李德林 張子俠

【摘 要】 目的：建立烏三金洗劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：薄層色譜法（TLC）對烏三金洗劑處方中黃柏、苦參、大黃、蛇床子及土荊皮進(jìn)行定性鑒別;高效液相色譜法（HPLC）對烏三金洗劑中蛇床子素含量進(jìn)行測定研究。以Wonda Cract ODS2（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱;以乙腈-水（70∶30）為流動相;檢測波長為322 nm;柱溫設(shè)置30 ℃;流速設(shè)置1.0 mL/min。結(jié)果：黃柏、苦參、大黃、蛇床子及土荊皮薄層鑒別專屬性強(qiáng)，特征斑點(diǎn)清晰，且陰性對照無干擾，可作為烏三金洗劑的定性鑒別。蛇床子素在12.63～252.60 μg范圍內(nèi)與峰面積呈較好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=0.0606X-0.0062（r=0.9999），平均回收率為96.45%，RSD=0.93%（n=6）。結(jié)論：該法操作準(zhǔn)確、簡便，專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性及重復(fù)性良好，可有效控制烏三金洗劑的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】 烏三金洗劑;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);色譜法;高壓液相;蛇床子素

【中圖分類號】R284.1?? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2021）24-0035-06

Study on Quality Standard of Wusanjin Lotion

LI Delin ZHANG Zixia

Taihe Traditional Chinese Medicine Hospital，Taihe 236600，China

Abstract：Objective To establish the quality standard of Wusanjin Lotion.Methods The contents of Cortex Phellodendri，Radix Sophorae Favescentis，Radix et Rhizoma Rhei，Cnidii Fructus and Cortex Pseudolaricis in Wusanjin Lotion were identified by TLC method. The contents of osthol in Wusanjin Lotion were determined by HPLC method. This method was employed on an Wonda Cract ODS2 column （4.6 mm×250 mm，5 μm） at 30 degrees Celsiu with a mobile phase consisting of acetonitrile-water （70∶30） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 322 nm.Results TLC spots of Cortex Phellodendri，Radix Sophorae Favescentis，Radix et Rhizoma Rhei，Cnidii Fructus and Cortex Pseudolaricis were clear and negative without interference，which can be used as method. which can be used as qualitative method. The contents of osthol had good linearity within the ranges of 12.63 μg～252.60 μg and equation was Y=0.0606X-0.0062（r=0.9999），The average recovery of osthol was 96.45% and RSD was 0.93%（n=6）.Conclusion The method was simple，accurate，with good specificity and reproducibility，and can be used for the quality of Wusanjin Lotion.

Key words：Wusanjin Lotion; Quality Standard; Chromatography; High Pressure Liquid; Osthol

帶下病是目前臨床發(fā)病率較高且難以治愈的婦科疾病之一，西醫(yī)中的陰道炎、宮頸炎、盆腔炎性等疾病均屬于此范疇，該病具有慢性纏綿且易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)，給廣大女性身心健康帶來了很大的困擾[1]。因此，尋找有效、持久、低毒的治療女性帶下病藥物十分必要。現(xiàn)代基礎(chǔ)及臨床研究[2]表明，中醫(yī)藥在治療女性帶下病上不僅療效顯著，且作用持久不易復(fù)發(fā)，適合長期使用。烏三金洗劑由烏梅、土荊皮、黃柏、大黃及苦參等十味中藥組成，功能除濕祛毒、殺蟲止癢。處方遵照中醫(yī)理論，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，提出“蟲邪外感、濕熱蘊(yùn)結(jié)”，是從“濕”“毒”“蟲”著手來研究揭示“帶下病”的一般病機(jī)規(guī)律，采取辨病與辯證的方法，針對濕毒蘊(yùn)膚型皮膚黏膜疾病所擬定的方劑。本制劑在我院已應(yīng)用多年，臨床效果較好，然而尚缺乏有效的質(zhì)量控制方法，為了更好的保證制劑質(zhì)量及臨床用藥的安全性和有效性，本研究采用TLC法對烏三金洗劑中黃柏、苦參、大黃、蛇床子及土荊皮進(jìn)行定性鑒別研究，并采用HPLC法對烏三金洗劑中蛇床子素含量進(jìn)行測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器 XSE105DU型十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多）;Ultimate 3000型高效液相色譜儀（賽默飛）;PHS-2F型pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）;ZF-2型三用紫外儀（上海市安亭電子儀器廠）;DHG-9055A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國宇儀器制造有限公司）;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（上海杰理科技有限公司）。

1.2 試藥 大黃對照藥材（批號：120984-201202）、鹽酸小檗堿（批號：110713-201613）、蛇床子素（批號：110822-201609）、苦參堿（批號：110805-200508）、土荊皮乙酸對照品（批號：110880-201604）等均購自中國食品藥品檢定研究院。烏三金洗劑（規(guī)格：每瓶250 mL，本院中藥制劑室自制，批號：20170824，20170825，20170826）。蛇床子、黃柏、烏梅、大黃等十味中藥均購自于安徽守正中藥飲片有限公司，并經(jīng)本院馬德強(qiáng)主任中藥師鑒定，均符合2015年版《中國藥典》一部及2019年版《安徽省中藥飲片炮制規(guī)范》要求;乙腈為色譜純，水為純化水，甲醇、乙醚、乙酸乙酯等其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

2.1.1 黃柏 取烏三金洗劑10 mL，加甲醇10 mL超聲處理20 min，離心，取上清液作為供試品溶液[3-4];另取鹽酸小檗堿對照品適量，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液;再按烏三金洗劑制備工藝生產(chǎn)不含黃柏的樣品，同法制得缺黃柏陰性對照溶液。照TLC法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以正丁醇-冰醋酸-水（6∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與鹽酸小檗堿對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見，分離效果較好，陰性無干擾，專屬性較好，三批烏三金洗劑均檢出黃柏。結(jié)果如圖1所示。

2.1.2 苦參 取烏三金洗劑10 mL，滴加濃氨水將溶液pH調(diào)至10～11，氯仿振搖提取3次，每次15 mL，合并提取液，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液[5-6];另取苦參堿對照品適量，加甲醇制成每1毫升含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液;再按烏三金洗劑制備工藝生產(chǎn)不含苦參的樣品，同法制得缺苦參陰性樣品溶液。照TLC法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-丙酮-乙酸乙酯-濃氨試液（2∶3∶4∶0.2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液并吹干。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與苦參堿對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的橘紅色斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見，分離效果較好，且陰性對照無干擾，專屬性較好，三批烏三金洗劑均檢出苦參。結(jié)果如圖2所示。

2.1.3 大黃 ?取烏三金洗劑10 mL，加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷水冷卻至室溫，以無水乙醚提取2次，每次20 mL，合并提取液，蒸干，殘?jiān)勇确? mL使溶解，即得供試品溶液[7-8];另取大黃對照藥材0.1 g，加甲醇20 mL，超聲30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，余下同供試品溶液制備方法，作為對照藥材溶液;再按烏三金洗劑制備工藝生產(chǎn)不含大黃的樣品，同法制得缺大黃陰性對照溶液。照TLC法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以甲酸乙酯-石油醚（30～60 ℃）-甲酸（5∶15∶1）上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與大黃對照藥材溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，置氨蒸氣熏后，斑點(diǎn)變?yōu)榧t色，清晰可見，且陰性樣品無干擾，專屬性較好，三批烏三金洗劑均檢出大黃。結(jié)果如圖3所示。

2.1.4 蛇床子 取烏三金洗劑20 mL，用無水乙醚振搖萃取2次，每次30 mL，乙醚層合并，加入10 mL碳酸氫鈉飽和溶液振搖提取，乙醚層蒸干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，即得供試品溶液[9-10];另取蛇床子素對照品適量，加乙醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液;再按烏三金洗劑制備工藝生產(chǎn)不含蛇床子的樣品，同法制得缺蛇床子陰性對照溶液。照TLC法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品及陰性對照溶液各10 μL，對照品溶液5 μL，以正己烷-乙酸乙酯（17∶4）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見，分離效果較好，且陰性對照無干擾，專屬性較好，三批烏三金洗劑均檢出蛇床子。結(jié)果如圖4所示。

2.1.5 土荊皮 取烏三金洗劑30 mL，濃縮至稠，加硅膠（100-200目）5 g拌勻，干燥至干，研勻，加乙醚30 mL超聲30 min，濾過，取濾液，用5%碳酸氫鈉溶液30 mL提取，取碳酸氫鈉溶液，滴加稀鹽酸調(diào)pH為1～2，以乙醚30 mL提取，乙醚提取液用水10 mL洗滌，取乙醚層，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，即得供試品溶液[11];另取土荊皮乙酸對照品適量，加甲醇制成每1毫升含1 mg的對照品溶液。再按烏三金洗劑制備工藝生產(chǎn)不含土荊皮的樣品，同法制得缺土荊皮陰性對照溶液。照TLC法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述供試品及陰性對照溶液各10 μL，對照品溶液5 μL，以石油醚（30-60 ℃）-三氯甲烷-冰醋酸（6∶10∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以4%香草醛乙醇溶液-20%硫酸溶液（1∶1，臨用前混合）的混合溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與土荊皮乙酸對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)清晰可見，分離效果較好，且陰性對照無干擾，專屬性較好，三批烏三金洗劑均檢出土荊皮。結(jié)果如圖5所示。

2.2 蛇床子素HPLC含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：島津Wonda Cract ODS2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動相：乙腈-水（70∶30）;流速：1.0 mL/min;柱溫設(shè)置為30 ℃;檢測波長為322 nm;理論塔板數(shù)按蛇床子素峰計應(yīng)不得低于3000，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 取蛇床子素對照品適量，精密稱定，加乙醇制成每1毫升含12.63 μg的蛇床子素對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 精密吸取本品25mL，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次25 mL，合并乙酸乙酯提取液，乙酸乙酯提取液置水浴上蒸干，殘?jiān)右掖歼m量溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得[12-13]。

2.2.2.3 陰性對照溶液的制備 按烏三金洗劑處方和制備工藝制備缺蛇床子的陰性樣品，再按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備缺蛇床子陰性對照溶液。

2.2.3 專屬性試驗(yàn) 按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別吸取上述供試品溶液、蛇床子素對照品溶液和陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀中，記錄各自色譜圖。結(jié)果供試品色譜中，在與對照品色譜相同的保留時間內(nèi)出現(xiàn)蛇床子素色譜峰，且蛇床子素分離度及拖尾因子均符合要求，而陰性對照無干擾，故該法專屬性良好。結(jié)果如圖6所示。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.2.1”項(xiàng)下的蛇床子素對照品溶液適量，置自動進(jìn)樣器中，分別吸取1、2、5、10、15、20 μL于液相色譜儀中，再按上述“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并記錄峰面積。并以蛇床子素對照品進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果得蛇床子素的回歸方程為：Y= 0.0606X- 0.0062（r=0.9999），以上結(jié)果表明蛇床子素在進(jìn)樣量為12.63 ～ 252.60 μg范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2.1”項(xiàng)下蛇床子素對照品溶液適量，置自動進(jìn)樣器中，按“2.2.1”下的色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定蛇床子素峰面積。結(jié)果蛇床子素平均峰面積為6.539，RSD為0.26%（n=6），說明該儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取烏三金洗劑（批號：20170824）25 mL，按“2.2.2.2”下制備方法制備供試品溶液，再按上述色譜條件，將供試品溶液置于自動進(jìn)樣器中，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定，并記錄蛇床子素峰面積，結(jié)果蛇床子素平均峰面積為7.814。RSD為0.11%（n=6），表明烏三金洗劑供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批次的烏三金洗劑6份（批號：20170824），每份25 mL，按上述“2.2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，置于自動進(jìn)樣器中，再按上述“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測定蛇床子素峰面積。結(jié)果蛇床子素平均峰面積為7.762，RSD為0.56%（n=6）。表明該方法重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的烏三金洗劑6份（批號：20170824），每份12.5 mL，分別精密加入蛇床子素對照品適量，按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，置于自動進(jìn)樣器中，再按上述“2.2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，測定蛇床子素峰面積并計算其蛇床子素加樣回收率。結(jié)果6份樣品的平均回收率為96.45%，RSD為0.93%（n=6）。表明樣品回收率良好，該法準(zhǔn)確度較高。

2.2.9 樣品含量測定及含量限度的確定 通過投料前對蛇床子藥材中蛇床子素含量測定，以及生產(chǎn)的成品中蛇床子素的含量比較，計算得到該工藝蛇床子素的轉(zhuǎn)移率。結(jié)果表明，蛇床子飲片中蛇床子素含量為2.94 %，根據(jù)處方換算，烏三金洗劑中蛇床子素的理論含量為1.0584 mg/mL，即制成制劑后每毫升含蛇床子素為1.0584 mg。實(shí)際生產(chǎn)中，批號為20170824、20170825、20170826三批樣品中蛇床子素的含量分別為12.84 μg/mL、12.67 μg/mL、12.65 μg/mL，轉(zhuǎn)移率分別為1.21%、1.20%、1.19%，平均轉(zhuǎn)移率為1.20%。根據(jù)中國藥典2015年版一部規(guī)定：蛇床子飲片中蛇床子素的含量不得少于1.0%，因此，制成制劑后含量限度確定為：每毫升含蛇床子以蛇床子素（C15H16O3）計，不得少于4.32 μg，三批樣品所測得含量，每毫升含蛇床子素均高于4.32 μg。結(jié)果見表1。

3 討論

3.1 薄層鑒別 黃柏薄層鑒別時，參考相關(guān)文獻(xiàn)[14-15]，同苦參處理方法，將樣品堿化后用氯仿提取，結(jié)果顯示樣品主斑點(diǎn)雖較為清晰，但陰性樣品在與對照品溶液色譜處有微弱干擾，考慮到此法在提取親脂性生物堿的同時，也帶來親脂性雜質(zhì)，遂改用醇類溶劑提取法，采用甲醇直接超聲，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，陰性無干擾，且該法更為簡單?？鄥⒈予b別時，以丙酮-甲苯-甲醇（3 ∶8∶0.5）為展開劑，再以乙酸乙酯-甲苯-甲醇-水（4∶2∶2∶1）上層溶液為展開劑，結(jié)果斑點(diǎn)雖較為清晰，陰性無干擾，但操作較為復(fù)雜，且甲苯對環(huán)境及人體的健康危害較大，故改用乙酸乙酯-環(huán)己烷-丙酮-濃氨試液（4∶2∶3∶0.2）為展開劑，效果較為理想。此外，本研究還對方中烏梅、百部、地膚子及花椒等藥味進(jìn)行了薄層鑒別研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)百部及地膚子陰性對照有干擾，花椒及烏梅因主要含有揮發(fā)性成分，本制劑在傳統(tǒng)水提工藝下，尚不能對兩者揮發(fā)性成分充分提取，故與對照藥材相比，主斑點(diǎn)較不清晰，暫未納入烏三金洗劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

3.2 提取方法的優(yōu)化 因蛇床子在方中作為君藥，蛇床子素作為蛇床子藥材中含量最高且主要藥理活性成分，有研究[16]報道其具有較好的止癢、抗菌及增強(qiáng)免疫功能等作用，可治療陰道炎及外陰濕疹等婦科疾病，與烏三金洗劑的主要功效尤為相似，故本研究擬將其作為烏三金洗劑HPLC測定的指標(biāo)性成分。蛇床子素屬于香豆素類化合物，文獻(xiàn)報道[17-18]，蛇床子及其制劑中蛇床子素中的提取方法有乙酸乙酯萃取、乙醚萃取及甲醇超聲提取等。研究前期曾對以上方法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙酸乙酯萃取提取率較高，并對萃取次數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示乙酸乙酯萃取4次蛇床子素含量較萃取3次高，而與萃取5次相差不大，說明萃取4次可提取完全，故本研究以乙酸乙酯萃取4次作為蛇床子素的最佳提取方法。

3.3 流動相和色譜柱的考察 烏三金洗劑為中藥復(fù)方制劑，方中干擾成分較多，流動相的優(yōu)化和色譜柱的選擇對樣品的分離有著重要的影響。研究曾參考相關(guān)文獻(xiàn)對甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液及乙腈-水進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有機(jī)相為乙腈時，理論塔板數(shù)較甲醇高，且出峰時間較短，無機(jī)相為水或磷酸水溶液對峰形影響不大。此外，研究又對不同品牌的色譜柱（Thermo Syncronis C18、Hypersil ODS2及Wonda Cract ODS2）進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Thermo Syncronis C18柱上蛇床子素分離度較差，Wonda Cract ODS2較Hypersil ODS2出峰時間短且分離效果較好。故本研究選擇以乙腈-水溶液和Wonda Cract ODS2柱作為最佳流動相和色譜柱。

綜上所述，研究建立的黃柏、苦參、大黃、蛇床子及土荊皮的TLC陰性對照無干擾、斑點(diǎn)清晰且專屬性較強(qiáng)。蛇床子素的HPLC含量測定方法簡便易行，重現(xiàn)性較好，為控制和評價烏三金洗劑的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。然而由于受條件限制，本實(shí)驗(yàn)僅涉及單一成分的含量測定，還不能從整體上完全反映烏三金洗劑的內(nèi)在質(zhì)量，故下一步本研究擬采用指紋圖譜技術(shù)對該制劑進(jìn)行深層次的探究，以建立起更完整的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

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（收稿日期：2021-04-28 編輯：陶希睿）