孫文杰，何婷，韓軍，任曉艷，李萌

南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院輸血科，江蘇 南京210008

ABO血型系統(tǒng)最初由Karl Landsteiner于1990年提出［1］，至今仍然是輸血醫(yī)學(xué)和器官移植醫(yī)學(xué)中最重要的血型系統(tǒng)，輸注ABO不相容血液可能導(dǎo)致急性血管內(nèi)溶血、腎衰竭甚至死亡。同樣，移植ABO不相容器官可能導(dǎo)致急性體液性排斥反應(yīng)［2］。因此，正確的血型鑒定是保障臨床輸血安全的重要保障。而在血清學(xué)方法進行ABO血型鑒定時，往往表現(xiàn)出正反定型不一致、抗原抗體反應(yīng)性減弱或出現(xiàn)混合凝集視野等現(xiàn)象，ABO血型定型困難，疑為亞型。目前國內(nèi)對于ABO亞型的研究報道多為個別案例［3,4］，而且多為ABO血型1-7外顯子的基因分析［5,6］。本研究對20例血清學(xué)檢測異常的血型樣本同時進行了ABO基因1-7外顯子編碼區(qū)及其上游調(diào)控區(qū)域基因擴增及測序，探討其ABO血型抗原表達減弱的分子生物學(xué)機制。

1 資料和方法

1.1 研究對象

12例樣本來自南京市兒童醫(yī)院外科擇期手術(shù)住院患兒；8例樣本來自患兒家屬。其中例1和例2（例1之母）、例4例5（例3之母）和例6（例4外婆）、例7和例8（例7之母）、例9和例10（例9之父）、例11和例12（例11之父）、例14和例15（例14之母）、例19和例20（例19之父）間存在家系關(guān)系。本研究已通過南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查，批件號：202101006-1。

1.2 材料

1.2.1 血清學(xué)檢測 ABO-RhD血型鑒定卡、低離子抗人球蛋白卡（伯樂公司）、抗體篩選紅細(xì)胞、抗A抗B血型定型試劑、抗D、抗H（上海血液生物醫(yī)藥有限公司）、專用離心機（伯樂公司，ID-Centrifuge 12 S Ⅱ）、專用孵育箱（伯樂公司，ID-Incubator 37 S Ⅰ）。

1.2.2 分子生物學(xué)檢測 DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）、2xGC Buffer、rTaq、dNTP Mixture（takara）、PCR擴增儀（GeneAmp9700PCR系統(tǒng)，ABI）、高速離心機（SIGMA1-14臺式小型離心機）、渦旋混勻器（VDRTEX-5）、電泳儀（JY300C、北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、凝膠電泳槽（JY-SP3、北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、紫外分析儀（JYO2S、北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）、水浴箱（天津泰斯特三用恒溫/電熱恒溫水箱SHHW21.420AⅡ）。

1.3 方法

1.3.1 血清學(xué)檢測 采用微柱凝集法及鹽水試管法對18例樣本進行ABO血型血清學(xué)鑒定。嚴(yán)格執(zhí)行操作說明書。

1.3.2 分子生物學(xué)檢測

1.3.2.1 DNA提取 取全血200 μL，按照試劑盒操作說明提取DNA。

1.3.2.2 PCR擴增及測序 委托天津吉諾泰普生物科技有限公司設(shè)計并合成針對ABO基因第1-7外顯子及上游調(diào)控區(qū)域特異性引物，PCR擴增并直接測序，確定基因型。每個反應(yīng)總體積50 μL：Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.4 μL，2×GC Buffer I 25 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各1 μL，DNA 模板5 μL、ddH2O 13.6 μL。反應(yīng)過程為：96℃3 min，1 cycle；96 ℃25 s/68 ℃60 s 5 cycles；96 ℃25 s/65 ℃50 s/72 ℃45 s，10 cycles；96 ℃25 s/62 ℃50 s/72 ℃45 s，25 cycles；72 ℃3 min，1 cycle。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠鑒定后測序，與NCBI 在線比對數(shù)據(jù)庫nucleotide blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）確定其基因型。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果

對20 例樣本使用微柱凝集法及鹽水試管法進行ABO血型鑒定，血清學(xué)檢測結(jié)果顯示，ABO血型抗原表達異常，正反定型結(jié)果不符合。其中A抗原表達異常3例，B抗原表達異常17例；10例樣本紅細(xì)胞與抗B試劑反應(yīng)出現(xiàn)混合視野；樣本紅細(xì)胞與抗H試劑反應(yīng)均有不同程度增強；20例樣本均疑為ABO亞型（表1）。

2.2 分子生物學(xué)檢測結(jié)果

ABO 血型基因第1-7 外顯子及其上游調(diào)控區(qū)域PCR產(chǎn)物直接測序結(jié)果，根據(jù)ISBT 網(wǎng)站提供的Names for ABO(ISBT 001)blood group alleles v1.1 171023綜合結(jié)果判定（以ABO*A1.01為參考序列）。結(jié)果顯示，20例樣本中，1例為A2B型，1例為A2型，2例為AB3型，3例為B3型，4例為Bw12型，4例B抗原表達減弱的樣本發(fā)生啟動子區(qū)域變異；1例A抗原表達減弱樣本發(fā)生第7外顯子1054delC；另外4例樣本ABO血型1-7外顯子及其調(diào)控區(qū)域未發(fā)現(xiàn)變異（表2，圖1）。

表2 20例樣本ABO血型PCR直接測序結(jié)果Tab.2 Results of direct PCR sequencing of ABO blood group in the 20 cases

3 討論

ABO基因位于第9號染色體q34.2，由7個外顯子組成，共編碼354個氨基酸。如果在ABO等位基因編碼區(qū)發(fā)生突變，則可引起ABO基因編碼物質(zhì)的改變，從而導(dǎo)致ABO血型亞型生成［7］。目前研究ABO亞型主要有血清學(xué)水平（免疫血液學(xué)實驗）、基因水平（DNA、mRNA）、蛋白水平（氨基酸、糖基轉(zhuǎn)移酶、蛋白構(gòu)象）3種模式［8］。國外在蛋白質(zhì)或氨基酸水平有相關(guān)研究［9］。然而因為ABO基因77%編碼序列位于第6和第7外顯子，這兩個編碼區(qū)是決定ABO基因產(chǎn)物糖基轉(zhuǎn)移酶功能的主要部分［10］，因此關(guān)于外顯子區(qū)域，尤其第6、7外顯子測序研究的文獻報道較多［11-13］，針對啟動子區(qū)域研究較少。本次研究，對20例血清學(xué)檢測ABO血型抗原表達減弱的樣本1-7外顯子編碼區(qū)及其上游調(diào)控區(qū)域同時進行測序分析，以進一步揭示ABO血型亞型的分子生物學(xué)機制。

研究顯示，上游調(diào)控區(qū)堿基變異導(dǎo)致的B抗原減弱樣本4例；未見既往報道的堿基變異2例（1例為上游調(diào)控區(qū)-119位C>T變異，1例為第7外顯子1054位點del C）；另有4例樣本血清學(xué)結(jié)果明顯異常而其上游調(diào)控區(qū)及1-7外顯子基因檢測均未見異常，疑為內(nèi)含子區(qū)域變異造成ABO血型抗原異常表達。20例樣本中，例1及例2存在家系關(guān)系，確定其基因型分別為ABO*A2.01/ABO*B.01、ABO*A2.01/ABO*O01.01；例4、例5 及例6存在家系關(guān)系，確定其基因型分別為B3.04/A1.02、B3.04/O.01.01、B3.04/O.01.02；例7 及例8 存在家系關(guān)系，確定其基因型分別為B3.02/A1.02、B3.02/O.01.02；例9及例10存在家系關(guān)系，確定其基因型分別為Bw.12/O.01.01、Bw.12/O.01.01；例11及例12存在家系關(guān)系，確定其基因型分別為Bw.12/O.01.01、Bw.12/O.01.01；有4例樣本發(fā)生啟動子區(qū)域變異，其中例13、例14及例15發(fā)生ABO基因啟動子區(qū)域-35_-18位點堿基缺失（例14及例15存在家系關(guān)系），導(dǎo)致B抗原表達減弱；例16發(fā)生啟動子區(qū)域-119位C>T的異常變異，因?qū)σ酝BO血型基因分析并未發(fā)現(xiàn)此變異，故推測該變異導(dǎo)致了B抗原表達減弱；例3樣本發(fā)生第7外顯子1054位點缺失堿基C，因?qū)σ酝BO血型基因分析并未發(fā)現(xiàn)此變異，故推測該變異導(dǎo)致A抗原表達減弱；例17、例18、例19及例20樣本紅細(xì)胞與抗B試劑血清學(xué)反應(yīng)均呈現(xiàn)混合視野現(xiàn)象，其中例19及例20為父子關(guān)系，且二者ABO血型血清學(xué)鑒定格局一致，但經(jīng)ABO血型1-7外顯子及其調(diào)控區(qū)域基因檢測，該4例樣本均未發(fā)現(xiàn)變異。

啟動子在轉(zhuǎn)錄過程中起調(diào)控作用，通過活化RNA聚合酶，使之與DNA模板準(zhǔn)確結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性。同時，ABO基因內(nèi)含子1的變異可能也影響ABO血型基因的表達。國內(nèi)關(guān)于這方面研究較少。國外文獻報道［14］，在紅細(xì)胞生成過程中，miR-331-3p 和miR-1908-5p 的表達水平與血型抗原水平呈負(fù)相關(guān)。Sano等［15-17］研究發(fā)現(xiàn)，ABO基因內(nèi)含子1中有基因表達的調(diào)控元件，位于ATG翻譯起始位點3’方向、+5653和+6154核苷酸位點之間，可以增強ABO基因啟動子的活性，而刪除包含此調(diào)控序列的內(nèi)含子1，會導(dǎo)致Bm亞型表型。Fenne等［18］研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子1中GATA堿基突變，會引起ABO血型血清學(xué)試驗正反定型不符。有文獻報道［19-21］，ABO基因內(nèi)含子1中紅細(xì)胞特異性調(diào)控元件（+5.8 kb）負(fù)責(zé)抗原差異表達，RUNX1基序單點突變可下調(diào)+5.8 kb位點的轉(zhuǎn)錄活性，導(dǎo)致A或B抗原表達減少。ABO基因內(nèi)含子1中核昔酸的突變也可使紅細(xì)胞表面A抗原表達減弱，導(dǎo)致AmB表型出現(xiàn)。

本次研究的20例樣本中，7例變異發(fā)生在第6外顯子；5例發(fā)生于第7外顯子，其中1054位點del C未見報道，疑為新的變異位點；4例樣本堿基變異位于啟動子區(qū)域，其中-119位C>T未見報道，疑為新的變異位點；4例樣本未發(fā)現(xiàn)其上游調(diào)控區(qū)域及外顯子1-7明顯變異，推測其是否與mRNA合成異常有關(guān)，是否由于RUNX1位點突變下調(diào)ABO基因內(nèi)含子1的+5.8 kb位點的轉(zhuǎn)錄活性，從而導(dǎo)致B抗原減弱。目前國內(nèi)對內(nèi)含子1堿基變異導(dǎo)致ABO血型抗原表達異常的的研究較少，值得進一步關(guān)注。

另有資料認(rèn)為A亞型比B亞型更常見［22］，但是本次實驗20例亞型中僅有2例A抗原表達異常，B亞型明顯較A亞型更常見。分析其原因可能與中國人群血型分布不同于歐美有關(guān)，不同地域不同民族人群中血型分布，也是輸血醫(yī)學(xué)發(fā)展需要關(guān)注的方向之一。