苯妥英鈉液相含量測(cè)定方法的研究*

吳葉群，黃宇婷，廖清怡，丘小萌，羅穎，賈進(jìn)文，葉東，劉智鵬，李艷萍，聶鑫

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣東佛山 528000)

苯妥英鈉是苯妥英的鈉鹽[1]。由于苯妥英鈉具有廣泛的生物學(xué)活性和藥理治療作用，在醫(yī)學(xué)上除了被用來作為抗癲癇發(fā)作的藥物，還常用于治療輕度高血壓、三叉神經(jīng)痛和心律失常[2]。目前，對(duì)于苯妥英鈉含量的測(cè)定方法有許多，包括紫外分光光度法、玻碳電極伏安法、毛細(xì)管區(qū)電泳法、單掃描示波極譜法、高精度散射光度滴定法、高效液相色譜法等[3-9]。這些方法均有其優(yōu)缺點(diǎn)，其中使用較廣泛的高效液相色譜法具有穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確、干擾因素少的特點(diǎn)，《中國藥典》2015版采用高效液相色譜法對(duì)苯妥英鈉進(jìn)行含量測(cè)定[10]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)多采用高效液相色譜法對(duì)苯妥英鈉的制劑如復(fù)方制劑、凝膠劑、注射劑、片劑等進(jìn)行含量測(cè)定[11-13]，筆者對(duì)實(shí)驗(yàn)室合成的苯妥英鈉原料進(jìn)行含量測(cè)定，相關(guān)研究還較少。

1 試驗(yàn)部分

1.1 主要儀器

主要試驗(yàn)儀器見表1。

表1 主要試驗(yàn)儀器

1.2 主要試驗(yàn)原料

主要試驗(yàn)原料見表2。

表2 主要試驗(yàn)原料

1.3 色譜條件考察

1.3.1 流動(dòng)相的選擇

稱取適量苯妥英鈉(分析純)置于100 mL容量瓶中，加少量甲醇振搖至溶解，若不能溶解完全則使用超聲清洗儀超聲處理，待全部溶解后搖勻且定容，稀釋成質(zhì)量濃度約為100 μg/mL的溶液，用于流動(dòng)相的探索。選取225 nm為檢測(cè)波長，以甲醇為溶劑，在波長與溶劑一定的條件下，改變流動(dòng)相甲醇與蒸餾水的體積比，觀察并記錄苯妥英鈉的出峰時(shí)間，對(duì)比發(fā)現(xiàn)：隨著甲醇比例的增大，出峰時(shí)間依次遞減，在保證峰型前提下，為節(jié)約和環(huán)保，選擇了較短的出峰時(shí)，對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相配比為甲醇與水的體積比為57∶43，出峰時(shí)間約為4.4 min。

1.3.2 波長的選擇

精密稱取0.1014 g苯妥英鈉標(biāo)準(zhǔn)品A，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容。取上述溶液1 mL稀釋于100 mL容量瓶中，即為標(biāo)準(zhǔn)品待測(cè)溶液。用紫外分光光度儀對(duì)上述溶液進(jìn)行測(cè)定，苯妥英鈉最大吸收峰在205 nm左右，參考藥典法和其他參考文獻(xiàn)，并結(jié)合高效液相色譜圖譜，發(fā)現(xiàn)220 nm時(shí)的峰形最好，最終確定以220 nm為檢測(cè)波長。紫外掃描圖譜、苯妥英鈉標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖和試樣液相色譜圖分別見圖1、圖2及圖3。

圖1 紫外掃描圖譜

圖2 苯妥英鈉標(biāo)準(zhǔn)品液相圖譜

圖3 苯妥英鈉試樣液相圖譜

1.3.3 溶劑的選擇

分別使用甲醇和(φ)50%的甲醇溶液溶解苯妥英鈉標(biāo)準(zhǔn)品，并分別進(jìn)行測(cè)定，比較兩者色譜圖發(fā)現(xiàn)以(φ)50%甲醇為溶劑時(shí)峰形更好，因此選擇(φ)50%甲醇為標(biāo)準(zhǔn)品和試樣的溶劑。

1.3.4 色譜條件

根據(jù)上述試驗(yàn)進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，最終將流動(dòng)相定為甲醇與水(體積比為57∶43)，將溶劑定為(φ)50%甲醇，檢測(cè)波長為220 nm，流速為1 mL/min，柱溫為室溫。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱取0.049 7 g苯妥英鈉標(biāo)準(zhǔn)品A，以(φ)50%甲醇為溶劑，定容于50 mL容量瓶，記為原液，取原液20 mL，稀釋于100 mL容量瓶，記為稀釋液，取稀釋液1，2，4，6，8，10 mL，分別加入50 mL容量瓶，配制成質(zhì)量濃度為3.976，7.952，15.904，23.856，31.808，39.760 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.6 線性關(guān)系考察

按上述色譜條件，對(duì)上述6個(gè)質(zhì)量濃度的苯妥英鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行測(cè)定，每次取20 μL，且每個(gè)質(zhì)量濃度的試樣連續(xù)進(jìn)樣3次，記錄峰面積，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖4可見：在質(zhì)量濃度為3.976~39.760 μg/mL時(shí)，y=0.020 8x－0.470 8(R2=0.999 5)，線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 精密度試驗(yàn)

精密稱取0.048 2 g苯妥英鈉標(biāo)準(zhǔn)品B，置于50 mL容量瓶并用(φ)50%甲醇溶解定容為原液。取原液10 mL置于50 mL容量瓶，稀釋定容得稀釋液，再取稀釋液4 mL置于50 mL容量瓶稀釋定容得測(cè)定液，在色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，每次進(jìn)樣20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，精密度試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 精密度試驗(yàn)

由表3可見：計(jì)算得峰面積的RSD為1.53%，表明精密度良好。

2.2 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取0.052 3 g苯妥英鈉試樣1#，置于50 mL容量瓶中，用(φ)50%甲醇溶解定容為原液，取原液10 mL加入到50 mL容量瓶，用(φ)50%甲醇稀釋定容得稀釋液，取稀釋液4 mL加入到50 mL容量瓶中稀釋定容，得測(cè)定液，按上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)

表4 中測(cè)得的峰面積數(shù)據(jù)帶入已求得的線性方程，計(jì)算出試樣1#苯妥英鈉的平均含量(w)為73.60%，RSD為0.95%，表明重復(fù)性較好。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取2.2節(jié)中的測(cè)定液，分別在0，1，2，3，4 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積平均值，結(jié)果見表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

由表5可見：在0~4 h，苯妥英鈉峰面積的RSD為3.06%，表明該方法穩(wěn)定性較好。

2.4 加樣回收試驗(yàn)

依次精密量取2.2節(jié)中試樣1#稀釋液2，2.5，3 mL，分別加入50 mL容量瓶中，再依次精密加入2.1節(jié)中苯妥英鈉標(biāo)準(zhǔn)品B稀釋液2，2.5，3 mL，用(φ)50%甲醇稀釋并定容。分別取上述3個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品-試樣混合液進(jìn)行測(cè)定，每次進(jìn)樣20 μL，進(jìn)樣3次，記錄峰面積數(shù)值，試驗(yàn)結(jié)果見表6。

由表6可見：平均回收率為76.03%，RSD為1.68%，表明采用該測(cè)定方法是可行的，分析原因可能是某些因素影響了回收率。前期考慮可能因稱量、配制過程中不夠精確、規(guī)范導(dǎo)致，為此進(jìn)行了2次加樣回收試驗(yàn)，但結(jié)果相差不大，最終分析可能是由于該試驗(yàn)是分2個(gè)階段進(jìn)行的，且時(shí)間相隔較長，儀器的狀態(tài)、所用試劑及操作者均會(huì)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)產(chǎn)生一定影響，加樣回收率所用的標(biāo)準(zhǔn)品與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線所用的標(biāo)準(zhǔn)品廠家不同，加樣回收率所用的標(biāo)準(zhǔn)品B的含量可能與標(biāo)示量相差較大，導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)品的真實(shí)加入量低，導(dǎo)致計(jì)算的加樣回收率也偏低。

表6 加樣回收試驗(yàn)

2.5 試樣含量的測(cè)定

精密稱取苯妥英鈉試樣2#0.051 7 g，置于50 mL容量瓶并用50%甲醇溶解定容得原液，精密量取原液10 mL，置于50 mL容量瓶并用(φ)50%甲醇稀釋定容為稀釋液，再量取稀釋液4 mL，置于50 mL容量瓶并用(φ)50%甲醇稀釋定容為試樣測(cè)定液，取試樣測(cè)定液進(jìn)行測(cè)定，每次進(jìn)樣20 μL，共3次，記錄峰面積數(shù)值，結(jié)果見表7。

表7 試樣含量測(cè)定

表7 中峰面積數(shù)據(jù)帶入線性方程，得到苯妥英鈉試樣2#的含量(w)為67.00%，表明試樣2#中雜質(zhì)含量較高。

3 結(jié)論

筆者在之前高效液相色譜測(cè)定苯妥英鈉含量的研究基礎(chǔ)上，對(duì)流動(dòng)相、檢測(cè)波長及溶劑均進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。優(yōu)化后的檢測(cè)方法可以對(duì)苯妥英鈉合成試驗(yàn)產(chǎn)物進(jìn)行含量測(cè)定，具有檢測(cè)時(shí)間短，易操作的優(yōu)點(diǎn)，較藥典法成本更低。該檢測(cè)方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性結(jié)果均較好，僅加樣回收試驗(yàn)結(jié)果不太理想，平均回收率僅為76.03%，應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化加樣回收試驗(yàn)結(jié)果。