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      TG酶與單寧酸對魚明膠凝膠強度的影響

      2021-10-13 07:37:44潘軍輝王維亞劉子樂張鵬
      關(guān)鍵詞:單寧酸水浴明膠

      潘軍輝,王維亞,李 闖,劉子樂,張鵬*

      (1.南昌大學(xué)食品學(xué)院,江西 南昌 330047;2.南昌市食品藥品檢驗所南昌市食品安全檢測與控制重點實驗室,江西 南昌 330012)

      明膠是膠原蛋白部分水解的產(chǎn)物,具有良好的生物可降解性和生物相容性,在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[1]。明膠主要從動物結(jié)締組織的膠原蛋白中提取而來,但由于瘋牛病、口蹄疫的影響,以及豬牛等動物來源明膠的宗教禁忌,傳統(tǒng)動物明膠的應(yīng)用受到了一定的限制。近年來,魚明膠逐漸受到關(guān)注,相對于傳統(tǒng)動物明膠,其來源廣泛、價格便宜,且受眾較多,具有極大的潛力替代現(xiàn)有動物來源明膠[2-6],但由于它的凝膠強度、成膜性、乳化性等功能性性質(zhì)略差[7],在一定程度上限制其規(guī)?;瘧?yīng)用。

      目前主要通過明膠改性來提升明膠性質(zhì),常用的方法有物理法、化學(xué)法、酶法等[8-10]。物理改性是通過物理手段(γ射線、紫外線照射的光化學(xué)交聯(lián)等)改變明膠自身凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),進而改善明膠原有的性能,該過程不需任何添加劑?;瘜W(xué)改性是明膠鏈中的功能基團與小分子化合反應(yīng)或明膠分子基團受到修飾,如利用自由基、離子與其發(fā)生加成或開環(huán)聚合反應(yīng),達到明膠改性的目的,常見的化學(xué)改性劑有醛類、天然酚類等。酶法改性是利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(TG酶)、過氧化酶(POD)、酪氨酸酶等,催化明膠蛋白分子形成分子內(nèi)或分子間交聯(lián)。

      單寧酸是一種常見的多酚,具有良好抗氧化性,也是一種天然的蛋白質(zhì)交聯(lián)劑和化學(xué)改性劑。邵士鳳等[1,11]利用單寧酸對明膠進行改性處理,結(jié)果表明,單寧酸改性能顯著提升明膠強度,降低凝膠的最低成膠濃度。單寧酸(non-oxidized tannic acid)在堿性條件下,其沒食子?;江h(huán)上的羥基被氧化成醌,進而形成氧化型單寧酸(Oxidized tannic acid,OX-TA),見圖1。Anvari[12]等發(fā)現(xiàn)氧化型單寧酸和非氧化型單寧酸處理明膠-阿拉伯樹膠聚集凝膠能在一定程度上改善明膠成膠性能和機械強度。目前單一方法制得的改性明膠對明膠的性質(zhì)改善有限,有時并不能滿足應(yīng)用需求,研究者也傾向于綜合運用多種方法實現(xiàn)明膠的改性[13]。因此,本文擬通過單寧酸和TG酶處理魚明膠,以明膠質(zhì)量的重要指標——凝膠強度為測定對象,驗證單寧酸與TG酶對魚明膠凝膠強度的影響,進而達到增強魚明膠凝膠強度,減少明膠用量,降低魚明膠使用成本,拓展其應(yīng)用范圍的目的。

      圖1 單寧酸的氧化

      1 材料和方法

      1.1 材料和試劑

      魚明膠(食品級)上海鑫汐生物科技有限公司;谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(50 U·g-1)江蘇一鳴生物股份有限公司;單寧酸、冰乙酸、氫氧化鈉均為分析純上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      梅特勒-托利多臺式酸度計(FE28型)梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;質(zhì)構(gòu)儀(TA-XTPlus)超技儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-8型)金壇市城西曉陽電子儀器廠等。

      1.3 實驗方法

      1.3.1 氧化型和非氧化型單寧酸母液的制備[12]

      氧化型單寧酸溶液(新鮮配制):取0.5 g單寧酸加入25 mL蒸餾水中混勻,用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至9.0,40 ℃水浴2 h,用50%冰乙酸回調(diào)至原pH,制成2%(m/V)的氧化型單寧酸母液。

      非氧化型單寧酸溶液(新鮮配制):取0.5 g單寧酸加入25 mL蒸餾水中混勻,制成2%(m/V)的非氧化型單寧酸母液。

      50%冰乙酸溶液:取冰乙酸(C2H4O2)5 mL,加蒸餾水定容至10 mL。

      1 mol·L-1NaOH:取40 g NaOH溶于蒸餾水中,最后定容至1 L。

      1.3.2 單寧酸對魚明膠凝膠強度的影響

      取一定量魚明膠加入42 mL蒸餾水中混勻,60 ℃水浴30 min,調(diào)整最終的明膠濃度分別為2%,4%,6%,8%,10%(m/V)。分別加入氧化型單寧酸和非氧化型單寧酸水溶液(2%,m/V),使其最終體積濃度分別為0.05%,0.1%,0.2%,0.3%,0.5%(V/V),40 ℃水浴2 h。在4 ℃條件下成熟16~18 h,用TA-XTPlus型質(zhì)構(gòu)儀測量明膠的凝膠強度。

      1.3.3 TG酶對不同濃度魚明膠凝膠強度的影響

      取一定量魚明膠加入42 mL蒸餾水中混勻,60 ℃水浴30 min,調(diào)整最終的明膠濃度分別為:2%,4%,6%,8%,10%(m/V)。40 ℃水浴1 h,加入1 U·g-1TG酶,反應(yīng)1 h,共水浴2 h,80 ℃水浴5 min滅活TG酶。在4 ℃條件下成熟16~18 h,用TA-XTPlus型質(zhì)構(gòu)儀測量明膠的凝膠強度。

      1.3.4 TG酶處理時間對魚明膠凝膠強度的影響

      取魚明膠2.52 g加入42 mL水中混勻制成6%(m/V)明膠溶液,60 ℃水浴30 min,加入1 U·g-1明膠質(zhì)量的TG酶,40 ℃水浴,反應(yīng)時間分別為0,15,30,60,90,120 min,40 ℃共水浴2 h,80 ℃水浴5 min使得TG酶失活。在4 ℃條件下成熟16~18 h,用TA-XTPlus型質(zhì)構(gòu)儀測量明膠的凝膠強度。

      1.3.5 TG酶用量對魚明膠凝膠強度的影響

      取魚明膠2.52 g加入42 mL水中混勻制成6%明膠溶液,60 ℃水浴30 min,分別加入0,0.5,1,1.5,2,2.5 U·g-1明膠質(zhì)量的TG酶,40 ℃水浴1 h,加入TG酶反應(yīng)1 h,80 ℃水浴5 min使TG酶失活。冷卻后放入4 ℃層析柜16~18 h,用TA-XTPlus型質(zhì)構(gòu)儀測量明膠凝膠強度。

      1.3.6 TG酶和單寧酸共同改性對魚明膠凝膠強度的影響

      取2.52 g魚明膠加入42 mL水中混勻制成6%明膠溶液,60 ℃水浴30 min,分別加入氧化型單寧酸和非氧化型單寧酸母液(2%,m/V),至其終體積濃度分別為0.05%,0.1%,0.2%,0.3%,0.5%(V/V),40 ℃水浴1 h,加入1 U·g-1明膠質(zhì)量的TG酶,反應(yīng)1 h,80 ℃水浴5 min使TG酶失活。冷卻后放入4 ℃層析柜16~18 h,用TA-XTPlus型質(zhì)構(gòu)儀測量明膠凝膠強度。

      1.3.7 明膠凝膠強度測定

      用TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)儀測定。設(shè)定條件為:柱塞P:0.5 R;下壓4 mm,壓力5 g,測前速度為2 mm·s-1,測試速度為速度1 mm·s-1,測后速度為2 mm·s-1。測試步驟:將樣品在質(zhì)構(gòu)儀圓臺上放平,柱塞對準膠面非中心下壓,記錄最大力。每一個待測樣品測3次,作3個平行樣,取平均值。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 單寧酸對不同濃度魚明膠凝膠強度影響

      明膠濃度是影響明膠凝膠強度的重要因素。研究表明,明膠的凝膠強度會隨著明膠濃度增大而增大,主要是因為明膠分子之間相互纏結(jié),從而導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加致密,網(wǎng)絡(luò)結(jié)點數(shù)目也增多,分子間的作用力隨之增強。單寧酸可與蛋白質(zhì)中的氨基酸反應(yīng),在明膠溶液中加入單寧酸溶液會對明膠凝膠強度產(chǎn)生影響。我們在2%,4%,6%,8%,10%的魚明膠中分別加入0.1%(V/V)的2%(m/V)的氧化型和非氧化型的單寧酸溶液,驗證不同類型單寧酸對魚明膠凝膠強度的影響。結(jié)果如圖2所示。

      明膠濃度/%

      結(jié)果表明,隨著魚明膠濃度的增加,其凝膠強度也逐漸增強,加入單寧酸可以有效提升不同濃度下的魚明膠凝膠強度,且相比于非氧化型單寧酸,添加氧化型單寧酸能更有效提升魚明膠的凝膠強度。這可能是因為相比于非氧化性單寧酸,氧化型單寧酸與魚明膠的相互作用除了非共價結(jié)合,還存在一定的共價結(jié)合,在一定程度上使氧化型單寧酸比非氧化性單寧酸更能提升魚明膠的凝膠強度[14]。

      2.2 不同濃度氧化型單寧酸對魚明膠凝膠強度性質(zhì)的影響

      單寧酸可與明膠中的氨基酸基團進行反應(yīng),為了進一步驗證氧化型單寧酸添加量對魚明膠凝膠強度的影響。分別在2,4,6,8,10%(m/V)的魚明膠中加入體積濃度為0%,0.05%,0.1%,0.2%,0.3%,0.5%(V/V)的氧化型單寧酸母液(2%m/V),測定其對魚明膠凝膠強度的影響,結(jié)果如圖3所示。

      圖3 不同濃度氧化型單寧酸對魚明膠凝膠強度的影響

      結(jié)果表明,魚明膠凝膠強度受到氧化型單寧酸濃度的影響。氧化型單寧酸體積濃度從0%(V/V)增加到0.1%(V/V)時,魚明膠凝膠強度隨之快速上升;濃度超過0.1%(V/V)以后,魚明膠凝膠強度變化趨于平穩(wěn),至濃度達到0.3%(V/V)后,魚明膠凝膠強度開始下降。凝膠濃度為10%時,氧化型單寧酸對明膠凝膠強度的增幅比例開始下降,且在增加氧化型單寧酸濃度后,凝膠強度下降更快。這可能是因為隨著魚明膠濃度的增加,其凝膠網(wǎng)絡(luò)變的更加緊密,單寧酸對明膠分子的交聯(lián)效果變得有限,同時單寧酸分子與魚明膠更容易形成聚合體,使凝膠網(wǎng)絡(luò)不連續(xù),進而引起魚明膠凝膠強度的降低[15]。

      2.3 TG酶對魚明膠凝膠強度的影響

      TG酶能夠使得明膠蛋白形成分子內(nèi)或分子間的共價交聯(lián),從而改善明膠凝膠的理化性質(zhì)。在2%,4%,6%,8%,10%(m/V)的魚明膠中,添加1 U·g-1明膠質(zhì)量的TG酶,探討TG酶對明膠凝膠強度的影響,結(jié)果如圖4所示。TG酶的加入能顯著提高魚明膠的凝膠強度,當(dāng)明膠濃度增加到6%時,TG酶對明膠的凝膠強度的提升比例達到最大,此后隨著明膠濃度增加,TG酶處理對魚明膠凝膠強度的提升效果開始減弱。

      圖4 TG酶對魚明膠凝膠強度的影響

      2.4 TG酶處理時間及濃度對魚明膠凝膠強度的影響

      為了進一步優(yōu)化TG酶處理改性魚明膠的條件,提升魚明膠的凝膠強度,我們選擇6%(m/V)的明膠出發(fā),對TG酶處理時間(圖5)和TG酶的添加量(圖6)進行優(yōu)化,驗證其對魚明膠凝膠強度的影響。結(jié)果表明,在6%明膠中,添加1 U·g-1明膠質(zhì)量的TG酶后,在0~60 min內(nèi),魚明膠凝膠強度隨著TG酶處理時間的增加而增大,在反應(yīng)60 min時,達到最大,60 min之后,魚明膠的凝膠強度開始下降。而在6%明膠溶液中加入不同濃度的單寧酶后,魚明膠的凝膠強度隨著加入的TG酶濃度提升先上升,至TG酶濃度為1 U·g-1明膠質(zhì)量時達到峰值,此后,隨著TG酶添加濃度上升,魚明膠的凝膠強度趨于平穩(wěn)。

      圖5 TG酶反應(yīng)時間對魚明膠凝膠強度的影響

      圖6 TG酶添加濃度對魚明膠凝膠強度的影響

      TG酶催化明膠分子中谷氨酰胺的γ-氨基與賴氨酸ε-氨基發(fā)生交聯(lián),使得明膠蛋白形成分子內(nèi)或分子間共價交聯(lián)。魚明膠在TG酶處理后,明膠形成更致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),有利于明膠凝膠強度的提升,但是TG酶過度處理后,魚明膠網(wǎng)絡(luò)進一步交聯(lián),形成了粗壯的大孔網(wǎng)絡(luò),其凝膠強度開始下降[16]。

      2.5 TG酶與單寧酸共同作用對魚明膠凝膠強度的影響

      在分別研究單寧酸和TG酶對魚明膠凝膠強度影響的基礎(chǔ),進一步探究兩者是否存在協(xié)同作用提升魚明膠的凝膠強度。在明膠濃度為6%,添加1 U·g-1明膠質(zhì)量條件下,加入不同體積濃度的氧化型單寧酸和非氧化型單寧酸母液。驗證兩者共同作用對魚明膠凝膠強度的影響,結(jié)果如圖7所示。

      圖7 TG酶與單寧酸共同作用對魚明膠凝膠強度的影響

      結(jié)果顯示,用1 U·g-1TG酶和不同濃度的氧化型或非氧化型單寧酸處理6%(m/V)魚明膠后,魚明膠的凝膠強度隨著單寧酸濃度的增加而先上升,至單寧酸母液體積濃度為0.2%(V/V)時達到最大值,此后隨著單寧酸濃度進一步增加,魚明膠的凝膠強度開始趨于下降。同時發(fā)現(xiàn)氧化型單寧酸與TG酶共同作用比非氧化型單寧酸與TG酶共同作用更有利于提升魚明膠的凝膠強度。

      在最優(yōu)條件下,TG酶和單寧酸共同作用能有效提升約50%魚明膠的凝膠強度,這一結(jié)果優(yōu)于此前報道的單獨TG酶、戊二醛交聯(lián)、聚谷氨酸改性分別提升18.3、31.5、10.8%的明膠強度[10,17],同時也優(yōu)于本文單獨優(yōu)化的TG酶或單寧酸處理效果。其主要原因可能是兩種方法有著不同的作用機制,能從多個方面綜合提升魚明膠的凝膠強度。

      TG酶催化明膠分子中谷氨酰胺的γ-氨基與賴氨酸ε-氨基發(fā)生交聯(lián),使得明膠蛋白形成分子內(nèi)或分子間共價交聯(lián);而單寧酸具有多個羥基,能增強明膠分子間的氫鍵和疏水作用;它們都能增加魚明膠的凝膠強度[10,15]。兩種改性方式之間并不存在明顯的互斥,可以通過分子內(nèi)、分子間的共價修飾及分子間氫鍵和疏水作用,共同作用進而增強魚明膠的凝膠強度。

      3 結(jié)論

      本實驗以酶法(谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶)和化學(xué)法(氧化型非氧化型單寧酸)改性魚明膠,發(fā)現(xiàn)兩種方法都能顯著提升魚明膠的凝膠強度,兩種方法協(xié)同使用,能進一步提升魚明膠的凝膠強度。其中氧化型單寧酸對明膠凝膠強度的提升明顯優(yōu)于非氧化型單寧酸。最優(yōu)條件下,在6%明膠中,添加0.2%(V/V)的氧化型單寧酸后,魚明膠凝膠強度最高為751.8 g;在6%明膠中,添加1 U·g-1明膠質(zhì)量的TG酶后,魚明膠凝膠強度最高為832.2 g;在6%明膠中,添加1 U·g-1明膠質(zhì)量的TG酶和0.2%(V/V)的氧化型單寧酸后,魚明膠凝膠強度最高為946.2 g。這一研究將有助于提升單位明膠的使用效率,節(jié)約明膠使用成本,為后續(xù)研究更多種輔料處理改性明膠提供了理論參考。同時也為更深入地研究和改善明膠的其它性質(zhì)提供了思路。

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