益生菌Probio-X?對遠(yuǎn)航海員腸道中乳酸菌菌群的影響

呂瑞瑞，楊成聰，趙飛燕，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點實驗室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點實驗室 呼和浩特010018）

長遠(yuǎn)航人員長期處于海面-船艙-甲板空間，在遠(yuǎn)航執(zhí)勤過程中生活工作環(huán)境狹小密閉，生活單調(diào)，工作壓力大，噪音輻射，海上高溫、高濕環(huán)境等因素導(dǎo)致遠(yuǎn)航人員睡眠不足、焦慮甚至抑郁等疾病[1]。長遠(yuǎn)航人員的生活、飲食及心理狀況與陸地工作人員和其他海上作業(yè)人員均有所差異[2]。由于長時間脫離陸地，食物補(bǔ)給周期長，以冷凍冷藏食品為主，食品數(shù)量及種類受空間限制且貯存時間長，因此易導(dǎo)致營養(yǎng)失衡[3]，易導(dǎo)致心腦血管疾病、胃腸道炎癥及免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生。Nie 等[4]報道稱腸道菌群會受到環(huán)境、飲食、遺傳因素等方面的影響。

腸道微生物的數(shù)量約是人體真核細(xì)胞數(shù)量的10 倍[5]，被認(rèn)為是人體虛擬器官，通過基因編碼產(chǎn)生多種代謝物，從而參與人體代謝，影響人體表型及健康[6]。腸道菌群隨著生存環(huán)境、飲食變化及精

收稿日期：2021-01-18

基金項目：國家自然科學(xué)基金國際合作交流項目（31720103911）

作者簡介：呂瑞瑞（1996—），女，碩士生

通信作者：張和平 E-mail：hepingdd@vip.sina.com神狀況而發(fā)生改變。Rothschild 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，飲食、藥物和環(huán)境因素是影響人體腸道微生物群組成的重要因素，而腸道菌群與心腦血管疾病、胃腸道炎癥及神經(jīng)性疾病的發(fā)生均有一定聯(lián)系。研究表明，抑郁癥與個體腸道菌群組成密切相關(guān)，腸道菌群通過腦-腸軸影響焦慮、抑郁等行為[8]。乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）作為腸道中有益微生物，調(diào)節(jié)腸道環(huán)境和維護(hù)腸道菌群平衡，一定數(shù)量乳酸菌常被認(rèn)為可反映人體腸道健康狀態(tài)[9]。益生菌制劑作為新興的保健食品，可調(diào)節(jié)人體腸道菌群結(jié)構(gòu)，幫助宿主建立健康的腸黏膜屏障，提高免疫力[10]。本實驗室研究人員前期通過宏基因組測序方法分析長遠(yuǎn)航海員腸道菌群，發(fā)現(xiàn)益生菌可維持遠(yuǎn)航人員腸道菌群穩(wěn)態(tài)[11]，尚未探究遠(yuǎn)航過程中海員腸道中的乳酸菌是如何變化以及益生菌的攝入是否會對腸道中乳酸菌產(chǎn)生影響。

本研究采用乳酸菌特異性引物與PacBio 三代測序技術(shù)相結(jié)合的方法，對27 名執(zhí)行30 d 遠(yuǎn)洋航海任務(wù)的海員進(jìn)行腸道乳酸菌測序，擬在種水平上揭示長遠(yuǎn)航海員腸道乳酸菌群落組成及其多樣性，并基于腸道特征為其飲食和健康提供參考，以保證該類人群的營養(yǎng)及腸道健康。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 試驗志愿者信息及樣品采集 參考Zhang等[11]試驗設(shè)計，僅招募的志愿者人數(shù)不同。具體試驗設(shè)計流程如下：本研究周期30 d，招募27 名長遠(yuǎn)航海員，隨機(jī)分為兩組，其中復(fù)合益生菌組（Probiotics group）11 人，安慰劑組（Placebo group）16 人。本研究用益生菌Probio-XR是由干酪乳桿菌Zhang（Lactobacillus caseiZhang）、動物雙歧桿菌V9（Bifidobacterium animalisV9）、植物乳桿菌P-8（Lactobacillus plantarumP-8）、動物雙歧桿菌M8（Bifidobacterium animalisM8）和鼠李糖乳桿菌M9（Lactobacillus rhamnosusM9）混合而成，活菌數(shù)為1.5×1010CFU/g。復(fù)合益生菌組每天服用益生菌Probio-XR2 g，安慰劑組服用口味相同的無菌粉末制劑2 g，持續(xù)服用30 d。分別采集出海前（0 d）和出海結(jié)束時（30 d）兩個時間點的糞便樣品。所有志愿者在試驗前6 個月及試驗期間均未服用抗生素類藥物。

1.1.2 主要試劑和儀器 糞便微生物基因組保護(hù)液套裝（LongseeGEN Stool Storage Kit）、PCR 體系試劑（Taq DNA 聚合酶、dNTP mix、10×Easy Taq Buffer 等），大連寶生物工程有限公司；MOBIO 糞便DNA 快速提取試劑盒，美國MoBio 公司；TBE 緩沖液試劑（Na2EDTA·2H2O、Tris 堿、硼酸）、瓊脂糖凝膠，天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑公司；PacBio SMRT 建庫試劑盒，美國太平洋生物科學(xué)公司。

全自動高壓蒸汽滅菌器，日本三洋公司；高速冷凍離心機(jī)，德國艾本德公司；微量紫外分光光度計，美國賽默飛科技公司；Applied Biosystems PCR 儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；HWS24 型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Qubit 2.0核酸蛋白定量儀，美國生命技術(shù)有限公司；UPV 凝膠成像分析系統(tǒng)，上海賽智創(chuàng)業(yè)科學(xué)公司；PacBio SMRT RS II 測序平臺，美國Pacific Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 糞便樣品采集均由海員個人完成，他們均掌握統(tǒng)一糞便采集方法。使用糞便微生物基因組保護(hù)液套裝，采集約15 g 新鮮糞便樣品后，放入-20 ℃冰箱暫存，并盡快運回實驗室并存放于-80°C 冰箱，備用。

1.2.2 糞便宏基因組DNA 提取和檢測 取0.6 g糞便樣品，采用反復(fù)凍融法[12]提取樣品宏基因組DNA。對提取的DNA 樣品用微量紫外分光光度計檢測DNA 的純度和濃度，將符合要求的DNA 樣品存于-20°C 冰箱。

1.2.3 乳酸菌目的片段擴(kuò)增、建庫及測序 乳酸菌基因特異性擴(kuò)增引物[13]如表1所示。在引物兩端加一段包含16 個堿基的識別標(biāo)簽（Barcode），用來區(qū)分同一文庫中的不同樣品。用上述引物對已提取的糞便細(xì)菌宏基因組DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。50 μL PCR 反應(yīng)體系配制：KAPA HiFi HotStart Ready Mix 25 μL；正向、反向引物（10 μmol/L）各1.2 μL；ddH2O 20.6 μL；DNA 模板2 μL。PCR 擴(kuò)增程序：①預(yù)變性98 ℃，3 min；②變性98 ℃，20 s，退火62 ℃，15 s，延伸72 ℃，45 s，26 次循環(huán)；③終端延伸72 ℃，90 s，4 ℃終止。按照以上條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將符合建庫條件的PCR 產(chǎn)物混合，按照上機(jī)說明書進(jìn)行后續(xù)試驗操作，使用PacBio RS II 儀器測序。

表1 乳酸菌特異性引物Table 1 The specific primers of lactic acid bacteria

1.2.4 高質(zhì)量序列的提取 使用SMRTRPortal條件對原始序列進(jìn)行質(zhì)控：①插入片段重復(fù)測序的次數(shù)≥5；②550 bp≤插入序列長度≤950 bp；③最小預(yù)測精確度為90%。質(zhì)控完成后，根據(jù)Barcode 標(biāo)記序列與樣品匹配，刪除Barcode 和引物序列進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2.5 生物信息學(xué)分析 下機(jī)數(shù)據(jù)是基于QIIME平臺（V1.75）對質(zhì)控后序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分析步驟參考Hou 等[14]的方法。以PyNAST 校準(zhǔn)并將序列排齊，在100%相似性下進(jìn)行Uclust 歸并，刪除重復(fù)序列，按照97%相似性劃分操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU），去除嵌合體。分別使用Greengenes（V13.8），RDP（V11.5）和Silva（V128）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 計算香農(nóng)指數(shù)（Shannon Index）和辛普森指數(shù)（Simpson Index）從而評估腸道乳酸菌α 多樣性。對54 份糞便樣品物種豐度表基于Bray-Curtis 距離進(jìn)行NMDS（non-metric multidimensional scaling,NMDS）分析。利用Venn 圖在OTU 水平上分析不同分組間OTU 組成差異。用斯皮爾曼（Spearman）相關(guān)系數(shù)分析樣品中乳酸菌菌種的相關(guān)關(guān)系并進(jìn)行顯著性檢驗，檢驗水平為95%，并使用“gplots”包以熱圖的形式展現(xiàn)相關(guān)性結(jié)果。使用“ggplot2”包對QIIME 分析得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。

1.2.7 核酸序列登記號 將原始數(shù)據(jù)上傳至SRA數(shù)據(jù)庫（PRJNA689416）。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌測序量及多樣性

所有樣品測序完成后下機(jī)得到39 299 條原始序列，經(jīng)QIIME 質(zhì)控去除非乳酸菌序列后得到38 819 條高質(zhì)量序列，用于后續(xù)乳酸菌多樣性分析。

在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步評估在出海前、后海員腸道乳酸菌多樣性以及益生菌對海員腸道乳酸菌的影響（圖1）。由圖1 可知，安慰劑組和復(fù)合益生菌組在出海前、后乳酸菌多樣性均為發(fā)生顯著改變，而復(fù)合益生菌組的乳酸菌多樣性均有增加的趨勢。

圖1 α 多樣性指數(shù)Fig.1 The α diversity index

2.2 乳酸菌菌群組成

乳酸菌作為人體腸道重要的益生菌之一，在健康人體腸道中的相對含量僅占腸道菌群的0.01%～0.18%[15]。準(zhǔn)確揭示長遠(yuǎn)航人員腸道中乳酸菌豐度及多樣性有利于評估海員健康和飲食干預(yù)。27 名長遠(yuǎn)航海員腸道菌群在屬水平和種水平上乳酸菌組成見圖2，其中相對含量<1%屬或者種合并為其它屬或者種。

在屬水平上，共鑒定到57 個屬，每個志愿者平均含有（11±4）個屬，其中平均相對含量>1%的乳酸菌屬有6 個，分別為鏈球菌屬（Streptococcus，55.45%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，24.75%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus，7.15%）、魏斯氏菌屬（Weissella，3.22%）、腸球菌屬（Enterococcus，3.01%）、乳球菌屬（Lactococcus，1.23%）。本文結(jié)果與海南健康青年腸道中乳酸菌多樣性研究的結(jié)果一致[16]。如圖2a所示，遠(yuǎn)航后不同乳酸菌屬發(fā)生波動，益生菌組中鏈球菌屬在出海后相對含量從63.64%降到43.96%，而安慰劑組中該菌屬僅降低1.06%；兩組中乳桿菌屬相對含量均在出海后增加，益生菌組增加23.00%，安慰劑組增加13.00%，變化均不顯著。

圖2 遠(yuǎn)航對腸道乳酸菌組成的影響Fig.2 Effect of long voyage on composition of LAB in intestine

在種水平上，共鑒定到160 個乳酸菌種，每個志愿者平均含有（22±7）個菌種，其中平均相對含量>1%的乳酸菌種有14 個，分別為嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，31.05%）、瘤胃乳桿菌（Lactobacillus ruminis，9.31%）、副溶血鏈球菌（Streptococcus parasanguinis，6.90%）、唾液鏈球菌（Streptococcus salivarius，4.11%）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，3.47%）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum，3.43%）、巴氏鏈球菌（Streptococcus pasteurianus，2.88%）、融合魏斯氏菌（Weissella confusa，2.50%）、唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius，2.09%）、伶俐瘤胃球菌（Ruminococcus callidus，1.46%）、糞瘤胃球菌（Ruminococcus faecis，1.42%）、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei，1.06%）、耐久腸球菌（Enterococcus durans，1.02%）、羅氏乳桿菌（Lactobacillusrogosae，1.01%）。前期研究結(jié)果表明唾液鏈球菌相對含量最高，未檢測到嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌和巴氏鏈球菌等菌種[16-17]。分析可能是由于海洋與陸地生活、工作環(huán)境的差異所致，海上高溫、高濕環(huán)境以及飲食限制等因素造成腸道中乳酸菌菌群結(jié)構(gòu)的差異。與出海前相比，出海后益生菌組和安慰劑組嗜熱鏈球菌的相對含量均下降10.00%；與出海前相比，出海后益生菌組的副血鏈球菌相對含量約下降2.00%，而安慰劑組的相對含量升高8.00%；海員出海后植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌相對含量均升高，益生菌組增加10.00%，安慰劑組僅增加4.00%；益生菌組的巴氏鏈球菌相對含量提高5.00%，而安慰劑組在出海后基本無變化。

2.3 乳酸菌群落結(jié)構(gòu)分析

Venn 圖常用于反映樣品間共有和獨有物種情況。本研究在OTU 水平，通過Venn 圖對各組樣品腸道乳酸菌進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示（圖3）各組之間乳酸菌差異比較明顯。在OTU 水平上，在4個分組共發(fā)現(xiàn)1 348 個OTU，其中各分組特有OTU 數(shù)量各不同，益生菌組（0 d）有175 個，益生菌組（30 d）有353 個，安慰劑組（0 d）有384 個，安慰劑組（30 d）有498 個，核心OTU 為5 個。結(jié)果顯示遠(yuǎn)航后益生菌組和安慰劑組特有OTU 均增加，與呂偉[2]采用二代測序方式對海員腸道菌群的分析結(jié)果一致，這可能是因受海洋環(huán)境影響，出海后海員腸道菌群中水源性微生物數(shù)量和含量增加。

圖3 OTU 水平下不同分組中乳酸菌韋恩圖Fig.3 Venn diagram of lactic acid bacteria in different groups at OTU level

腸道菌群結(jié)構(gòu)對于維持宿主機(jī)體平衡以及健康具有重要意義[18]。無度量多維標(biāo)定法（Nonmetric multi-dimensional scaling,NMDS），適用于生態(tài)學(xué)研究的排列方法，反映組內(nèi)或組間樣本差異。本研究對所有樣品中乳酸菌相對含量進(jìn)行NMDS 分析（圖4）。圖4 中各樣本點分布并無顯著聚類趨勢，表明4 組糞便樣品中乳酸菌結(jié)構(gòu)變化有限。益生菌組和安慰劑組各組內(nèi)樣本也沒有顯著聚類現(xiàn)象，這可能是因為人體腸道菌群具有自身調(diào)節(jié)功能，在不同環(huán)境下可進(jìn)行穩(wěn)態(tài)調(diào)整。呂偉[2]前期研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)航后海員腸道菌群雖會發(fā)生變化，但并不會過度紊亂，亦或因遠(yuǎn)航海員長期共同生活在船艙，故菌群之間發(fā)生交換。前期研究發(fā)現(xiàn)同居人群腸道微生物群落會隨時間變化發(fā)生聚集性變化，且腸道菌群生態(tài)系統(tǒng)具有一定的個體適應(yīng)力[19]。

圖4 基于乳酸菌菌種相對含量的NMDS 分析Fig.4 NMDS analysis based on relative abundance of lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌菌群相關(guān)性分析及益生菌對腸道乳酸菌的影響

腸道微生物通過相互作用維持人類腸道健康及穩(wěn)態(tài)，可代謝營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生細(xì)菌素、乳酸和其它代謝物，促進(jìn)有益菌的繁殖并抑制有害菌生長，保持腸道菌群處于相對平衡的狀態(tài)[20]。為揭示人體腸道乳酸菌之間的關(guān)系，選取相對含量大于1%的物種進(jìn)行Spearman 相關(guān)性分析（圖5）。結(jié)果顯示，嗜熱鏈球菌和副血鏈球菌、唾液鏈球菌呈顯著正相關(guān)（r=0.33，r=0.71），與發(fā)酵乳桿菌、瘤胃乳桿菌呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.34，r=-0.45）；瘤胃乳桿菌和副血鏈球菌、唾液鏈球菌、羅氏乳桿菌呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.45，r=-0.37，r=-0.28）；副血鏈球菌和唾液鏈球菌呈顯著正相關(guān)（r=0.61）；植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌呈顯著正相關(guān)（r=0.30）；副血鏈球菌和伶俐瘤胃球菌呈顯著負(fù)相關(guān)（r=0.28）；糞便瘤胃球菌和羅氏乳桿菌呈顯著正相關(guān)（r=0.48）。

圖5 腸道中乳酸菌的相關(guān)性Fig.5 Spearman's rank correlation of LAB in the gut

為進(jìn)一步探究益生菌的攝入在物種水平上對腸道乳酸菌的影響，本文采用Wilcox 檢驗揭示乳酸菌菌種差異（圖6）。由圖6 可知，遠(yuǎn)航前，益生菌組和安慰劑組的副血鏈球菌（Streptococcus parasanguinis）并無顯著差異，遠(yuǎn)航后，安慰劑組中該菌相對含量顯著高于益生菌組（P<0.05）；血鏈球菌（Streptococcus sanguinis）相對含量在益生菌組（30 d）顯著減少（P<0.05），但安慰劑組30 d 時該菌并未發(fā)生顯著變化。有研究報道副血鏈球菌是導(dǎo)致牙菌斑（dental plaque）形成的早期微生物之一，且當(dāng)該菌侵入血流，可引起伺機(jī)性之心內(nèi)膜炎感染[21]。血鏈球菌屬于條件致病菌，常定植于口腔、鼻咽部及消化道等部位，血鏈球菌不僅可導(dǎo)致

圖6 遠(yuǎn)航后具有顯著差異的乳酸菌菌種（P<0.05）Fig.6 LAB strains with significant differences after long-voyage（P<0.05）

心內(nèi)膜炎，還可誘發(fā)動脈粥樣硬化[22-23]。在遠(yuǎn)航過程中攝入益生菌Probio-FitR顯著抑制海員腸道中副血鏈球菌和血鏈球菌增殖，在一定程度上維護(hù)了海員腸道健康。Turroni 等[24]發(fā)現(xiàn)益生菌進(jìn)入宿主可通過刺激自身免疫，從而促進(jìn)腸道微生物平衡，維持宿主健康。

2.5 遠(yuǎn)洋航行后海員腸型的變化

Arumugam 等[25]提出腸型的概念，目前已知有以擬桿菌屬（Bacteroides）、普氏菌屬（Prevotella）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）為優(yōu)勢菌屬的3 種腸型。本研究基于多維聚類分析和PCoA，分析遠(yuǎn)航前、后益生菌組和安慰劑組海員腸道中優(yōu)勢乳酸菌腸型簇，結(jié)果顯示（圖7），海員腸道菌群主要分為4 種腸型，腸型優(yōu)勢乳酸菌分別為唾液乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、唾液鏈球菌和嗜熱鏈球菌，每類腸型以1 個或2 個優(yōu)勢乳酸菌組成。部分海員最初腸道以唾液鏈球菌和嗜熱鏈球菌或僅嗜熱鏈球菌為特征，在遠(yuǎn)航后轉(zhuǎn)變以植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌或唾液乳桿菌為優(yōu)勢菌的乳酸菌腸型。另一部分海員乳酸菌腸型簇未發(fā)生變化。為探究出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因，將出海前海員分為腸型變化組（C 組）和腸型未變組（U 組），作者發(fā)現(xiàn)U 組海員原始乳酸菌菌群中的Streptococcus sinensis和副血鏈球菌顯著高于C 組（P<0.05），特別是副血鏈球菌在C 組中平均相對含量為7.23%，在U組僅為2.16%，而副血鏈球菌和嗜熱鏈球菌、唾液鏈球菌為顯著正相關(guān)，故認(rèn)為副血鏈球菌促進(jìn)以鏈球菌屬為主的兩類乳酸菌腸型的穩(wěn)定。C 組中乳酸菌腸型發(fā)生改變的原因可能是部分海員自身腸道中嗜熱鏈球菌和唾液鏈球菌相對含量較少，且益生菌組海員攝入包含植物乳桿菌 P-8 的益生菌制劑，植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌呈正相關(guān)，因前者的良好的定殖能力[11]，促進(jìn)后者增殖，最終使該類海員乳酸菌腸型發(fā)生改變。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌能調(diào)節(jié)天然免疫與適應(yīng)性免疫，具有抗炎癥作用[26]。益生菌Probio-X?促進(jìn)腸道乳酸菌組成發(fā)生了更有利的改變，有益菌的數(shù)量增多，先前的研究表明因個體間的差異可能導(dǎo)致攝入后益生菌的反應(yīng)不同，益生菌Probio-X?對腸道乳酸菌組成產(chǎn)生個人特異性影響[27]。然而本研究樣本量較小，仍有待研究。綜上所述，食用益生菌Probio-X?在一定程度上改變了海員乳酸菌腸型，而這種改變?nèi)Q于腸道原始乳酸菌的類別和基礎(chǔ)數(shù)量。

圖7 長遠(yuǎn)航對海員腸道乳酸菌菌群特征的影響Fig.7 The effect of long-voyage on the characteristics of Lactobacillus enterotype-like cluster in seafarers

3 結(jié)論

本研究采用乳酸菌特異性引物和第3 代測序技術(shù)相結(jié)合，對27 名長遠(yuǎn)航海員腸道中乳酸菌豐度及其多樣性進(jìn)行檢測，共鑒定到57 個屬和160個菌種。遠(yuǎn)航后海員腸道中乳酸菌多樣性增加，復(fù)合益生菌組和安慰劑組腸道乳酸菌結(jié)構(gòu)雖無顯著差異，而在物種水平上，益生菌干預(yù)可顯著抑制長遠(yuǎn)航海員腸道中副血鏈球菌和血鏈球菌的增長。攝入益生菌使部分海員乳酸菌腸型中優(yōu)勢菌由鏈球菌屬變?yōu)槿闂U菌屬，而這種改變?nèi)Q于腸道原始乳酸菌的類別和基礎(chǔ)數(shù)量。