李媛 李屹 張曄 劉永林

阻塞性黃疸(obstructive jaundice，OJ)是指膽汁排泄受阻，膽汁不能排入十二指腸而造成膽汁淤積，引起黃疸的常見肝膽外科病癥，可使肝臟受損嚴(yán)重，引起纖維化[1,2]。器官纖維化的發(fā)生發(fā)展與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激密切相關(guān)[3,4]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)激活PKR樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase，PERK)，促進(jìn)真核翻譯起始因子2α(eukaryotic translation initiation factor-2alpha，eIF2α)磷酸化[5]，激活下游因子轉(zhuǎn)錄激活因子4(activating transcription factor 4，ATF4)，從而激活C/EBP同源蛋白(C/EB phomologous protein，CHOP)[6,7]。中藥海金沙為海金沙科海金沙屬多年生蕨類植物，可全草入藥[8]。目前對(duì)其藥理活性的研究主要在抗氧化、抗菌、抗病毒、利膽、排石等方面，但作為傳統(tǒng)中藥，海金沙的功能仍有待進(jìn)一步開發(fā)研究。本實(shí)驗(yàn)通過建立阻塞性黃疸大鼠模型，初步探究海金沙提取對(duì)阻塞性黃疸大鼠PERK/eIF2α/CHOP通路及肝纖維化的影響，為臨床治療提供可靠的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠，SPF級(jí)，體重200 g左右，購(gòu)自遼寧省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(遼)2015-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 伊紅蘇木精試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、蛋白提取試劑盒購(gòu)自上海Beyotime公司；PERK抗體、eIF2α抗體、CHOP抗體、酶聯(lián)免疫試劑盒均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 主要儀器 全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自美國(guó)Rayto公司；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本尼康公司；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；凝膠成像儀購(gòu)自杭州Miulab公司。

1.4 方法

1.4.1 海金沙的提取:參照文獻(xiàn)[9]，制備海金沙提取物。海金沙全草粉碎，稱取100 g，置于500 ml圓底燒瓶，加入純化水400 ml，回流提取4次，2 h/次，合并提取液并濃縮。濃縮后加入95%乙醇沉淀，使乙醇含量達(dá)到80%，靜置抽濾，室溫干燥濾液，得到總膏，提取率約為2%。

1.4.2 阻塞性黃疸大鼠模型的制備:取健康雄性SD大鼠最少50只，隨機(jī)分成5組：即假手術(shù)組、模型組、海金沙低劑量組、海金沙中劑量組、海金沙高劑量組，每組10只。參照文獻(xiàn)制備阻塞性黃疸大鼠[10]，方法如下：按照45 mg/kg劑量的2%戊巴比妥鈉腹腔注射，麻醉大鼠，打開腹腔，沿肝十二指腸韌帶尋找膽總管。將大鼠膽總管在十二指腸上方雙重結(jié)扎中間剪斷，關(guān)閉腹腔，從而建立膽道阻塞動(dòng)物模型。假手術(shù)組大鼠僅游離膽總管但并不結(jié)扎。所有大鼠術(shù)后需做抗菌消炎處理。實(shí)驗(yàn)過程中，所有因手術(shù)、麻醉意外等原因死亡的動(dòng)物，均應(yīng)剔除出組，并采用備用大鼠補(bǔ)充，保證每組動(dòng)物存活只數(shù)≥10只。

1.4.3 動(dòng)物給藥:用蒸餾水將海金沙提取物分別配制為5、10、15 mg/ml溶液，海金沙低劑量組(50 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)、高劑量組(150 mg/kg)按照10 ml/kg劑量給大鼠灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等體積的蒸餾水灌胃，1次/d，連續(xù)4周。

1.4.4 血清肝功能指標(biāo)檢測(cè):將大鼠深度麻醉，打開腹腔，從肝下門靜脈采集血液，離心收集血清，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠肝功能指標(biāo)，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)。

1.4.5 血清肝纖維化指標(biāo)檢測(cè):采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對(duì)血清中的肝纖維化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，其中包括層黏連蛋白(Laminin，LN)，透明質(zhì)酸酶(Hyaluronidase，HA)，Ⅲ型前膠原(Type Ⅲ procollagen，PCⅢ)，Ⅳ型膠原(Type Ⅳ collagen，Ⅳ-Col)。

1.4.6 大鼠肝臟組織的病理學(xué)觀察和肝纖維化程度:處死大鼠，取出大鼠部分肝臟組織固定，制備病理組織切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理形態(tài)。另一部分肝臟組織至液氮中保存?zhèn)溆谩８卫w維化分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[11]：肝臟組織內(nèi)無(wú)纖維化為0級(jí)；肝竇周圍、匯管區(qū)纖維化或肝小葉中出現(xiàn)纖維瘢痕為1級(jí)；大部分肝小葉結(jié)構(gòu)完整，但能夠看到纖維間隔為2級(jí)；肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，纖維間隔較多，但沒有肝硬化為3級(jí)；肝實(shí)質(zhì)受損，纖維彌漫性增生，產(chǎn)生假小葉，肝硬化前期為4級(jí)。

1.4.7 肝臟組織細(xì)胞凋亡率的檢測(cè):利用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。顯微鏡下觀察細(xì)胞核呈棕黃色的凋亡細(xì)胞。每個(gè)試驗(yàn)組分別隨機(jī)選取10張切片，每張切片選擇10個(gè)具有代表性的高倍視野(×400)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.8 Western blot檢測(cè)肝臟組織中PERK、eIF2α、CHOP蛋白的相對(duì)表達(dá)量:從液氮中取出保存的肝臟組織，提取總蛋白檢測(cè)PERK、eIF2α、CHOP蛋白的相對(duì)表達(dá)情況，其中，β-actin蛋白作為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié)果

2.1 大鼠形態(tài)觀察 術(shù)后24 h，模型組和藥物處理組大鼠尿液顏色明顯加深。48 h后，大鼠尾巴和耳朵出現(xiàn)黃染，隨著膽管阻塞時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng)，癥狀越來(lái)越明顯，食欲下降，精神萎靡不振。隨機(jī)抽取大鼠解剖可發(fā)現(xiàn)，膽管畸形擴(kuò)張，肝臟腫大，血液生化指標(biāo)顯示膽紅素水平超標(biāo)，由此，可判斷為造模成功。連續(xù)灌胃4周后發(fā)現(xiàn)，藥物處理組大鼠黃染癥狀減退，與模型組有明顯區(qū)別。

2.2 大鼠血清肝功能指標(biāo)比較 與假手術(shù)組相比，模型組ALT、AST及TBIL含量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，海金沙處理組ALT、AST及TBIL含量明顯下降，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血清中ALT、AST及TBIL比較

2.3 血清肝纖維化指標(biāo)比較 模型組LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col水平明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)。與模型組相比，海金沙低、中、高劑量LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col水平依次降低且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠血清中LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col比較

2.4 5組大鼠肝臟組織病理形態(tài)及肝纖維分級(jí)情況 假手術(shù)組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝竇正常，肝細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞核清晰，呈放射狀，無(wú)明顯炎細(xì)胞和纖維組織增生。模型組大鼠肝小葉受到嚴(yán)重破壞，肝竇充血，肝細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，小葉間膽管及纖維組織增生，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，出現(xiàn)大面積壞死。海金沙高劑量組的肝小葉受損較輕微，肝細(xì)胞排列趨于正常，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和膽管、纖維組織增生。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠纖維化分級(jí)顯著上升(P<0.05)；與模型組相比，海金沙低中高劑量組的分級(jí)評(píng)分顯著下降且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1，表3。

表3 5組大鼠肝纖維化分級(jí)比較

2.5 海金沙對(duì)大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡的影響 與假手術(shù)組相比，模型組肝臟細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。海金沙處理后，肝臟細(xì)胞的凋亡率明顯下降，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表4。

表4 5組大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果

2.6 5組大鼠肝臟中PERK、eIF2α、CHOP蛋白表達(dá)變化 與假手術(shù)組相比，模型組PERK、eIF2α、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，海金沙處理組的PERK、eIF2α、CHOP蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯下降且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表5，圖2。

表5 5組大鼠肝臟組織PERK、eIF2α、CHOP蛋白表達(dá)

圖2 5組大鼠肝臟組織WB檢測(cè)結(jié)果；1 假手術(shù)組；2 模型組；3 海金沙低劑量組；4 海金沙中劑量組；5 海金沙高劑量組

3 討論

阻塞性黃疸是膽汁酸排出受阻形成淤積，并對(duì)肝及其他器官產(chǎn)生的一系列損傷[12-14]，臨床表現(xiàn)為血清中ALT、AST、TBIL明顯超過正常值。本實(shí)驗(yàn)采取結(jié)扎膽總管方法建立阻塞性黃疸大鼠模型，結(jié)果顯示大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)受損嚴(yán)重，肝細(xì)胞大量壞死，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉間膽管及纖維組織增生，血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST、TBIL及肝纖維指標(biāo)LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-Col水平明顯升高，表明阻塞性黃疸可引發(fā)大鼠肝功能受損，肝臟纖維化，造成肝功能障礙，揭示模型建立成功。

海金沙，又稱迷離網(wǎng)、雞膠莽、洗碗藤、金砂蕨等。其根狀莖橫走，葉軸攀援纏繞狀，孢子囊兩行并生，呈穗狀[15]。傳統(tǒng)中藥常以海金沙全草或干燥孢子入藥，其味甘淡、性寒，有清熱解毒、活血通絡(luò)、利濕利膽消腫的功效[16]。海金沙的利膽作用常用做治療膽囊炎，并與其他中藥相輔活血化瘀[17]。在本實(shí)驗(yàn)中采用水提醇沉法，從海金沙中提取活性成分，研究海金沙提取對(duì)阻塞性黃疸大鼠的防治作用。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)海金沙提取物處理后，阻塞性黃疸大鼠肝組織病理?yè)p傷及纖維化程度減輕，肝細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，血清中ALT、AST、TBIL、LN、HA、PCⅢ 及 Ⅳ-Col水平降低，且呈劑量依賴性，表明海金沙可減輕阻塞性黃疸大鼠肝組織病理?yè)p傷，改善肝功能，并隨劑量升高而作用增強(qiáng)。

肝纖維化的發(fā)生與肝細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，抑制肝細(xì)胞凋亡可有效防止肝纖維的進(jìn)展[18]。嚴(yán)重或長(zhǎng)時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將激活凋亡信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其中包括PERK/eIF2α/CHOP通路[19]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肝組織中PERK、eIF2α、CHOP蛋白表達(dá)升高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白PERK表達(dá)增強(qiáng)，以及eIF2α、CHOP表達(dá)明顯增加，說明在阻塞性黃疸肝纖維化過程中發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，可能導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡。李木松等[18]研究發(fā)現(xiàn)，茵陳蒿湯可通過抑制PERK、eIF2α和ATF4的活化，減少肝細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在膽汁淤積性肝纖維化中的促進(jìn)作用。本研究采用海金沙處理后，阻塞性黃疸大鼠肝組織PERK、eIF2α、CHOP蛋白表達(dá)降低，且隨著藥物劑量的增大而更加顯著，表明海金沙可下調(diào)PERK/eIF2α/CHOP通路相關(guān)蛋白表達(dá)，提示海金沙減輕肝組織病理?yè)p傷，延緩細(xì)胞凋亡，修復(fù)肝功能的作用與抑制PERK/eIF2α/CHOP通路有關(guān)。

綜上所述，海金沙可能通過抑制PERK/eIF2α/CHOP通路，降低阻塞性黃疸大鼠肝組織中纖維化水平，減輕肝細(xì)胞凋亡，改善肝功能，為臨床治療阻塞性黃疸的治療提供了新思路。