金屬鉛和鎘對副溶血弧菌生物被膜形成的影響

胡元慶,陳萍萍,李鳳霞

（閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,福建漳州363000）

副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）是一種革蘭氏陰性的嗜鹽性桿菌，廣泛分布于近海岸的養(yǎng)殖環(huán)境、海底沉積物及各類海產(chǎn)品中，是海水養(yǎng)殖業(yè)的主要條件性致病菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1].該菌也是最常見的食源性致病菌之一，近年來人類60%以上的食物中毒事件由其引發(fā)，患者常表現(xiàn)惡心、嘔吐、腹痛和腹瀉等癥狀[2].副溶血弧菌的致病性除了由溶血素TDH 和TRH、Ⅲ和Ⅳ型分泌系統(tǒng)及腸毒素等毒力因子決定，也與細(xì)菌生物被膜（biofilm，BF）的形成密切相關(guān)[3].

生物被膜是微生物為適應(yīng)不良環(huán)境，粘附于非生物或活性組織表面，分泌大量的多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白和細(xì)胞外DNA，將菌體包裹而形成的菌體聚集膜樣物[4].生物被膜作為一種特殊細(xì)菌群落，是細(xì)菌抵抗不利環(huán)境、產(chǎn)生耐藥性并導(dǎo)致宿主持續(xù)性感染的重要方式[4-5].自然界中大部分細(xì)菌以多細(xì)胞形式存在，該群體結(jié)構(gòu)可使細(xì)胞間相互協(xié)調(diào)而共生[5-6].組成生物被膜的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular polymeric substances，EPS）將菌體包裹形成了一個物理屏障，大大增強(qiáng)了菌體對抗生素或其它有害化學(xué)物質(zhì)的抵抗力[5,7].EPS 由許多不同的生物聚合物組成，它們將各自的物理特性傳遞給基質(zhì)，從而為生物被膜提供強(qiáng)度、凝聚力和保留大小分子的能力[5].大量研究證實(shí)，幾乎所有的細(xì)菌都可形成生物被膜結(jié)構(gòu)，這也是食品加工環(huán)境中細(xì)菌持續(xù)存在的一個主要原因[7].細(xì)菌生物被膜引發(fā)的安全問題越來越多地被國內(nèi)外學(xué)者所關(guān)注，嚴(yán)重威脅著人類的健康.

生物被膜對副溶血弧菌在環(huán)境中的持續(xù)存在和食物鏈中的傳播起關(guān)鍵作用[8].副溶血弧菌為適應(yīng)不利環(huán)境而形成生物被膜，其一旦生成就難以根除，從而引發(fā)潛在的食品安全風(fēng)險[9].國內(nèi)外關(guān)于食品中副溶血弧菌生物被膜的研究越來越多，已有學(xué)者研究了各種環(huán)境因子對該菌形成生物被膜的最佳條件[10-11]，以及多種防腐劑[12]、亞硝酸鈉[13]、白藜蘆醇等物質(zhì)對該菌形成生物被膜的促進(jìn)或抑制作用[14].關(guān)于金屬離子對副溶血弧菌形成生物被膜影響的報(bào)道，主要研究了金屬陽離子如Ca2+、Fe2+、Cu2+、Mg2+等對該菌生物被膜形成的影響[11].鉛和鎘是水體污染中常見的重金屬，其對副溶血弧菌形成生物被膜的影響尚無報(bào)道.本文以副溶血弧菌ATCC17802 標(biāo)準(zhǔn)株為實(shí)驗(yàn)對象，研究鉛和鎘對該菌生物被膜形成的影響，可為有效控制副溶血弧菌形成生物被膜和治理水體污染提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株：副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802，由漳州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心惠贈.

主要藥品試劑：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、TCBS 選擇性培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；硝酸鉛、四水合硝酸鎘、冰醋酸，阿拉丁控股有限公司；結(jié)晶紫，上海源葉生物科技有限公司；96孔聚苯乙稀U型細(xì)胞培養(yǎng)板，賽默飛世爾科技（中國）有限公司.

主要儀器設(shè)備：全波長酶標(biāo)儀（MultiSkan Go），美國ThermoFisher 公司；紫外分光光度計(jì)（UV-1100），上海美普達(dá)儀器有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GSP-9050MBE）、立式壓力蒸汽滅菌器（BXM-30R），上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；超凈工作臺（SW-CJ-1FD），蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9030A），上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；恒溫振蕩搖床（HQY-C），金壇市鴻科儀器廠；電子天平（AR124CN），奧豪斯儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備

副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802劃線接種于TCBS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h活化.挑取單菌落接種于3%NaCl營養(yǎng)肉湯中，37 ℃，200 r/min 振蕩16～18 h，然后用含3%NaCl營養(yǎng)肉湯將菌液稀釋至OD600=0.6備用.

1.2.2 生物被膜形成量

參照Djordjevic[15]等法并略做改進(jìn).將稀釋好的菌液分別與含3% NaCl 營養(yǎng)肉湯按1∶3（v/v）混合均勻后，按每孔200 μL加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組3個平行，以無菌3%NaCl營養(yǎng)肉湯為空白對照.37 ℃培養(yǎng)72 h 后，棄去培養(yǎng)液，每孔用250 μL 生理鹽水清洗兩次，60 ℃干燥固定30 min.每孔用200 μL 的0.1%結(jié)晶紫溶液染色5 min 后棄去染液，生理鹽水清洗3 次，60 ℃干燥10 min 后，每孔加200 μL 的33%冰醋酸作用5 min，酶標(biāo)儀測定OD630值，比較不同濃度細(xì)菌的成膜情況.

1.2.3 培養(yǎng)溫度與時間對生物被膜形成影響

將菌液與3%NaCl營養(yǎng)肉湯按1∶3體積混勻，每孔200 μL加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為4、28、37 ℃，培養(yǎng)時間分別為12、24、48、72、96 h，按1.2.2中的方法測定OD630值，比較不同培養(yǎng)溫度和時間下的成膜情況.

1.2.4 重金屬離子鉛和鎘對生物被膜形成影響

向培養(yǎng)基中添加硝酸鉛和硝酸鎘至不同的終濃度（0、50、250、450、650、850 μg/L），培養(yǎng)時間設(shè)為12、24、48、72、96 h，按1.2.2方法測定OD630值，分析兩種離子對副溶血弧菌生物被膜形成的影響.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，試驗(yàn)中指標(biāo)測定均進(jìn)行了3 次，圖中用X±SD表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)溫度和時間對生物被膜形成影響

溫度是生物被膜形成的重要影響因素.4 ℃是水產(chǎn)品低溫貯運(yùn)的溫度，28 ℃是我國南方水產(chǎn)品生產(chǎn)季的環(huán)境溫度，37 ℃是Vp 生長的最適溫度，也是南方夏季的高溫條件，本實(shí)驗(yàn)考查這三個溫度對副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802 生物被膜形成的影響.由圖1可知，三個不同溫度條件下OD630值均逐漸增大，表明副溶血弧菌生物被膜的形成量隨培養(yǎng)時間的延長而增加.4 ℃和28 ℃培養(yǎng)條件均在72 h 時OD630值達(dá)到最大，之后開始下降.37 ℃條件下48 h 時OD630值達(dá)到最大，之后開始下降.三個溫度條件下的生物被膜形成總體呈先升后降趨勢，符合生物被膜的形成規(guī)律，即開始小菌落慢慢成長，然后成為具有三維立體結(jié)構(gòu)的成熟型生物被膜，之后部分細(xì)胞開始從生物被膜上脫落.在37 ℃條件下每個時間點(diǎn)測得的OD630值均最大，大約是28 ℃時OD630值的2 倍，生物被膜形成量最多，28 ℃時測得的OD630值比4 ℃時大.因此，37 ℃是副溶血弧菌生物被膜形成的最佳溫度，28 ℃次之，隨后的實(shí)驗(yàn)用37 ℃和28 ℃培養(yǎng)比較不同濃度Pb2+和Cd2+對Vp生物被膜形成影響.

圖1 不同溫度條件對副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.1 Effects on biofilm formation of Vibrio parahemolyticus at different temperature

2.2 重金屬離子對生物被膜形成的影響

2.2.1 結(jié)晶紫染色觀察副溶血弧菌生物被膜的形成情況

37 ℃是副溶血弧菌生物被膜形成的最佳溫度條件，觀察此培養(yǎng)條件下Pb2+和Cd2+對生物被膜形成的影響.由圖2可知（1～6 分別對應(yīng)離子濃度是0、50、250、450、650、850 μg/L），細(xì)胞培養(yǎng)板中的細(xì)菌經(jīng)結(jié)晶紫染色后，可觀察到有生物被膜形成，并隨著Pb2+和Cd2+濃度逐漸升高，生物被膜生成量逐漸下降，且呈梯度變化趨勢.

圖2 不同Pb2+和Cd2+濃度對副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.2 Effects of different concentrations of lead and cadmium on biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus

2.2.2 Pb2+對副溶血弧菌生物被膜形成的影響

本實(shí)驗(yàn)考查不同的硝酸鉛終濃度（0、50、250、450、650、850 μg/L）對副溶血弧菌生物被膜形成的作用，不同的Pb2+濃度代表水環(huán)境的不同污染程度.由圖3可知，在28 ℃時向培養(yǎng)基中添加不同濃度的Pb2+，隨著培養(yǎng)時間的延長，OD630值呈先升后降的趨勢，6個濃度條件均在72 h時OD630值達(dá)到最高.隨著Pb2+濃度的增大，OD630值呈逐漸下降的趨勢，表明Pb2+能抑制副溶血弧菌生物被膜的形成.由圖4可知，在37 ℃時向培養(yǎng)基中添加Pb2+，隨著培養(yǎng)時間的延長，OD630值呈先升后降趨勢，6個濃度條件均在72 h時OD630值達(dá)到最高.隨著Pb2+濃度的增大，OD630值呈逐漸下降的趨勢，其中Pb2+濃度在50 μg/L和250 μg/L時，培養(yǎng)96 h的OD630低于48 h和72 h.從圖3和圖4可知，96 h培養(yǎng)組的生物被膜隨著Pb2+濃度的升高，OD630下降最多，說明被抑制的程度也最高，這可能與該條件下生物被膜的結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定有關(guān).

圖3 28 ℃時不同Pb2+濃度對副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.3 Effects of different Pb2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 28 ℃

圖4 37 ℃時不同Pb2+濃度下副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.4 Effects of different Pb2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 37 ℃

2.2.3 Cd2+對副溶血性弧菌形成生物被膜的影響

本實(shí)驗(yàn)考查不同的Cd2+終濃度（0、50、250、450、650、850 μg/L）對副溶血弧菌生物被膜形成的作用，不同的終濃度代表水體中Cd2+不同的污染程度.由圖5可知，在28 ℃時向培養(yǎng)基中添加Cd2+，隨著培養(yǎng)時間的延長，OD630值呈先升后降的趨勢，在72 h 時OD630值達(dá)到最高.隨著Cd2+濃度的增大，OD630值呈逐漸下降的趨勢，其中培養(yǎng)96 h 的OD630在Cd2+濃度為0～450 μg/L 范圍時均低于24、48、72 h.由圖6可知，在37 ℃時向培養(yǎng)基中添加Cd2+，隨著培養(yǎng)時間的延長，OD630值呈先升后降的趨勢，Cd2+濃度為0～450 μg/L范圍組于72 h時OD630值達(dá)到最高.隨著Cd2+濃度的增大，OD630值呈逐漸下降的趨勢，其中培養(yǎng)96 h的OD630在Cd2+濃度為50～650 μg/L 范圍時均低于24、48、72 h，這可能因?yàn)榕囵B(yǎng)96 h 時生物被膜降解脫落，形成量減少.

圖5 28 ℃時不同Cd2+濃度對副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.5 Effects of different Cd2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 28 ℃

圖6 37 ℃時不同Cd2+濃度對副溶血弧菌生物被膜形成的影響Fig.6 Effects of different Cd2+concentrations on the biofilm formation of Vibrio parahaemolyticus at 37 ℃

3 討論

溫度和時間是影響生物被膜形成的重要參數(shù)[8,13].本研究首先分析了4、28、37 ℃對副溶血弧菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC17802 生物被膜形成的影響.結(jié)果表明在37 ℃條件下48 h 時生物被膜形成量達(dá)到最大，之后逐漸下降，與查飛等的研究結(jié)果一致[16].生物被膜的這種形成規(guī)律，主要因?yàn)榧?xì)菌生物被膜的形成包括黏附、成熟和脫落3個階段，起始階段菌膜與固體介質(zhì)的黏附能力較弱，隨著菌膜成熟而形成穩(wěn)定的生物被膜結(jié)構(gòu)，然后胞外多糖分泌減少導(dǎo)致菌膜衰亡脫落[16].

沿海水域特別是海灣，已成為重要的海水養(yǎng)殖區(qū)域，同時也受到人類開發(fā)活動的干擾比較嚴(yán)重，尤其是重金屬污染.楊妙峰[17]等于2019年對漳州東山灣海域養(yǎng)殖的貝類體內(nèi)的重金屬含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)華貴櫛孔扇貝的Cd超標(biāo).黃玉英[18]等2020年分析了福州和泉州沿海養(yǎng)殖環(huán)境中貝類重金屬污染狀況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泉州的毛蚶中Cr含量超出限量值.微生物生活在富含重金屬的環(huán)境中，通常會產(chǎn)生多種重金屬抗性和解毒機(jī)制[19].而生物被膜的形成通常與微生物對金屬的耐受性有關(guān)[20].假單胞菌產(chǎn)生的胞外多糖（EPS）對重金屬的生物吸附或富集是細(xì)菌抗重金屬特性的重要機(jī)制之一[19].微生物EPS對生物被膜和細(xì)胞聚集體的形成起著至關(guān)重要的作用，它有助于保護(hù)細(xì)胞免受惡劣環(huán)境的侵害，并能結(jié)合大量的重金屬[21].生物被膜和浮游細(xì)胞對重金屬的敏感性不同[22].研究表明，重金屬的絡(luò)合或固存作用以及阻止其在生物被膜中的擴(kuò)散可能是保護(hù)細(xì)胞免受重金屬毒性的重要原因[19].由于微生物EPS參與了溶液中重金屬的絮凝和結(jié)合作用，因此其在生物修復(fù)過程中也具有特殊的意義[23].

副溶血弧菌已被認(rèn)為是全世界食源性疾病的一個主要原因，它能夠產(chǎn)生比其浮游形式更能抵抗消毒劑和抗生素的生物被膜[24].生物被膜的形成是一個復(fù)雜的動態(tài)過程，取決于細(xì)菌的性質(zhì)和培養(yǎng)溫度，而對于副溶血弧菌生物被膜的形成，這種相關(guān)性還不清楚[24].生物被膜的形成是食品工業(yè)的重要難題，因?yàn)檫@些生物被膜可能是交叉污染的來源，降低了食品的安全性[25].副溶血弧菌可以形成穩(wěn)定的生物被膜，其生物被膜的形成與培養(yǎng)時間、溫度、重金屬鉛和鎘濃度有著密切的關(guān)系.本實(shí)驗(yàn)中副溶血弧菌形成生物被膜的最佳時間為72 h，最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃.培養(yǎng)基中添加Pb2+和Cd2+均會抑制副溶血弧菌形成生物被膜，添加的硝酸鉛和硝酸鎘濃度為50 μg/L時出現(xiàn)抑制作用，隨著硝酸鉛和硝酸鎘濃度越高，測得的OD630值越小.本實(shí)驗(yàn)中得出副溶血弧菌生物被膜最佳培養(yǎng)溫度是37 ℃，而梁宏雁等[11]的實(shí)驗(yàn)中最佳培養(yǎng)溫度為28 ℃，所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中同時比較在37 ℃和28 ℃條件下重金屬對生物被膜形成的影響.硝酸鉛對副溶血弧菌生物被膜起抑制作用，這可能是加入Pb2+的培養(yǎng)液具有親水性，生物有機(jī)體分散生長.本實(shí)驗(yàn)中副溶血弧菌生物被膜形成量隨著培養(yǎng)時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，72 h 處達(dá)到最大值，這符合細(xì)菌生物被膜的形成過程，在0至72 h里生物被膜逐漸生長到成熟，之后生物被膜降解，細(xì)胞脫落，生物被膜形成量下降.

總之，研究副溶血弧菌形成生物被膜的最佳時間和溫度以及重金屬鉛和鎘對其形成生物被膜的影響，確定水中Pb2+、Cd2+一定程度的污染是否會抑制副溶血弧菌形成生物被膜，可為深入研究重金屬對該菌形成生物被膜的作用奠定基礎(chǔ)，也為有效控制該菌形成生物被膜提供參考.