肖博雅，董理鑫，高 慧，楊凱朝，王亞飛，李曉凝，邱海霞，王愛國，張 舜

1華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系，環(huán)境與健康教育部重點實驗室，湖北 武漢 430030；2華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，湖北 武漢430030

多溴聯(lián)苯醚（PBDEs）是一類溴代阻燃劑，因其良好的耐火性能被廣泛應(yīng)用于電子電器、建材、紡織品、家具等領(lǐng)域［1］。PBDEs難降解且缺乏化學(xué)鍵束縛，易蒸發(fā)、滲漏入環(huán)境，在環(huán)境介質(zhì)如水、空氣、土壤中廣泛存在，并能隨食物鏈蓄積于生物體內(nèi)［2］。一般人群主要通過飲食和灰塵吸入暴露PBDEs［3］；此外，嬰幼兒還可通過胎盤轉(zhuǎn)運、母乳喂養(yǎng)以及特有的手-口行為等途徑額外暴露于PBDEs，致使其體內(nèi)PBDEs負(fù)荷達成人的3～9倍之多［4］。由于嬰幼兒期是大腦發(fā)育關(guān)鍵期，故PBDEs的發(fā)育神經(jīng)毒性備受人們關(guān)注。2，2'，4，4'-四溴聯(lián)苯醚（PBDE-47）是人體內(nèi)含量最多、毒性最強的PBDEs同系物之一［5］。隊列研究與動物實驗表明，孕前和/或孕期PBDE-47暴露可導(dǎo)致子代行為和認(rèn)知功能異常［6,7］。機制研究進一步發(fā)現(xiàn)，PBDE-47引起的動物學(xué)習(xí)記憶損害等神經(jīng)毒性表現(xiàn)與神經(jīng)細(xì)胞異常自噬和凋亡密切相關(guān)［8］。然而，目前對于PBDE-47的神經(jīng)毒性，尚缺乏有效的防治措施。因此，靶向異常自噬和凋亡對尋找針對性的藥物可能具有重要的現(xiàn)實意義。

褪黑素（MT）是腦松果體在黑暗時分泌的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)激素，能控制體內(nèi)內(nèi)分泌腺活動［9］。目前，越來越多的研究關(guān)注褪黑素對神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡的調(diào)節(jié)作用［10,11］。研究顯示，褪黑素可激活神經(jīng)細(xì)胞自噬，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡［12］，維持神經(jīng)細(xì)胞自噬與凋亡間的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，保護神經(jīng)系統(tǒng)免受損傷［13］。然而，褪黑素能否通過同時調(diào)節(jié)自噬與凋亡以緩解PBDE-47所致的神經(jīng)毒性，尚未見文獻報道。本研究旨在探討褪黑素對PBDE-47所致神經(jīng)細(xì)胞異常自噬和凋亡的影響，觀察其對PBDE-47致神經(jīng)細(xì)胞毒性的保護作用，從而為PBDE-47神經(jīng)毒性的預(yù)防與控制提供思路。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

高分化PC12細(xì)胞購買自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，PBDE-47（純度>99.99%，GC/MS 級，Accustandard），二甲基亞砜（DMSO）（Biofroxx），褪黑素（MCE），RPMI 1640 培養(yǎng)基（HyClone），胎牛血清、胰蛋白酶（Gibco），BCA蛋白濃度測定試劑盒、IP裂解液、PMSF（碧云天），Western blot相關(guān)儀器設(shè)備（Bio-Rad），PVDF膜（Millipore），自噬相關(guān)蛋白7（ATG7）抗體（abcam），自噬選擇性底物p62/SQSTM1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）抗體（Proteintech），含半胱氨酸的天冬氨酸-3（caspase-3）、多（ADP-核糖）聚合酶（PARP）抗體（CST），GAPDH抗體（Bioworld），HRP標(biāo)記山羊抗兔、小鼠IgG抗體、細(xì)胞計數(shù)試劑盒（CCK8）（啟動子），ECL增強型化學(xué)發(fā)光液（Pierce），F(xiàn)orma Series II水套式二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo），ELX-800 型多功能酶標(biāo)儀（Bio-Tek），GeneGnome XRQ 熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（Syngene），Eclipse Ti型激光共聚焦顯微鏡（尼康）。

1.2 試劑配制

1.2.1 PBDE-47工作液配制 準(zhǔn)確稱取1 mg PBDE-47粉末溶于50 μL DMSO溶液，制成PBDE-47儲備液，濃度為40 mmol/L。臨用前用培養(yǎng)基稀釋為相應(yīng)工作液濃度，室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 褪黑素工作液配制 準(zhǔn)確稱取233 mg褪黑素粉末溶于1 mL DMSO溶液，制成1 mol/L褪黑素儲備液，臨用前用培養(yǎng)基稀釋為25 μmol/L褪黑素工作液，-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)胞處理

選用發(fā)育神經(jīng)毒性研究的體外細(xì)胞模型大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞，將其培養(yǎng)于培養(yǎng)液（10%胎牛血清）中，并置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，2 d/次傳代。待細(xì)胞融合度達80%左右，棄培養(yǎng)液，按實驗分組進行染毒干預(yù)處理。根據(jù)課題組前期CCK8實驗結(jié)果，20 μmol/L PBDE-47溶液染毒PC12細(xì)胞活力顯著下降且在70%以上［14］，因此選擇此染毒濃度用于本次實驗。首先進行MT干預(yù)劑量摸索，參考文獻報道［15］設(shè)置MT濃度梯度（12.5、25、50、100、200 μmol/L），并聯(lián)合20 μmol/L PBDE-47處理，CCK8測定結(jié)果顯示PBDE-47+25 μmol/L MT處理組可顯著改善PBDE-47所致細(xì)胞活力下降且保持在80%以上，因此選擇此濃度用于后續(xù)實驗。實驗分組如下：對照組（DMSO），20 μmol/L PBDE-47處理組，20 μmol/L PBDE-47+25 μmol/L MT處理組（預(yù)處理2 h后與PBDE-47共培養(yǎng)），25 μmol/L MT處理組。細(xì)胞處理24 h后收獲。

1.4 Western blot實驗

待細(xì)胞經(jīng)上述1.3 處理培養(yǎng)后，用胰酶收集細(xì)胞，離心后棄去上清液，加入RIPA 裂解液和PMSF（RIPA∶PMSF=100∶1），冰上裂解30 min 后4 ℃離心（12 000 r/min，10 min），取上清液6 μL用磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋10倍，定量按BCA試劑盒說明書操作，吸取剩余蛋白上清液，根據(jù)定量結(jié)果將5×loading buffer與蛋白上清液按1∶4比例混合后煮沸（100 ℃，10 min），-20 ℃保存蛋白樣品。上樣時取20 μg蛋白樣品在10%～15%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，待蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)充分分離時停止電泳，并濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，配制5%脫脂牛奶用于封閉（1.5 h），4 ℃一抗孵育過夜，次日1×TBST洗膜（3次×15 min），用HRP-耦合的二抗封閉液于室溫孵育1 h，再次1×TBST洗膜（3次×15 min），用ECL顯影液均勻淋洗PVDF膜后顯影。將采集的圖像用Quantity One軟件分析灰度值。

1.5 CCK8細(xì)胞存活率實驗

準(zhǔn)備96 孔板，接種細(xì)胞（5×104/mL），設(shè)置空白組（Blank），對照組與實驗處理組，其中Blank 組不接種細(xì)胞，只加培養(yǎng)基。實驗孔外1周用PBS封閉，按1.3處理細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。加入20 μL/孔CCK-8工作液（培養(yǎng)基：CCK8=1∶1），37 ℃避光溫育1 h，用多功能酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度A450nm，計算細(xì)胞存活率=（A實驗處理組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

1.6 細(xì)胞免疫熒光實驗

載玻片用0.1 mg/mL多聚賴氨酸固定于六孔培養(yǎng)板，將細(xì)胞以1×105/mL種板并按1.3所述處理細(xì)胞，待處理培養(yǎng)結(jié)束，4%甲醛固定（30 min），PBS 清洗（3次×3 min），用PBS配制的0.5%Triton X-100于室溫通透30 min，重復(fù)PBS清洗（3次×3 min），用PBS配制的10%山羊血清封閉液于室溫封閉1 h，然后用山羊血清稀釋的LC3一抗封閉液（1∶400）于4 ℃孵育過夜，次日棄去封閉液，PBS清洗（3次×3min）后加入Alexa Fluor 488綠色熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶250）于室溫避光孵育1.5 h，再次PBS清洗（5次×3 min），滴加DAPI染液避光染色15 min，PBS清洗（5次×3 min），滴加熒光猝滅劑封片固定，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光圖片。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，將至少重復(fù)3次獨立實驗后得到的數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 22.0統(tǒng)計分析，單因素方差分析（One Way ANOVA）和最小顯著性差異法（LSD）進行多重比較，檢驗以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，GraphPad Prism 8.0制作統(tǒng)計條圖。

2 結(jié)果

2.1 褪黑素對PBDE-47所致PC12細(xì)胞存活率降低的影響

與對照組相比，PBDE-47處理組PC12細(xì)胞存活率下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）；與PBDE-47處理組相比，PBDE-47+MT（12.5 μmol/L，25 μmol/L）處理組PC12細(xì)胞存活率上升（P值分別為0.044和0.023），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且PBDE-47+25 μmol/L MT處理組細(xì)胞存活率在80%以上（圖1）。

圖1 不同濃度褪黑素對PBDE-47處理的PC12細(xì)胞存活率改變的影響Fig.1 Effect of melatonin on survival rate of PC12 cells treated with PBDE-47.The cell survival rate was determined using CCK8 assay.*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs PBDE-47.

2.2 褪黑素對PBDE-47所致PC12細(xì)胞自噬體蓄積的影響

與對照組相比，PBDE-47處理組PC12細(xì)胞LC3蛋白陽性著色增強；與PBDE-47處理組相比，PBDE-47+MT處理組PC12細(xì)胞LC3蛋白陽性著色減弱（圖2）。

圖2 褪黑素對PBDE-47處理的PC12細(xì)胞LC3蛋白陽性著色改變的影響Fig.2 Effect of melatonin on expression f LC3 protein in PC12 cells treated with PBDE-47 (immunofluorescence taining,scale bar=2 μm).Green:LC3-positive puncta;blue:DAPI staining.

2.3 褪黑素對PBDE-47所致PC12細(xì)胞自噬損傷的影響

與對照組相比，PBDE-47處理組PC12細(xì)胞ATG7蛋白水平下降（P<0.001），p62、LC3-II 蛋白水平上升（P<0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與PBDE-47處理組相比，PBDE-47+MT處理組PC12細(xì)胞ATG7蛋白水平上升（P=0.034），p62蛋白水平下降（P=0.048），LC3-II蛋白水平下降（P=0.018），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖3）。

圖3 褪黑素對PBDE-47處理的PC12細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白水平改變的影響Fig.3 Effect of melatonin on autophagy-related protein levels in PC12 cells treated with PBDE-47.A:Representative Western blots of the autophagy-related proteins.B-D:Quantitative analysis of the expression levels of ATG7(B),p62(C)and LC3-II(D).*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs PBDE-47.

2.4 褪黑素對PBDE-47所致PC12細(xì)胞凋亡的影響

與對照組相比，PBDE-47處理組PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白active caspase-3 水平上升（P<0.001），cleaved PARP 水平上升（P<0.001），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與PBDE-47 處理組相比，PBDE-47+MT 處理組PC12 細(xì)胞活化型caspase-3（active caspase-3）蛋白水平下降（P<0.001），剪切型PARP（cleaved PARP）蛋白水平下降（P=0.032），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。

圖4 褪黑素對PBDE-47處理的PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白水平改變的影響Fig.4 Effect of melatonin on apoptosis-related proteins levels in PC12 cells treated with PBDE-47.A:Representative Western blots of apoptosis-related proteins.B,D:Quantitative analysis of the expression levels of active caspase-3(B)and cleaved PARP(C).*P<0.05 vs control;#P<0.05 vs PBDE-47.

3 討論

自噬是真核細(xì)胞內(nèi)自我降解和循環(huán)利用胞內(nèi)組分的過程［16］。ATG是調(diào)控自噬體起始的關(guān)鍵基因，主要由自噬體前體招募并參與形成杯狀雙層隔離膜，隔離膜進一步延伸擴展直至封閉形成自噬體［17］。在此期間，游離LC3-I經(jīng)ATG7介導(dǎo)與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成復(fù)合物L(fēng)C3-II，后者可作為反映自噬體水平的關(guān)鍵指標(biāo)［18］。p62是重要的接頭蛋白，參與自噬過程并作為自噬底物被降解［19］。我們的結(jié)果顯示，PBDE-47可致PC12細(xì)胞ATG7蛋白水平降低，表明自噬體生成減少；但LC3-II和p62蛋白水平增加，且免疫熒光結(jié)果也顯示LC3陽性熒光斑點聚集增加，表明自噬體降解受阻。這些結(jié)果提示PBDE-47能同時損傷自噬生成和降解兩個環(huán)節(jié)導(dǎo)致PC12細(xì)胞自噬異常，與其它污染物僅影響其中一個環(huán)節(jié)的機制并不相同［8］，顯示出PBDE-47損傷神經(jīng)細(xì)胞自噬的特異性。有趣的是，褪黑素干預(yù)后自噬相關(guān)蛋白ATG7水平升高，p62、LC3-II水平降低，LC3陽性著色減少，提示自噬體生成與降解異常朝正常水平恢復(fù)。研究表明，褪黑素可通過激活自噬延緩錳所致小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞毒性［20］，以及過氧化氫誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷［21］。與此類似的是，褪黑素可通過激活自噬以緩解大鼠脊髓損傷所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙［22］，提示激活自噬可能是褪黑素的神經(jīng)保護機制之一。然而，我們的結(jié)果顯示，褪黑素還能提高整體自噬活性，通過促進自噬生成和降解過程以改善PBDE-47所致PC12細(xì)胞異常自噬。這些結(jié)果表明，褪黑素能通過調(diào)節(jié)自噬水平以發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

凋亡是細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定而自主程序性死亡的過程［23］。Caspase家族是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，而caspase-3在細(xì)胞凋亡中的作用非常關(guān)鍵，可以通過剪切關(guān)鍵蛋白PARP，從而增高由PARP負(fù)調(diào)控的核酸內(nèi)切酶活性，后者可使核小體間DNA裂解，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［24］。因此活化的caspase-3和剪切的PARP可作為細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)PBDE-47可增加PC12細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白active caspase-3和cleaved PARP的水平，與我們在動物水平觀察到的結(jié)果一致［25］，且與細(xì)胞存活率下降結(jié)果相符。更重要的是，褪黑素干預(yù)可降低凋亡相關(guān)蛋白水平，緩解PBDE-47所致過度凋亡，提高細(xì)胞存活率。與此類似的是，褪黑素可抑制丙戊酸誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞凋亡蛋白表達，從而抵抗細(xì)胞凋亡［26］。此外，妊娠期給予褪黑素可改善砷所致子代雄性大鼠腦組織細(xì)胞凋亡［27］。不僅如此，褪黑素還可通過抑制凋亡改善大鼠腦出血后腦水腫和行為障礙［28］。這些結(jié)果均提示褪黑素還可通過抑制凋亡以起到神經(jīng)保護作用。但有趣的是，褪黑素對魚藤酮誘導(dǎo)的小鼠腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤N2a細(xì)胞凋亡卻無保護作用［29］，表明褪黑素對于不同凋亡通路的作用可能具有選擇性。研究顯示，褪黑素可抑制大鼠垂體GH3細(xì)胞自噬以緩解環(huán)孢菌素A所致細(xì)胞死亡［30］。然而，褪黑素對PBDE-47致PC12細(xì)胞凋亡的抑制作用是直接的，還是間接通過調(diào)節(jié)自噬而實現(xiàn)，有待進一步研究。

綜上所述，PBDE-47可致PC12細(xì)胞自噬障礙與過度凋亡，而褪黑素處理可緩解自噬體蓄積和自噬損傷，減少細(xì)胞凋亡水平，從而提高細(xì)胞存活。我們的結(jié)果為揭示褪黑素對PBDE-47神經(jīng)毒性的保護作用和機制提供了參考依據(jù)。