王明霞，劉志輝，朱 鎮(zhèn)，李凌鋒，王博蔚

（1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院,長春130021；2.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院,長春130021；3.鎮(zhèn)江市口腔醫(yī)院,鎮(zhèn)江212001）

由于外傷、炎癥、腫瘤切除術(shù)、先天性骨骼發(fā)育畸形、骨再生異常、伴隨人口老齡化或全身疾病出現(xiàn)的骨萎縮和骨質(zhì)疏松等都會(huì)導(dǎo)致臨床骨缺損［1］.隨著再生醫(yī)學(xué)的進(jìn)步與組織工程學(xué)的發(fā)展，骨組織工程開始被廣泛研究［2］.支架材料作為骨組織工程中的關(guān)鍵角色，既為種子細(xì)胞和各種細(xì)胞因子提供了載體，又為新生骨組織生長營造了局部微環(huán)境，為細(xì)胞的黏附、增殖和組織的生長提供支持［3］，進(jìn)而構(gòu)建出作為缺損骨組織替代物的細(xì)胞-支架-生物因子復(fù)合體.本文將納米硅酸鎂鋰（nLMS）、殼聚糖（CS）和海藻酸鈉（SA）3種材料混合，制備了一種新型的nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料，分析了其微觀形態(tài)與三維立體結(jié)構(gòu)，檢測其溶脹率、孔隙率和降解速度，并通過與L929細(xì)胞體外共培養(yǎng)評價(jià)其生物相容性，探討了在nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料中改變納米硅酸鎂鋰的含量對其理化性能和生物性能產(chǎn)生的影響.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司（脫乙酰度80.0%~95.0%，平均相對分子量10000）；海藻酸鈉（12～20 cp）購自美國Sigma公司；納米硅酸鎂鋰購自上海源葉公司；無水乙醇和磷酸鹽緩沖液（PBS）購自北京化工廠；L929細(xì)胞系由吉林大學(xué)口腔實(shí)驗(yàn)中心提供；H-DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；小牛血清購自Clark公司；胰酶購自北京鼎國昌盛公司；CCK-8試劑盒購自三邦醫(yī)藥公司.

CO2培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司；真空冷凍干燥機(jī)購自北京博醫(yī)康公司；S-4800型掃描電子顯微鏡（SEM，束流：20 μA，電子加速電壓：5.0 kV，放大倍數(shù)：100倍和200倍）和E-1010型離子濺射儀購自日本Hitachi公司；酶標(biāo)檢測儀購自美國Bio-TEK公司；ALPHA型傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）購自德國Bruker公司（檢測范圍：600~4000 cm?1，分辨率：4 cm?1）；AG-X型電子萬能試驗(yàn)機(jī)購自日本島津公司.

1.2 nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的制備

1.2.1 各組分水溶液的配制分別將1，2，3和4 g nLMS粉末充分溶解于100 mL去離子水中，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，2%，3%，4%的nLMS溶液；將4 g SA充分溶解于100 mL去離子水中，制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的SA溶液；將6 g CS充分溶解于100 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的冰醋酸溶液中，制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的CS溶液.

1.2.2 nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的制備將4 mL 1%（或2%，3%，4%）的nLMS溶液加入至12 mL 6%

的CS溶液中，于500 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌30 min；將5 mL混合液在200 r/min轉(zhuǎn)速下緩慢加入到20 mL 4%的SA溶液中，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的NaOH溶液調(diào)節(jié)體系pH值為7.0±0.5，反應(yīng)完成后即制得透明凝膠狀復(fù)合材料；在100 W功率下超聲振蕩30 min后，于4℃冰箱中靜置2 h以排除氣泡.將上述凝膠狀材料按2.5 mL/孔的量加入24孔板中，放入?20℃冰箱冷凍24 h后再于?80℃冰箱冷凍24 h；然后置于凍干機(jī)中干燥24 h，即制得含有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的nLMSH的nLMS-CS-SA多孔復(fù)合支架材料，記為xnLMSCS-SA（其中x代表所用nLSM溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)）.

1.3 性能表征

1.3.1 溶脹率的測定稱量各組復(fù)合支架材料，記為m0（g）；將材料完全浸泡于PBS中0.5 h后用濕濾紙拭去表面水分并稱量其濕重，并記為mt（g）；于1，2，3，4，12，24和48 h重復(fù)上述操作，記錄每次測量時(shí)的質(zhì)量變化.每組樣品設(shè)置3個(gè)平行檢測組.按下式計(jì)算nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的溶脹率：

1.3.2 孔隙率的測定將燒杯內(nèi)裝滿無水乙醇并稱重，記為m1（g）；將經(jīng)過充分凍干的質(zhì)量為m0（g）的nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料完全浸入其中，待完全浸透后再加滿無水乙醇稱重，記錄為m2（g）；將樣品取出后剩余的無水乙醇和燒杯質(zhì)量記為m3（g）.每組設(shè)3個(gè)平行檢測組.孔隙率的計(jì)算公式如下：

1.3.3 體外降解性能測定將經(jīng)過充分凍干的nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料［質(zhì)量記為w0（g）］，浸泡于PBS中，于37℃培養(yǎng)7 d后棄掉緩沖液，將剩余材料再次凍干［質(zhì)量記為wt（g）］，更換新PBS溶液，連續(xù)重復(fù)上述步驟直至第7周.每組設(shè)置3個(gè)平行樣.體外降解性以質(zhì)量損失分?jǐn)?shù)表示，計(jì)算方法如下：

1.4 細(xì)胞相容性評價(jià)

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%小牛血清的H-DMEM培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5%CO2）中培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞系.

1.4.2 細(xì)胞毒性測試將充分滅菌后的nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料放入50 mL離心管內(nèi)，培養(yǎng)基體積與nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料表面積比為0.9 mL∶1 cm2，使復(fù)合支架材料完全浸沒，于37℃培養(yǎng)72 h后收集離心管中液體，并在4℃冰箱中密封保存?zhèn)溆?將處于對數(shù)生長期的L929細(xì)胞重懸、計(jì)數(shù)并稀釋為10000 cell/mL，按2000 cell/孔將細(xì)胞接種于96孔板內(nèi).實(shí)驗(yàn)共設(shè)置6組，5種nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料浸提液作為實(shí)驗(yàn)組，單純培養(yǎng)基作為對照組，每組設(shè)置8個(gè)平行孔.待細(xì)胞完全貼壁后，實(shí)驗(yàn)組及空白對照組分別加入5種nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料浸提液或細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔200 μL.孵育48 h后棄去各孔內(nèi)的上清液，實(shí)驗(yàn)組及對照組每孔加入100 μL預(yù)先配制好的CCK-8混合液，孵育4 h后用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔的吸光度值（OD）.利用相對增殖率［Relative growth rate（RGR），%］評價(jià)細(xì)胞毒性.計(jì)算公式如下：

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用ISM SPSS Statistics 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.使用Origin Pro 9.0，Microsoft Excel 2019和Adobe Photoshop CS6軟件進(jìn)行圖像處理和圖表繪制.

2 結(jié)果與討論

2.1 nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的形態(tài)表征

圖1 示出了nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的宏觀形態(tài).宏觀條件下各組支架都具有可塑性.nLMSCS-SA復(fù)合支架材料凍干前為具有良好可塑性的凝膠狀，凍干后呈圓柱狀.直徑約1.5 cm，高約1.0～1.5 cm，顏色為乳白色，表面呈網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，具有疏松多孔的三維立體結(jié)構(gòu).

Fig.1 General view of nLMS?CS?SA composite scaffolds

2.2 傅里葉變換紅外光譜

圖2 給出不同nLMS含質(zhì)量的nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的傅里葉變換紅外光譜.硅酸鎂鋰的Si—O和—OH振動(dòng)吸收峰分別出現(xiàn)在1040和3400 cm?1附近［4，5］；殼聚糖中C—N鍵的特征峰出現(xiàn)在1159 cm?1處，酰胺鍵的特征峰出現(xiàn)在1647 cm?1處，伯氨鍵的特征峰出現(xiàn)在1578 cm?1附近，在3330 cm?1附近出現(xiàn)了O—H和N—H吸收峰［6，7］；1614 cm?1處為海藻酸鈉的C=O特征峰，—OH的伸縮振動(dòng)峰為3305 cm?1處的寬峰，C—O振動(dòng)峰出現(xiàn)在1029 cm?1處［7］；與空白對照組相比，5組實(shí)驗(yàn)組未出現(xiàn)明顯的新吸收峰.在3%nLMS組中，SA的C=O特征峰與LMS向低波數(shù)方向移動(dòng)的Si—O特征峰重疊，在1024 cm?1處出現(xiàn)增強(qiáng)的特征峰.3207 cm?1處增強(qiáng)的特征寬峰是由nLMS在3400 cm?1附近的—OH，SA在3305 cm?1處的—OH及CS在3330 cm?1附近的O—H，N—H吸收峰向低波移動(dòng)并重疊而成.與Alif等［6］的研究相同，因nLMS的特征峰被1024和3207 cm?1處的拉伸振動(dòng)所掩蓋并向低波數(shù)移動(dòng)，故未觀察到明顯的nLMS特征峰.SA-CS與nLMS之間未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，主要以氫鍵或分子間作用力結(jié)合.

Fig.2 FTIR spectra of nLMS?CS?SA scaffold materials

2.3 微觀結(jié)構(gòu)與孔隙率

圖3 給出nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的SEM照片.由圖3可以看出，5組復(fù)合支架材料的內(nèi)部均呈疏松多孔結(jié)構(gòu)，連續(xù)分布于材料全層.縱斷面呈均勻片層狀，層間距基本均勻.微觀結(jié)構(gòu)內(nèi)具有高度的連通性，呈三維網(wǎng)絡(luò)狀.圖4給出nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的孔隙率結(jié)果.所有組的孔隙率均高于60%，當(dāng)所用nLMS溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～3%時(shí)，復(fù)合支架材料的孔隙率都低于空白組（P＜0.01）；當(dāng)所用nLMS質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到4%時(shí)，nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的孔隙率急劇增大（P＜0.01）.

Fig.3 SEM images of nLMS?CS?SA scaffolds

Fig.4 Porosity ratios of nLMS?CS?SA composite scaffolds

Fig.5 Swelling ratios of nLMS?CS?SA composite scaffolds as a function of time

2.4 溶脹率

圖5 給出nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料溶脹率隨時(shí)間的變化.各組材料均表現(xiàn)出相似的溶脹過程和優(yōu)秀的親水性，浸入水中后較快發(fā)生親水溶脹，且在1 h后溶脹速度變化基本趨于穩(wěn)定.圖6給出24 h時(shí)nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的溶脹率.由圖6可見，隨著nLMS含量逐漸增加，nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的溶脹率先降低后增高.2%nLMS-CS-SA和3%nLMS-CS-SA組的溶脹率均低于0nLMS-CS-SA組，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.

Fig.6 Swelling ratios of nLMS?CS?SA composite scaffolds at 24 h

Fig.7 Mass loss curves of nLMS?CS?SA composite scaffolds in vitro

2.5 體外降解性能

圖7 給出nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的體外降解曲線.所有組別的降解曲線基本都呈線性，其中空白組支架的降解最快，在第28 d時(shí)降解率達(dá)到70%左右.當(dāng)所用nLMS溶液的濃度在1%～3%區(qū)間內(nèi)時(shí)，所制備的nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的降解率依次降低.4%nLMS-CS-SA的降解率介于1%nLMSCS-SA和2%nLMS-CS-SA組之間，3%nLMS-CS-SA的降解速率在第49 d時(shí)仍小于60%（P＜0.01）.

2.6 力學(xué)性能

圖8 給出所制備的nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的彈性模量.可以看出，加入nLMS后，在所測試區(qū)間內(nèi)復(fù)合支架材料的彈性模量與nLMS的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無明顯相關(guān)性.

Fig.8 Elastic modulus of nLMS?CS?SA composite scaffolds

Fig.9 RGR of nLMS?CS?SA composite support

2.7 生物相容性

檢測不同nLMS含量的nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞在48 h時(shí)CCK-8的吸光度值并計(jì)算各個(gè)組的細(xì)胞相對增殖率（RGR）值，各組材料浸提液的細(xì)胞毒性結(jié)果見圖9.各組細(xì)胞增殖率差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其中，1%nLMS-CS-SA組（RGR=101.46%），2%nLMS-CS-SA組（RGR=104.73%），3%nLMS-CS-SA組（RGR=154.52%）和4%nLMS-CS-SA組（RGR=147.57%）細(xì)胞毒性為0級(jí)，0nLMS-CS-SA組RGR=98.73%的細(xì)胞毒性為1級(jí).

2.8 討 論

在骨組織工程中，理想的骨支架材料應(yīng)具有一定的機(jī)械強(qiáng)度、適宜的理化性能和良好的生物相容性［8，9］.大量研究表明，單一組分的骨支架材料往往功能單一，難以具備理想支架材料的性能［10］.將不同骨支架材料人工合成為復(fù)合材料可以彌補(bǔ)單一組分材料的不足.殼聚糖［11］和海藻酸鈉［12］形成的聚電解質(zhì)天然高分子化合物以其良好的生物活性、無毒性及易降解等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用于骨組織工程領(lǐng)域，在骨重建與骨修復(fù)中展示出巨大潛能［5，13，14］.硅酸鎂鋰是一種人工合成的具有2D結(jié)構(gòu)的納米級(jí)材料［15］.研究表明，硅酸鎂鋰能促進(jìn)細(xì)胞的增殖、黏附及成骨分化.即使在不含成骨誘導(dǎo)因子的體外環(huán)境中，硅酸鎂鋰也能促進(jìn)干細(xì)胞的成骨分化進(jìn)程［16］.本文將兩種有機(jī)材料殼聚糖、海藻酸鈉與無機(jī)材料納米硅酸鎂鋰復(fù)合在一起，各物質(zhì)間通過氫鍵及各種分子間作用力進(jìn)行有機(jī)整合，最終制備出一種新型復(fù)合骨支架材料.

疏松多孔的骨支架材料有利于骨缺損的重建與修復(fù).研究表明，在保證一定物理機(jī)械強(qiáng)度的條件下，支架的孔隙率應(yīng)盡可能地大（一般認(rèn)為應(yīng)大于70%）.較高的孔隙率可提供足夠大的表面積，有利于細(xì)胞和支架的相互作用.大小適宜的孔徑和孔隙的貫通性既便于細(xì)胞的遷移擴(kuò)散和新生組織結(jié)構(gòu)的生長，又有利于營養(yǎng)代謝過程和各種物質(zhì)的交換［8］.骨支架材料應(yīng)與骨組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)相似，其孔徑介于200~400 μm之間，接近機(jī)體骨單元大小［17］.本文合成的5組支架材料孔隙率介于60%～75%之間，均具有相似的疏松多孔結(jié)構(gòu)，其縱斷面在掃描電子顯微鏡下均呈現(xiàn)出比較均勻的片層狀，孔徑大小可達(dá)180 μm以上且高度連通.

實(shí)驗(yàn)采用的殼聚糖、海藻酸鈉與納米硅酸鎂鋰3種原材料均具有良好的生物活性.傅里葉變換紅外光譜顯示，在合成殼聚糖-海藻酸鈉-納米硅酸鎂鋰新型復(fù)合骨支架材料的整個(gè)過程中并未發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不僅無新物質(zhì)生成，也不會(huì)產(chǎn)生有毒的降解產(chǎn)物.細(xì)胞細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組材料細(xì)胞相對增值率為0級(jí)或1級(jí)，表明此種新型復(fù)合骨支架材料具有良好的生物相容性.復(fù)合支架材料中的硅酸鎂鋰發(fā)生溶脹，使鎂離子和鋰離子析出，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖活性的提高［18］.

制備的新型支架均具有良好的親水性，在0.5 h內(nèi)吸水溶脹率顯著上升，在1~48 h范圍內(nèi)，溶脹曲線逐漸趨于平穩(wěn).其中硅酸鎂鋰的添加量會(huì)直接影響支架材料的溶脹率，當(dāng)所用nLSM溶液的濃度由1%增加到3%時(shí)，所得nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的溶脹率逐漸下降，3%nLMS-CS-SA的溶脹率最低.這是由于nLSM具有良好的親水性，當(dāng)支架中nLSM比例較少時(shí)，可以增加支架的親水能力，最終表現(xiàn)為溶脹率的增加.但當(dāng)支架中nLSM含量逐漸增加時(shí)，其質(zhì)量因素比親水因素對支架的吸水溶脹率影響更大，表現(xiàn)為支架的吸水溶脹率逐漸減小.但當(dāng)所用nLMS溶液的濃度為4%時(shí)，所得復(fù)合支架材料的溶脹率又轉(zhuǎn)而增大，這是由于復(fù)合體系原本維持一種均勻分散的狀態(tài)，當(dāng)nLSM濃度進(jìn)一步增加時(shí)會(huì)打破這種臨界平衡.復(fù)合體系難以在電荷作用下均勻分散，從而出現(xiàn)局部的聚集、沉淀，造成局部結(jié)構(gòu)的塌陷和斷裂，導(dǎo)致材料內(nèi)部孔隙不均勻增大，允許更多的水分子的進(jìn)入.

骨支架材料應(yīng)具有一定的降解速率，具有可被宿主酶和其它生物過程降解的特性.但降解速率不能過快或過慢，應(yīng)在保證其足夠骨支撐強(qiáng)度的同時(shí)又能允許組織細(xì)胞向內(nèi)部逐漸生長.隨著時(shí)間推移，降解的支架結(jié)構(gòu)被新生組織替代，以維持局部空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定.本文制備的各組支架材料均具有良好的降解性，其中3%nLMS-CS-SA組復(fù)合支架材料降解最慢.這可能是由于高濃度的nLSM使分子間作用力增強(qiáng)，抑制了nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料中的聚合物分子向溶劑體系中擴(kuò)散.雖然加入nLSM后的nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料的降解速率相比對照組有所減慢，但仍短于一些學(xué)者提出的6個(gè)月的降解時(shí)間［19］.這可能是本文工作是在體外模擬環(huán)境下進(jìn)行，忽略了生物體內(nèi)多種酶消化作用和吞噬細(xì)胞等的分解作用.

骨支架材料應(yīng)具有一定的骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性，單一的骨支架材料骨形成活性較低，因此人們通過在骨支架材料上負(fù)載生長因子或包載某些生物信號(hào)來促進(jìn)干細(xì)胞的增殖、黏附和成骨分化.本文用到的殼聚糖可促進(jìn)細(xì)胞的黏附，其原理是利用側(cè)鏈上的氨基基團(tuán)與細(xì)胞膜相關(guān)蛋白結(jié)合［20］.微血管結(jié)構(gòu)的形成亦可影響骨支架材料的骨修復(fù)能力，硅酸鎂鋰通過促進(jìn)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的黏附和遷移來發(fā)揮促成血管活性，并為新生的組織結(jié)構(gòu)提供營養(yǎng)支持［21］.此外，硅酸鎂鋰在體內(nèi)和體外的降解產(chǎn)物Mg2+，Si（OH）4和Li+可上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，并促進(jìn)Ⅰ型膠原合成，從而發(fā)揮 成 骨誘導(dǎo)活性.

3 結(jié)論

通過溶液-凝膠法和冷凍干燥技術(shù)合成了nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料，其合成過程容易，操作簡單，產(chǎn)物形態(tài)可塑，凍干后大小、形狀與所在容器一致.由于患者骨缺損處大小形態(tài)不一，因此具有良好可塑性及疏松多孔三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料有望應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的個(gè)性化設(shè)計(jì).摻入nLMS的nLMS-CS-SA復(fù)合支架材料孔隙率下降，但在親水溶脹性和穩(wěn)定性方面更具優(yōu)勢，且無細(xì)胞毒性，體外降解時(shí)間延長，并具有良好的細(xì)胞相容性.