lncRNA SNHG16通過(guò)靶向miR-22-3p調(diào)控腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的分子機(jī)制

倪志福 汪曉玲 屈振繁 孫恒 王波

腎母細(xì)胞瘤是臨床常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其常發(fā)生于兒童時(shí)期，近年來(lái)，我國(guó)腎母細(xì)胞瘤發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重威脅患兒生命安全，目前臨床主要根據(jù)病理類(lèi)型評(píng)估腎母細(xì)胞瘤患兒的預(yù)后，但其具有極大的局限性，腎母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)制尚未闡明，因而探究腎母細(xì)胞瘤發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)提高其診斷效率及評(píng)估患兒預(yù)后均具有重要意義[1]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在腎母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，并可調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過(guò)程，還可能作為腎母細(xì)胞瘤靶向治療的潛在靶標(biāo)[2-4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA SNHG16(lncRNA SNHG16)在腎母細(xì)胞瘤中表達(dá)水平升高，并可調(diào)控miR-200a-3p的表達(dá)從而促進(jìn)腎母細(xì)胞瘤發(fā)生及發(fā)展[5]。靶基因預(yù)測(cè)顯示微小RNA-22-3p(miR-22-3p)與SNHG16存在結(jié)合位點(diǎn)，研究表明miR-22-3p在腎母細(xì)胞瘤中表達(dá)水平降低，并可通過(guò)靶向AKT3的表達(dá)從而調(diào)控細(xì)胞增殖及侵襲[6]。但SNHG16是否可通過(guò)調(diào)控miR-22-3p參與腎母細(xì)胞瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程尚未可知。因此，本研究主要探討SNHG16與miR-22-3p對(duì)腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及凋亡的影響及其可能作用機(jī)制，為腎母細(xì)胞瘤分子治療提供潛在靶點(diǎn)。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

選取2017年10月～2019年3月本院收治的腎母細(xì)胞瘤患兒30例，所有患兒均被確診為腎母細(xì)胞瘤，其中男20例，女10例，年齡1～10歲，平均年齡(4.26±1.23)歲，術(shù)中切除腎母細(xì)胞瘤組織及癌旁組織，置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬知情且簽署同意書(shū)。

人腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Lipofectamine2000購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Trizol試劑、SuperScriptTMIV One-Step RT-PCR System with ezDNaseTM、SuperScriptTMIII PlatinumTMSYBRTMGreen One-Step qRT-PCR Kit購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；CCK-8試劑購(gòu)自上海李記生物科技有限公司；si-NC、si-SNHG16、miR-NC、miR-22-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-22-3p購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；pcDNA3.1、pcDNA-SNHG16購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自北京綠源伯德生物科技有限公司；Annexin V-FITC / PI凋亡試劑盒購(gòu)自北京博爾邁生物技術(shù)有限公司；兔抗人CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、p21、Bax抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

二、方法

1.實(shí)驗(yàn)分組：WIT49細(xì)胞接種于96孔板(1×103個(gè)/孔)，分別將si-NC、si-SNHG16、miR-NC、miR-22-3p mmics、si-SNHG16與anti-miR-NC、si-SNHG16與anti-miR-22-3p轉(zhuǎn)染至WIT49細(xì)胞，分別記作si-NC組、si-SNHG16組、miR-NC組、miR-22-3p組、si-SNHG16+anti-miR-NC組、si-SNHG16+anti-miR-22-3p組。

2.qRT-PCR檢測(cè)SNHG16、miR-22-3p的表達(dá)水平：采用Trizol法提取癌旁組織、腎母細(xì)胞瘤組織及各組WIT49細(xì)胞總RNA，將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作)，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)(按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作)，應(yīng)用ABI 7500型熒光定量PCR儀檢測(cè)SNHG16、miR-22-3p相對(duì)表達(dá)量。

3.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：取各組WIT49細(xì)胞接種于96孔板(1×103個(gè)/孔)，分別于培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)時(shí)加入CCK-8溶液(10 μl/孔)，繼續(xù)孵育2小時(shí)，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(OD值)。

4.Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移與侵襲：取各組細(xì)胞懸液(2.5×104個(gè)/ml)加入小室的上室(200 μl/孔)，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入小室的下室(600 μl/孔)，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，分別使用多聚甲醛固定及結(jié)晶紫染色后置于顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)前在小室的上室加入Matrigel基質(zhì)膠稀釋液(40 μl/孔)，繼續(xù)孵育4小時(shí)，按照細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，置于顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：取各組WIT49細(xì)胞加入PBS洗滌，棄上清，向細(xì)胞沉淀中加入Binding Buffer懸浮細(xì)胞(500 μl)，參照凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)分別加入Annexin V-FITC(5 μl)與PI(5 μl)，充分混勻，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

6.雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)SNHG16、miR-22-3p的靶向關(guān)系：LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)顯示SNHG16、miR-22-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，分別構(gòu)建野生型載體WT-SNHG16與突變型載體MUT-SNHG16，分別將miR-NC、miR-22-3p mimics與WT-SNHG16、MUT-SNHG16共轉(zhuǎn)染至WIT49細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。

7.Western blot檢測(cè)CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2、p21、Bax蛋白表達(dá)：WIT49細(xì)胞加入RIPA裂解液(400 μl)提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，取蛋白樣品(50 μg)進(jìn)行SDS-PAGE電泳反應(yīng)，轉(zhuǎn)膜、封閉(2小時(shí))，分別孵育一抗稀釋液(1∶1 000)與二抗稀釋液(1∶2 000)，室溫孵育1小時(shí)，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

1.lncRNA SNHG16和miR-22-3p在腎母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)：與癌旁組織比較，腎母細(xì)胞瘤組織中SNHG16的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，miR-22-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 lncRNA SNHG16和miR-22-3p在腎母細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)

2.抑制lncRNA SNHG16表達(dá)對(duì)腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響：與si-NC組比較，si-SNHG16組OD值顯著降低(P<0.05)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表2、表3、圖1。

表2 抑制lncRNA SNHG16表達(dá)對(duì)腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表3 抑制lncRNA SNHG16表達(dá)對(duì)腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的影響

圖1 增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

3.lncRNA SNHG16靶向調(diào)控miR-22-3p的表達(dá)：LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)顯示SNHG16與miR-22-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖2。miR-22-3p過(guò)表達(dá)可明顯降低野生型載體WT-SNHG16的熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)突變型載體MUT-SNHG16熒光素酶活性無(wú)明顯影響(P>0.05)，見(jiàn)表4。與pcDNA組比較，pcDNA-SNHG16組miR-22-3p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與si-NC組比較，si-SNHG16組miR-22-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表5。

圖2 SNHG16的序列中含有與miR-22-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

表5 lncRNA SNHG16調(diào)控miR-22-3p表達(dá)

4.miR-22-3p過(guò)表達(dá)對(duì)腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響：與miR-NC組比較，miR-22-3p組OD值顯著降低(P<0.05)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平顯著降低(P<0.05)，p21、Bax蛋白水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)表6、表7、圖3。

表6 miR-22-3p過(guò)表達(dá)對(duì)腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

表7 miR-22-3p過(guò)表達(dá)對(duì)腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3 增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

5.下調(diào)miR-22-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA SNHG16表達(dá)對(duì)腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的作用：與si-SNHG16+anti-miR-NC組比較，si-SNHG16+anti-miR-22-3p組OD值顯著升高(P<0.05)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)，凋亡率顯著降低(P<0.05)，CyclinD1、MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白水平顯著升高(P<0.05)，p21、Bax蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表8、表9、圖4。

圖4 增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表8 下調(diào)miR-22-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA SNHG16表達(dá)對(duì)腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的作用

表9 下調(diào)miR-22-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA SNHG16表達(dá)對(duì)腎母細(xì)胞瘤WIT49細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

討論

腎母細(xì)胞瘤患兒臨床表現(xiàn)為腫瘤包塊破潰引起的血尿及腹部疼痛，其治療效果已取得巨大進(jìn)步，但其已給患兒家庭造成一定負(fù)擔(dān)，lncRNA表達(dá)異?？烧{(diào)控腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過(guò)程，Zhu等[7]研究表明LINC00473可充當(dāng)miR-195的海綿分子而調(diào)控腎母細(xì)胞瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。lncRNA可充當(dāng)miRNA的海綿分子而參與腎母細(xì)胞瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[8-10]。但lncRNA在腎母細(xì)胞瘤形成及發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制尚未完全闡明。

SNHG16在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)水平升高，并可通過(guò)介導(dǎo)miR-877-5p / FOXP4軸促進(jìn)喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展[11]。敲低SNHG16可通過(guò)充當(dāng)miR-342-3p的海綿分子而抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞增殖[12]。SNHG16通過(guò)下調(diào)DKK3的表達(dá)促進(jìn)胃癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[13]。本研究結(jié)果顯示，腎母細(xì)胞瘤組織中SNHG16的表達(dá)水平明顯升高，進(jìn)一步研究顯示抑制SNHG16表達(dá)可明顯降低OD值及CyclinD1蛋白水平，提高p21蛋白水平。研究表明CyclinD1可正向調(diào)控細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖，p21可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖[14]。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)抑制SNHG16表達(dá)可抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖。細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，MMP-2、MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶，其可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)沉積從而促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲[15]。本研究結(jié)果顯示抑制SNHG16表達(dá)可明顯減少遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)，降低MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平，提示抑制SNHG16表達(dá)可抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移及侵襲。細(xì)胞增殖與凋亡異?？纱龠M(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展，Bcl-2表達(dá)下調(diào)可抑制細(xì)胞凋亡，Bax表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示抑制SNHG16表達(dá)可提高凋亡率，促進(jìn)Bax表達(dá)及抑制Bcl-2表達(dá)，提示抑制SNHG16表達(dá)可促進(jìn)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。

本研究證實(shí)SNHG16可靶向結(jié)合miR-22-3p，并可負(fù)向調(diào)控miR-22-3p的表達(dá)及活性。 LINC00858通過(guò)充當(dāng)miR-22-3p的ceRNA而促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[17]。lncRNA NNT-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-22-3p / YAP1軸促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展[18]。lncRNA DGCR5通過(guò)抑制miR-22-3p而促進(jìn)肺腺癌進(jìn)程[19]。miR-22-3p靶向α-烯醇酶1調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖[20]。本研究結(jié)果顯示腎母細(xì)胞瘤組織中miR-22-3p的表達(dá)水平降低，miR-22-3p過(guò)表達(dá)可抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示miR-22-3p在腎母細(xì)胞瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中可發(fā)揮重要調(diào)控作用。同時(shí)本研究將si-SNHG16與anti-miR-22-3p共轉(zhuǎn)染至腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力明顯增強(qiáng)，凋亡率明顯降低，提示下調(diào)miR-22-3p表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)抑制SNHG16表達(dá)對(duì)腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的作用。

綜上所述，抑制SNHG16表達(dá)可通過(guò)上調(diào)miR-22-3p的表達(dá)從而抑制腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，可為揭示腎母細(xì)胞瘤發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，還可能作為腎母細(xì)胞瘤靶向治療的潛在靶點(diǎn)。但關(guān)于其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。