快速固相萃取/超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定水產(chǎn)品中25種磺酰脲類及磺酰胺類除草劑殘留

朱富強，吳樹棟，韓巖君，郭宇鵬

（濱州市檢驗檢測中心，山東 濱州 256600）

磺酰脲類和磺酰胺類除草劑在世界農(nóng)藥市場中占有重要地位，兩者應(yīng)用范圍廣、用量大，對于水稻、玉米、大豆、小麥、甜菜、油菜等作物的雜草防治具有良好效果［1－3］?；酋ｋ孱惓輨┖突酋０奉惓輨┰谑┯眠^程中易通過地表徑流和滲透進入水環(huán)境中，污染養(yǎng)殖水體，進而影響水體生物的生長發(fā)育，造成水產(chǎn)品質(zhì)量安全隱患，危害消費者健康。我國農(nóng)業(yè)部公告第2032號［4］規(guī)定，于2015年12月31日起全面禁止使用氯磺隆，于2017年7月1日起全面禁止使用胺苯磺隆及甲磺隆，并在GB2763－2019［5］中規(guī)定了多種磺酰脲類及磺酰胺類除草劑在食品中的最大殘留限量，但尚未制定在動物源性食品中的最大殘留限量。日本肯定列表制度中規(guī)定了動物源性食品中磺酰脲類及磺酰胺類除草劑的最大殘留限量［6］，如噻吩磺隆及苯磺隆在豬肉等肉類中的最大殘留限量為0.01 mg/kg，磺?；锹≡隰~類、軟體動物、甲殼綱動物中的最大殘留限量為0.005 mg/kg，唑嘧磺草胺在雞肉、肝臟、蛋和奶中的最大殘留限量為0.1 mg/kg。因此，建立水產(chǎn)品中磺酰脲類及磺酰胺類除草劑的檢測方法，對于保障進出口貿(mào)易、保護人民健康具有重要意義。

目前，文獻報道的水產(chǎn)品等動物源性食品中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要有氣相色譜法（GC）［7－8］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法（GC－MS）［9－10］、氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（GC－MS/MS）［11－12］、液相色譜法（HPLC）［13－14］及液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（LC－MS/MS）［15－16］等，樣品凈化方式通常采用固相萃取法（SPE）［17－18］和QuEChERS法等［19－20］。傳統(tǒng)的SPE方法操作費時、步驟繁瑣，影響結(jié)果穩(wěn)定性和檢驗效率，不能滿足大批量樣品的高通量、快速檢測要求。QuEChERS法具有便捷、高效、適用范圍寬等優(yōu)點，但凈化效果往往不如SPE法，且在實際應(yīng)用過程中需對各吸附凈化劑（如N-丙基乙二胺、十八烷基硅烷鍵合硅膠、石墨化碳黑等）以及鹽析劑的用量進行優(yōu)化［15－16，19－20］。SHIMSEN QVet－NM+固相萃取柱使用新一代的固相萃取吸附劑，無需活化、淋洗、洗脫，可直接將提取液上樣在正壓下過濾除去雜質(zhì)，實現(xiàn)通過式一步凈化，過程簡便、高效。本文針對不同基質(zhì)類型的水產(chǎn)品，采用SHIMSEN QVet－NM+固相萃取柱凈化，以超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC－MS/MS）法測定樣品中25種磺酰脲及磺酰胺類農(nóng)藥殘留。該方法凈化效率高、操作便捷，且靈敏度高、準(zhǔn)確性好，可為水產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留風(fēng)險監(jiān)控提供借鑒與參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC I－Class超高效液相色譜儀、Xevo TQ－XS三重四極桿質(zhì)譜儀（美國Waters公司）；AccucoreTMaQ C18色譜柱（2.1 mm×50mm×2.6 μm，美國Thermo Fisher公司）；Shim－pack GIST C18色譜柱、MultiS－100渦旋混合器（島津（上海）實驗器材有限公司）；3－18K5離心機（德國Sigma公司）；CP225D電子分析天平（德國Sartorius公司）；Milli－Q Advantage A10超純水儀（美國Millipore公司）。

甲醇、乙腈（HPLC級，德國Merck公司）；甲酸（純度＞99%，美國ACS恩科化學(xué)公司）；超純水（電阻率≥18.2 MΩ?cm）；SHIMSEN QVet－NM+固相萃取柱（5mL/5g）、SHIMSEN QuEChERS提取鹽包（含1g氯化鈉、4g硫酸鎂、0.5 g檸檬酸二鈉鹽水合物、1g無水檸檬酸鈉，島津（上海）實驗器材有限公司）；尼龍針式濾器（0.22 μm，上海安譜科技有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)品：醚磺?。?00μg/mL）、甲酰胺磺隆（100μg/mL）、氯酯磺草胺（100μg/mL）、玉嘧磺?。?000μg/mL）購自AccuStandard公司；甲基噻吩磺隆、吡嘧磺隆的質(zhì)量濃度均為100μg/mL，購自ANPEL公司；氟唑嘧磺草胺的質(zhì)量濃度為100μg/mL，購自BePure公司；氟磺隆、氟嘧磺隆、氟胺磺隆、五氟磺草胺、雙氯磺草胺、醚苯磺隆、甲磺隆、雙氟磺草胺、氯磺隆、四唑嘧磺隆、環(huán)丙嘧磺隆的質(zhì)量濃度均為100μg/mL，購自First Standard公司；苯磺?。?00μg/mL）購自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；氯嘧磺隆的質(zhì)量濃度為100μg/mL，購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司；咪唑磺隆、嘧啶磺隆、磺酰磺隆、乙氧嘧磺隆、胺苯磺隆的純度均≥99%，購自Dr.Ehrenstorfer公司，各準(zhǔn)確稱取10.0 mg，用甲醇稀釋定容至100mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度均為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于－20℃避光保存。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

各準(zhǔn)確移取一定量25種待測化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液至50mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至刻度，配制成1μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，于－20℃低溫保存。臨用前，用空白樣品提取液配制成系列質(zhì)量濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品前處理

分別取草魚、鯉魚、鯽魚、克氏原螯蝦、南美白對蝦、文蛤的可食部分進行均質(zhì)，準(zhǔn)確稱取2g試樣（精確至0.01 g）至50mL離心管中，加入10.0 mL超純水，渦旋1min，再準(zhǔn)確加入10.0 mL乙腈，渦旋提取5min，然后加入SHIMSEN QuEChERS提取鹽包，劇烈振搖1min，以8000r/min離心5min。取5mL上清液通過SHIMSEN QVet－NM+固相萃取柱，以1滴/s的流速加壓萃取，收集濾液，準(zhǔn)確吸取500μL濾液與500μL超純水混合，過0.22 μm有機微孔濾膜后，待測。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：Shim－pack GIST C18色譜柱（2.1 mm×50mm×2.0 μm）；柱溫為40℃；進樣體積為5μL；流速為0.40 mL/min；流動相：A為0.1 %甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序為：0～2.8 min，10%～70% B；2.8 ～2.9 min，70%～95% B；2.9 ～3.9 min，95% B；3.9 ～4.0 min，95%～10% B；4.0 ～6.0 min，10%B。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離（ESI）源，正、負(fù)離子模式同時掃描；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；離子源溫度：150℃；毛細(xì)管電壓：2.00 kV；脫溶劑氣溫度：600℃；脫溶劑氣流量：1000L/h；錐孔反吹氣流量：150L/h；碰撞氣流量：0.15 mL/min。25種除草劑的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的選擇

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 以0.1 %甲酸水溶液－乙腈（30∶70）為流動相，采用流動注射的方式，對待測化合物的質(zhì)譜條件進行優(yōu)化。在電噴霧正、負(fù)離子同時監(jiān)測模式下，優(yōu)化離子源溫度、脫溶劑氣溫度、毛細(xì)管電壓、錐孔電壓等參數(shù)，使目標(biāo)物母離子的響應(yīng)信號強度達到最佳，并進行二級質(zhì)譜掃描，確定定性離子和定量離子，在多反應(yīng)監(jiān)測模式下優(yōu)化碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化 分別考察了AccucoreTM aQ C18色譜柱（2.1 mm×50mm×2.6 μm）和Shimpack GIST C18色譜柱（2.1 mm×50mm×2.0 μm）對25種待測化合物的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用后者作為分離柱時各待測化合物的峰響應(yīng)值更高，且保留時間更為合理，故選用Shim－pack GIST C18色譜柱為分離柱。由于待測物大部分在正離子模式下測定，酸性條件有利于離子化，可增強其響應(yīng)值，故流動相A相采用0.1%甲酸水溶液。比較了乙腈、甲醇作為流動相B相對目標(biāo)物色譜分離行為的影響。結(jié)果表明，以甲醇作為流動相B相時，25種待測化合物的峰響應(yīng)值普遍較低，且乙氧嘧磺隆、醚磺隆的峰形拖尾明顯；以乙腈作為流動相B相時，25種待測化合物的峰響應(yīng)值均高于甲醇，且峰形尖銳，因此采用0.1%甲酸水溶液－乙腈作為流動相。MRM模式下25種待測化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg/L）的總離子流圖（TIC）見圖1。

圖1 MRM模式下25種待測化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10μg/L）的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of25analytes mixed standard solution（10μg/L）in MRM mode

2.2 樣品提取方法的優(yōu)化

本實驗嘗試采用甲醇、乙腈作為提取溶劑，結(jié)果顯示，由于水產(chǎn)品為高蛋白樣品，直接加入強極性有機溶劑后使蛋白質(zhì)迅速失水變性，導(dǎo)致樣品迅速結(jié)塊，影響待測化合物的提取效率。在加入提取溶劑前，加水稀釋使樣品分散均勻有利于待測化合物的提取。

進一步以陰性草魚樣品為實驗對象，在待測化合物加標(biāo)水平為10μg/kg條件下，首先加入10mL水使樣品分散，再分別加入10mL的不同提取溶劑（甲醇、1%甲酸甲醇、乙腈及1%甲酸乙腈），然后加入QuEChERS提取鹽包進行鹽析，考察各提取溶劑對待測化合物的提取效率。結(jié)果表明，經(jīng)甲醇或1%甲酸甲醇提取后，鹽析效果差，無法分層，且所得提取液較為渾濁，待測化合物的回收率普遍較低（0%～45.6%），其原因可能在于甲醇水溶液對干擾物的溶解能力強，共萃物較多，影響了待測化合物的測定。采用乙腈或1%甲酸乙腈作為提取溶劑時各待測化合物的回收率均大于62%，且兩者無明顯差異。為節(jié)約成本、安全環(huán)保，最終選用乙腈作為提取溶劑。

2.3 樣品凈化方式的選擇

經(jīng)乙腈提取后的樣品溶液中含有大量磷脂等脂溶性化合物，會干擾待測化合物測定，且影響儀器性能。為降低基質(zhì)干擾，提高方法的準(zhǔn)確性和靈敏度，減少對色譜柱、質(zhì)譜檢測器的污染，須對樣品進行有效的凈化處理。SHIMSEN QVet固相萃取柱包括QVet－AG+、QVet－HP+、QVet－NM+等型號，前兩者主要應(yīng)用于高極性化合物，后者的適用范圍寬，可應(yīng)用于不同類型化合物的凈化。考慮到待測化合物的理化性質(zhì)，因此選擇SHIMSEN QVet－NM+快速固相萃取柱對提取液進行凈化。采用通過式固相萃取凈化策略，將5mL樣品提取溶液直接加載至固相萃取柱以除去磷脂等雜質(zhì)，過程簡便、快速、高效。為考察其凈化效果，參考文獻［21］的方法，通過采集m/z184前體離子，得到磷脂類化合物的含量信息。圖2為經(jīng)SHIMSEN QVet－NM+固相萃取柱凈化前后空白草魚樣品溶液的m/z184的TIC圖，可見，經(jīng)凈化后有效去除了磷脂類化合物，表明該方法的凈化效果顯著。

圖2 采用快速固相萃取柱凈化前（A）和凈化后（B）的空白草魚樣品檢測效果比較Fig.2 Comparison of blank grass carp samples before（A）and after（B）rapid solid phase extraction

2.4 進樣溶劑的優(yōu)化

凈化后所得濾液的溶劑為乙腈，將濾液直接上機測試，發(fā)現(xiàn)所有待測化合物的峰形較寬、峰前拖尾，峰面積重現(xiàn)性較差，其原因為樣品溶劑的洗脫強度大于流動相的洗脫強度，溶劑效應(yīng)導(dǎo)致峰變形及柱效降低。本文采用稀釋法減小溶劑效應(yīng)，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，取500μL濾液與500μL超純水混合后進樣分析，所有待測化合物的峰形均正常，且不會對檢出限造成較大影響，故最終采用將濾液用超純水稀釋1倍后進樣分析。

2.5 樣品基質(zhì)效應(yīng)的考察

在LC－MS/MS分析中，基質(zhì)效應(yīng)（ME）是影響定性定量結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一。計算公式為：ME=（基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線斜率/溶劑配制校準(zhǔn)曲線斜率－1）×100%［22］。|ME|＜20%為弱基質(zhì)效應(yīng)，20%≤|ME|≤50%為中等程度基質(zhì)效應(yīng)，|ME|＞50%為強基質(zhì)效應(yīng)。由表2可知，25種待測化合物在草魚、南美白對蝦、文蛤中均表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)（ME＜0）；在草魚基質(zhì)中，玉嘧磺隆、氯磺隆、醚苯磺隆、氟磺隆表現(xiàn)為中等程度基質(zhì)效應(yīng)；在南美白對蝦基質(zhì)中，苯磺隆、玉嘧磺隆、磺?；锹　⒓谆锹?、醚苯磺隆、氟磺隆表現(xiàn)為中等程度基質(zhì)效應(yīng)；在文蛤基質(zhì)中，氟唑嘧磺草胺、甲基噻吩磺隆、苯磺隆、醚磺隆、磺酰磺隆表現(xiàn)為中等程度基質(zhì)效應(yīng)。其余待測化合物在草魚、南美白對蝦、文蛤基質(zhì)中均為弱基質(zhì)效應(yīng)。為確保結(jié)果準(zhǔn)確性，選擇基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液外標(biāo)法進行定量分析。

表2 25種待測化合物在草魚、南美白對蝦及文蛤中的基質(zhì)效應(yīng)Table2 Matrix effects（ME）of25analytes in grass carp，penaeus vannamei and meretrix meretrix

2.6 線性關(guān)系與檢出限

分別采用草魚、南美白對蝦、文蛤空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為0.20 ～50μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按照前述的儀器條件進行測定，以待測化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/L），峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)（Y）建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。并以不同加標(biāo)水平下空白基質(zhì)樣品的儀器響應(yīng)為基準(zhǔn)，按信噪比S/N=3計算檢出限（LOD），S/N=10計算定量下限（LOQ）。在3種空白樣品中，25種待測化合物在0.20 ～50μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.994 ；LOD為0.30 ～1.3 μg/kg，LOQ為1.2 ～5.0 μg/kg。以草魚空白基質(zhì)為例，結(jié)果見表3。

表3 草魚空白基質(zhì)中25種待測化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量下限、回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table3 Linear equations，correlation coefficients（r2），LODs，LOQs，recoveries and RSDs（n=6）of25analytes in blank grass carp

2.7 加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

取草魚、南美白對蝦、文蛤空白基質(zhì)樣品，進行低、中、高3個濃度水平的加標(biāo)回收實驗，按上述實驗條件進行測定，每個加標(biāo)水平平行分析6次，計算各目標(biāo)物的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，該方法在草魚空白基質(zhì)中3個加標(biāo)水平下的回收率為62.7 %～117%，RSD為1.5 %～18%；在南美白對蝦空白基質(zhì)中的回收率為66.1 %～122%，RSD為1.8 %～17%；在文蛤空白基質(zhì)中的回收率為76.4 %～115%，RSD為0.72 %～11%。以草魚為例，各待測化合物的回收率和RSD見表3。

2.8 實際樣品的測定

應(yīng)用本方法對本實驗室在監(jiān)督抽檢中留存的10份水產(chǎn)品（包括草魚、鯉魚、鯽魚、克氏原螯蝦、南美白對蝦、文蛤）進行了測定，結(jié)果顯示所有樣品均未檢出待測化合物。

3 結(jié) 論

本文結(jié)合快速固相萃取技術(shù)，以超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜建立了水產(chǎn)品中25種磺酰脲類和磺酰胺類農(nóng)藥殘留的分析方法。該方法前處理簡便快速、凈化效果顯著，且靈敏度高、準(zhǔn)確性好，能夠準(zhǔn)確地對水產(chǎn)品中上述25種農(nóng)藥殘留進行定性定量分析，為水產(chǎn)品等動物源性食品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測與控制提供了一種新的可行途徑。