù)的增加，這種結(jié)構(gòu)松散型的胚性愈傷組織可以保持。因此，采用MS＋1.0mg/LBA＋1.0mg/L 2,4-D培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)3～5次，每次繼代時(shí)間為15d，即可獲得紅掌穩(wěn)定的松散型胚性愈傷組織培養(yǎng)體系。

3 結(jié)論與討論

3.1 外植體類型對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

外植體類型的選擇是愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵。在本試驗(yàn)中，采用紅掌組培苗的葉片、莖段和葉柄為外植體誘導(dǎo)愈傷組織效果明顯不同，以葉片為外植體誘導(dǎo)愈傷組織效果最佳，具有較高愈傷組織誘導(dǎo)率，這與周麗麗等[10]、劉寶駿等[11]研究結(jié)果一致。而李娜等[12]研究發(fā)現(xiàn)葉柄為外植體誘導(dǎo)愈傷組織效果最好，這可能與以下幾個(gè)方面有關(guān)：第一，外植體中的細(xì)胞類型，不同的細(xì)胞類型誘導(dǎo)愈傷組織的難易程度不同，分生組織細(xì)胞分化能力強(qiáng)，細(xì)胞活躍，在外源激素作用下易轉(zhuǎn)變?yōu)橛鷤M織。第二，外植體的生理狀態(tài)[13]，一般初生的組織細(xì)胞活躍，易形成愈傷組織細(xì)胞。第三，外植體的大小[14]，較大的外植體可能合成內(nèi)源激素的能力較強(qiáng)，能夠抵御外源激素的作用，從而降低了愈傷組織的誘導(dǎo)效率；而過小的外植體易受到外源激素及培養(yǎng)基中化學(xué)物質(zhì)毒害，在未產(chǎn)生愈傷組織之前褐變乃至死亡，適宜的外植體大小是愈傷組織誘導(dǎo)的關(guān)鍵。第四，外植體傷口大小，誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，一定會(huì)造成傷口，尤其是表皮較厚的組織類型，如本試驗(yàn)采用的紅掌組織。要求外植體傷口大小適度，傷口平滑，避免傷口過大或采用鈍器切割，否則會(huì)影響外植體的成活率。此外，在誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)，外植體應(yīng)平置于培養(yǎng)基表面，避免傷口浸沒在培養(yǎng)基中。

3.2 培養(yǎng)基滲透壓對愈傷組織結(jié)構(gòu)類型的影響

愈傷組織結(jié)構(gòu)主要是指愈傷組織細(xì)胞間的聯(lián)系程度，愈傷組織聯(lián)系緊密且不容易分開為緊密型；相反，易分散的愈傷組織為松散型愈傷組織。本試驗(yàn)中誘導(dǎo)紅掌松散型愈傷組織，以1/2MS為基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)的愈傷組織生長速度與松散程度均高于MS為基本培養(yǎng)基，此結(jié)果與張勁松等[15]誘導(dǎo)北細(xì)辛愈傷組織結(jié)果相同。這可能與1/2MS培養(yǎng)基使用了半量無機(jī)鹽有關(guān)，降低了培養(yǎng)基滲透壓從而促進(jìn)愈傷組織快速生長，而生長速度較快的愈傷組織多為松散型愈傷組織，因?yàn)樯L速度快細(xì)胞間聯(lián)系不緊密，從而結(jié)構(gòu)變得松散。

3.3 繼代培養(yǎng)對愈傷組織生長的影響

在愈傷組織培養(yǎng)中，繼代培養(yǎng)可以提高愈傷組織的質(zhì)量，繼代時(shí)間與繼代次數(shù)對愈傷組織生長和質(zhì)量影響較大。李銀鳳等[16]研究認(rèn)為隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織的生長量逐漸增加，成活率也逐漸提高。周嬋[17]認(rèn)為胚性愈傷組織的保存與增殖，需要新鮮養(yǎng)分的供應(yīng)，因此，適時(shí)進(jìn)行繼代培養(yǎng)對胚性愈傷組織的保持起重要作用。本試驗(yàn)中，在誘導(dǎo)紅掌胚性愈傷組織的過程中，每15d繼代一次，隨著繼代次數(shù)的增加，紅掌愈傷組織胚性化程度增加，且經(jīng)過5次繼代仍保持胚性。但有研究表明隨著繼代次數(shù)的增加，胚性愈傷組織的增殖能力和體胚形成能力會(huì)逐漸減弱，紅掌胚性愈傷組織的保持有待進(jìn)一步研究[18-19]。

試驗(yàn)最終獲得紅掌松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)的具體方法為：選取生長健壯的紅掌組培苗葉片，剪去葉片邊緣及葉柄，平置于1/2MS＋2.0mg/L2,4-D＋0.2mg/LNAA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)松散型愈傷組織；然后將松散型愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS＋1.0mg/LBA＋1.0mg/L2,4-D培養(yǎng)基上，每15d繼代培養(yǎng)1次，繼代2～3次后即可獲得紅掌松散型胚性愈傷組織。本試驗(yàn)結(jié)果可用于紅掌組培快繁、離體誘變育種及基因遺傳轉(zhuǎn)化等研究。

[1]楊光穗，冷青云，王呈丹，等.16個(gè)紅掌品種的核型分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2016，37（12）：2283-2287.

[2]李心，楊柳燕，張棟梁，等.低溫脅迫下2個(gè)紅掌新種質(zhì)的耐寒性鑒定[J].分子植物育種，2019，17（16）：5446-5453.

[3]李水根，李秀芬，李記開，等.硝普鈉對紅掌愈傷形成及植株再生的影響[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2019，35（5）：1-5.

[4]楊繼凱，劉翠菊，郭霄，等.不同品種紅掌觀賞特性的比較[J].北方園藝，2018（7）：60-65.

[5]易懋升，謝利，郭和蓉，等.紅掌育種方法研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（4）：157-161.

[6]易雙雙，李崇暉，楊光穗，等.紅掌花色表型分類研 究[J].北方園藝，2018（16）：105-111.

[7]黃靜.9個(gè)紅掌品種在漳州地區(qū)的引種表現(xiàn)[J].長江大學(xué)學(xué)報(bào)（自科版），2018，15（6）：13-14，47.

[8]?？『?，黃少華，冷青云，等.分子標(biāo)記技術(shù)在紅掌研究中的應(yīng)用與展望[J].分子植物育種，2015，13（6）：1424-1432.

[9]韓偉，包英華，于白音.紅掌（）細(xì)胞工程研究進(jìn)展及其在育種上的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2020，18（10）：3311-3322.

[10]周麗麗，王晶，閆俊芳，等.不同外植體對紅掌初代培養(yǎng)及愈傷組織誘導(dǎo)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（28）：13720-13724.

[11]劉寶駿，劉國鋒.安祖花胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生研究[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，2018，26（4）：407-414.

[12]李娜，劉春，張黎.紅掌愈傷組織誘導(dǎo)及再生體系的建立[J].農(nóng)業(yè)科學(xué)研究，2015，36（4）：22-25.

[13]朱向濤，王雁，吳倩，等.江南牡丹莖段愈傷組織誘導(dǎo)與植株再生[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，29（1）：56-62.

[14]劉慧敏，劉艷軍，黃俊軒，等.丹參愈傷組織快速生長培養(yǎng)方法[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，23（7）：14-16.

[15]張勁松，于婷婷，何朋，等.北細(xì)辛愈傷組織誘導(dǎo)及其解剖結(jié)構(gòu)觀察[J].中草藥，2015，46（4）：566-571.

[16]李銀鳳，孫振元，韓蕾，等.草地早熟禾耐鹽愈傷組織篩選的適宜NaCl濃度和繼代次數(shù)研究[J].林業(yè)科學(xué)研究，2008（1）：122-125.

[17]周嬋.香樟胚性愈傷組織誘導(dǎo)、增殖及抗寒性鑒定體系的建立[D].南陽：南陽師范學(xué)院，2019.

[18]白玉娥，曾超，彭鵬，等.沙地云杉胚性愈傷組織誘導(dǎo)[J].分子植物育種，2015，13（6）：1363-1368.

[19]劉寶光，李成浩，張含國.紅皮云杉胚性愈傷組織保持與增殖階段影響因子的篩選與分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，38（7）：56-60.

Induction of loose embryogenic callus from

Xu Dingfan, Liu YanjunCorresponding Author,Bian Yidi,Dong Hongyu

（College of Horticulture and Landscape, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China）

In order to obtain the loose embryogenic callus of,different explants, different hormone treatment combinations and MS medium inorganic salt multiple were used to induce the embryogenic callus of.The results showed that the leaves ofwere the best explants for callus induction, and the loose callus could be induced on the medium of 1/2MS＋2.0 mg/L 2,4-D＋0.2 mg/L NAA, and transferred to MS＋1.0 mg/LBA＋1.0 mg/L 2,4-D medium, subcultured once every 15 days, and subcultured 2-3 times, and then the loose embryogenic callus ofcould be obtained and regenerated directly on MS medium. The induction system of loose embryogenic callus ofwas established in this experiment, which can lay a foundation for the study of tissue culture and in vitro mutagenesis of.

;embryogeniccallus;explant;hormone;inorganicsalt

1008-5394（2021）03-0022-04

10.19640/j.cnki.jtau.2021.03.005

S682.14

A

2020-04-30

魏縣益聚種植園藝設(shè)計(jì)有限公司園藝植物種業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（199A2905H）

許丁帆（1997—），男，碩士在讀，主要從事園藝植物育種研究。E-mail：1424039435@qq.com。

劉艷軍（1970—），男，高級實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要從事園藝植物組織培養(yǎng)和分子育種研究。E-mail：liuyanjun00a@126.com。

責(zé)任編輯：楊霞