超聲輔助雙連續(xù)型離子液體微乳液提取南極磷蝦殼中的蝦青素

張莉莉，溫淑媚，高 靜

（1 廣東藥科大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 廣東中山528458 2 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院 廣東湛江524088）

蝦青素（3，3′-二羥基-4，4 ′-二酮基-β，β′-胡蘿卜素）分子結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵、β-紫羅蘭酮環(huán)以及羥基，有“最強(qiáng)抗氧化劑”和“超級(jí)維生素E”之稱(chēng)[1]。此外，蝦青素具有抗脂質(zhì)氧化、抗炎、抗糖尿病、心血管疾病預(yù)防、免疫調(diào)節(jié)及抗癌變等作用，在飼料、食品、醫(yī)藥以及化妝品等領(lǐng)域展現(xiàn)出極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景[2-4]。目前，商業(yè)獲取蝦青素主要通過(guò)化學(xué)合成和天然提取兩種途徑，且90%以上是化學(xué)合成蝦青素。然而，化學(xué)合成蝦青素與天然蝦青素在結(jié)構(gòu)、功能、應(yīng)用及安全等方面存在較大差距。近年來(lái)，人們?nèi)找嬖鲩L(zhǎng)的食品安全意識(shí)及政府部門(mén)對(duì)蝦青素安全性的嚴(yán)格監(jiān)管，使從生物資源中獲取天然蝦青素成為廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)。然而，堿提法對(duì)設(shè)備腐蝕嚴(yán)重；有機(jī)溶劑法存在試劑殘留、污染環(huán)境的風(fēng)險(xiǎn)；植物油黏度大不利于蝦青素分離純化。不僅如此，傳統(tǒng)提取過(guò)程因溫度高、時(shí)間長(zhǎng)而導(dǎo)致蝦青素的部分降解，不利于維持其穩(wěn)定性和生物活性[5]。由于提取技術(shù)研究基礎(chǔ)薄弱，天然蝦青素的產(chǎn)量十分有限，因此遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需求。探索萃取天然蝦青素的理想溶劑體系成為該領(lǐng)域亟待攻克的技術(shù)瓶頸。

離子液體具有熔點(diǎn)低、熱穩(wěn)定性好、溶解能力強(qiáng)以及可設(shè)計(jì)等優(yōu)點(diǎn)，已成功用于蝦青素等天然活性物質(zhì)的萃取[6-7]。此外，Martins 等[8]研究表明中、低劑量的離子液體不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損傷，離子液體在食品領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用潛力。然而，離子液體單獨(dú)作為提取劑不僅價(jià)格昂貴，而且黏度大，在萃取過(guò)程中通常以助劑的形式添加到有機(jī)溶劑中使用[9-10]。例如，Desai 等[11]利用1-乙基-3-甲基咪唑二丁基磷酸酯水溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%）輔助乙酸乙酯，于45 ℃下從雨生紅球藻中提取蝦青素，因提取體系性質(zhì)不穩(wěn)定，故提取率僅達(dá)到70%。微乳液是由兩種互不相溶的液體在表面活性劑界面膜的作用下形成熱力學(xué)穩(wěn)定，各向同性和透明的均相分散體系[12]。近年來(lái)，離子液體微乳液體系已廣泛應(yīng)用于萃取[13-14]、催化[15]、酶工程[16]、納米材料[17]和生物質(zhì)預(yù)處理[18]等多個(gè)領(lǐng)域。例如，Cao 等[13]以30 μL 海藻酸鈉硫酸鹽混合0.005 g 雙（2-乙基己基）磺基琥珀酸鈉（AOT），加入270 μL 1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸（[Bmim]PF6）作水相構(gòu)筑離子液體微乳液，于室溫下從牛血清白蛋白中提取低密度脂蛋白，提取率達(dá)83%。類(lèi)似的，Shu 等[19]利用50 μL AOT 水溶液（0.5 mol/L）和450 μL[Bmim]PF6制備離子液體反相微乳液，在室溫下振蕩10 min，血紅蛋白提取率高達(dá)96%。

盡管如此，現(xiàn)有微乳液體系的研究局限在采用咪唑基離子液體作為主要成分，其微乳液的特性更適宜于提取親水性分子。更重要的是，微乳液體系提取天然蝦青素仍有許多基礎(chǔ)科學(xué)問(wèn)題尚未解決，如：一是蝦青素難溶于水，而含水微乳液體系中水含量高達(dá)50%，如何提供適宜蝦青素溶解的內(nèi)部條件？ 二是蝦青素的穩(wěn)定性受多重因素影響，如何準(zhǔn)確調(diào)控利于蝦青素萃取的外部環(huán)境？這是微乳液萃取疏水性分子的基礎(chǔ)以及應(yīng)用基礎(chǔ)研究中面臨的共性難題。

本文針對(duì)從生物資源中提取天然蝦青素的迫切需求，傳統(tǒng)萃取方法面臨的技術(shù)瓶頸以及現(xiàn)代微乳液萃取體系面臨的新挑戰(zhàn)，以膦基鹽離子液體替代咪唑基離子液體（化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示），以卵磷脂替代親水性表面活性劑構(gòu)筑一種新型微乳液體系，采用超聲輔助從南極磷蝦殼中提取蝦青素。首先研究離子液體種類(lèi)、表面活性劑與助表面活性劑的比例（Km）和溫度3 個(gè)因素對(duì)微乳液相行為的影響，并以電導(dǎo)率、動(dòng)態(tài)光散射等方法表征微乳液體系的微觀結(jié)構(gòu)。然后，以離子液體微乳液為溶劑體系，從南極磷蝦殼中萃取天然蝦青素，研究不同條件下蝦青素提取率，以及溫度對(duì)蝦青素穩(wěn)定性的影響規(guī)律。最后，通過(guò)分析提取蝦青素后蝦殼殘?jiān)慕Y(jié)構(gòu)特點(diǎn)，揭示離子液體微乳液提取南極磷蝦殼中蝦青素的機(jī)理。

圖1 離子液體的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of ionic liquids

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

南極磷蝦，廣東省湛江市國(guó)聯(lián)水產(chǎn)食品有限公司；卵磷脂（Lecithin，來(lái)源于大豆，純度＞98%）、正丁醇（純度＞99.5%）、蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%），上海Aladdin 化學(xué)試劑公司；四丁基三氟乙酸膦（[P4444]CF3COO）、辛基三丁基溴化膦（[P4448]Br）（純度均>95%），中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所；所有分離用有機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LD-20AD 凝膠滲透液相色譜儀，日本島津公司；DDSJ-308A 電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Zetasizer NANO ZS90 動(dòng)態(tài)光散射儀，英國(guó)Malvern Panalytical 公司；KQ-300 超聲波清洗器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；HH-6 數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；AW120 電子天平，日本島津公司；UV757CRT 紫外分光光度計(jì)，上海精科儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 擬三元相圖繪制 首先固定卵磷脂與正丁醇的質(zhì)量比（Km=1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7 或1∶8），準(zhǔn)確稱(chēng)取質(zhì)量比為9∶1，8∶2，7∶3，6∶4，5∶5，4∶6，3∶7，2∶8，1∶9 的離子液體和復(fù)合表面活性劑，經(jīng)漩渦振蕩后，分別在30 ℃和60 ℃下逐步加水，使其充分振蕩并以超聲輔助至其混勻，當(dāng)溶液由澄清透明轉(zhuǎn)變至渾濁分層時(shí)，記錄水的質(zhì)量，并計(jì)算各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。Origin 軟件繪制得三元相圖，相分離臨界點(diǎn)各組分質(zhì)量比所對(duì)應(yīng)的點(diǎn)依次連成的曲線即為單相區(qū)和多相區(qū)的邊界[20]。

1.3.2 微觀結(jié)構(gòu)表征 固定Km，配制不同R值（離子液體與復(fù)合表面活性劑的比例）的溶液并將其置于恒溫水浴，達(dá)到熱力學(xué)平衡后，使用移液槍逐個(gè)加蒸餾水，每加一次水，旋渦儀振蕩至均勻，待體系溫度穩(wěn)定平衡后，用電導(dǎo)率儀測(cè)定離子液體微乳液體系的電導(dǎo)率，記錄加入水的量和電導(dǎo)率值，根據(jù)體系電導(dǎo)率隨水質(zhì)量分?jǐn)?shù)改變的曲線劃分微乳液的微區(qū)結(jié)構(gòu)[21]。

1.3.3 粒徑測(cè)定 通過(guò)使用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）即激光粒度儀測(cè)量離子液體/卵磷脂/正丁醇/水在30℃和60 ℃下的粒徑分布和粒徑變化。

1.3.4 提取蝦青素 洗凈南極磷蝦殼，冷凍干燥48 h 后取出并將其置于高速粉碎機(jī)粉碎，過(guò)120目篩，于-18 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩ｋS后按照質(zhì)量比為離子液體∶卵磷脂∶正丁醇∶水=0.2∶0.12∶0.48∶0.2 配制離子液體微乳液。控制溫度為30 ℃，以不同溶劑提取蝦青素，確定最佳微乳液體系。隨后在超聲輔助條件下測(cè)定固液比、體系組分、超聲功率和超聲時(shí)間對(duì)蝦青素提取的影響規(guī)律。

1.3.5 高效液相色譜測(cè)定蝦青素含量 將提取液充分離心，取1 mL 蝦青素上清液于10 mL 棕色容量瓶中定容，過(guò)0.45 μm 有機(jī)膜待用。色譜柱：C18；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶二氯甲烷∶水=85.0∶5.5∶5.0∶4.5（體積比）（A）、甲醇∶乙腈∶二氯甲烷∶水=28∶42.5∶25∶4.5（體積比）（B）；流速：1.00 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：474 nm；進(jìn)樣量：20 μL[22]。蝦青素提取量計(jì)算公式：

式中：X——蝦青素提取量，μg/g；c——由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的蝦青素質(zhì)量濃度，μg/mL；V——提取液體積，mL；N——稀釋倍數(shù)；m——蝦殼粉質(zhì)量，g。

1.3.6 蝦青素穩(wěn)定性測(cè)定 將反萃取所獲蝦青素提取物溶于乙醇，分別置于25～55 ℃下加熱，利用紫外分光光度計(jì)在474 nm 處測(cè)定0，2，4，8，12 h的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

試驗(yàn)均3 次平行測(cè)定，采用軟件JMP 進(jìn)行顯著性分析，P<0.05 時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 試驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 離子液體微乳液體系的構(gòu)建與表征

2.1.1 相行為

1）離子液體種類(lèi)的影響 離子液體由不對(duì)稱(chēng)有機(jī)陽(yáng)離子和有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子組成，自身結(jié)構(gòu)對(duì)離子液體的親疏水性質(zhì)起到?jīng)Q定作用，也是影響其微乳液內(nèi)部結(jié)構(gòu)的首要因素[23]。圖2a 列舉了60 ℃時(shí)[P4444]CF3COO 或[P4448]Br 與卵磷脂、正丁醇、水形成的微乳液體系的擬三元相圖。微乳液?jiǎn)蜗鄥^(qū)域面積越大，表明各組分形成微乳的能力越強(qiáng)[24]。可以看出，離子液體成相能力關(guān)系為：[P4444]CF3COO>[P4448]Br。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，盡管離子液體的陰離子Br-的親水性指數(shù)大于CF3COO-，但是陽(yáng)離子[P4448]+比[P4444]+側(cè)鏈長(zhǎng)，摩爾體積大，因此，[P4448]Br（HI=6.7）較[P4444]CF3COO（HI=9.0）具有更強(qiáng)的疏水性[25]。由此可見(jiàn)，在離子液體/卵磷脂/正丁醇/水微乳液體系中離子液體的陽(yáng)離子摩爾體積是影響其微乳液成相能力的主要因素。

2）Km的影響 表面活性劑與助表面活性劑的比例Km是影響微乳液內(nèi)部結(jié)構(gòu)的另一個(gè)重要因素。例如，Wang 等[26]構(gòu)建甘油三油酸酯/TX-100/正丁醇/[Bmim]BF4微乳液體系，表明Km對(duì)甘油三油酸酯基離子液體微乳液體系相行為具有重要的影響作用。為了降低表面活性劑的毒性，本文采用卵磷脂替代傳統(tǒng)親水性表面活性劑。卵磷脂是一種重要的生物表面活性劑，在醫(yī)藥保健、食品工業(yè)、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[27-29]。但是，卵磷脂常溫下為固體，單獨(dú)以此作表面活性劑不利于離子液體的微乳化。Amiri-Rigi 等[30]利用卵磷脂/1-丙醇/橄欖油/水微乳液從工業(yè)番茄渣中提取番茄紅素，提取率達(dá)88%。醇類(lèi)的加入促使卵磷脂溶解后填補(bǔ)表面活性劑的空隙，使界面張力降低，并增加其流動(dòng)性[31-32]。據(jù)此，以正丁醇作為助表面活性劑，繪制不同Km下離子液體/卵磷脂/正丁醇/水微乳液體系在35 ℃下的擬三元相圖。

以[P4444]CF3COO 微乳液為例，Km=1∶8 的微乳區(qū)面積比Km=1∶3 的有所增加，但在1∶3～1∶7 范圍內(nèi)變化不明顯，如圖2b所示。當(dāng)離子液體為[P4448]Br 時(shí)也有類(lèi)似的結(jié)果。表面活性劑和助表面活性劑的比例對(duì)微乳液成相能力的影響主要與其親水親油平衡值（HLB）有關(guān)[33]。卵磷脂的HLB=7.0，正丁醇的HLB=6.9，二者十分接近，在不同Km條件下所計(jì)算的復(fù)合表面活性劑HLB 值差異不顯著，這解釋了Km對(duì)離子液體微乳液成相能力影響不顯著的原因。但是，當(dāng)Km值小于1∶3 時(shí)，因體系黏度過(guò)大而難以形成流動(dòng)性良好的微乳液。

3）溫度的影響Alexandridis 等[34]采用嵌段共聚物探究了膠團(tuán)萃取過(guò)程中溫度變化對(duì)膠團(tuán)與伸展單體間發(fā)生轉(zhuǎn)變行為的影響作用，研究表明溫度是影響微乳液內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化的重要因素。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，[P4444]CF3COO 或[P4448]Br 與水、TX-100 形成的微乳液具有低臨界溶解溫度（LCST）的相轉(zhuǎn)變行為，而四丁基四氟硼酸膦（[P4444]BF4）、三丁基辛基三氟乙酸膦（[P4448]CF3COO）或三丁基辛基四氟硼酸膦（[P4448]BF4）微乳液具有高臨界溶解溫度（UCST）的相轉(zhuǎn)變行為[23]。不僅如此，溫度還是影響生物活性分子的穩(wěn)定性和功能的關(guān)鍵因子。例如，Liu 等[35]研究了物質(zhì)的量比為1∶1 的檸檬酸與葡萄糖合成的低共熔溶劑、甲醇等體系提取的姜黃素穩(wěn)定性隨溫度的變化規(guī)律，結(jié)果表明，溫度過(guò)高，姜黃素分子降解迅速，溫度過(guò)低，溶劑體系傳質(zhì)減弱從而抑制了姜黃素的溶出。因此，探索溫度對(duì)離子液體微乳液體系的影響規(guī)律可以為蝦青素的溶解提供良好的外部環(huán)境。

圖2c 和圖2d 分別為20～70 ℃下[P4448]Br 和[P4444]CF3COO 微乳液體系的相圖。整體來(lái)看，單相區(qū)域面積隨溫度的升高而增大，表明高溫利于微乳液體系的形成。咪唑基離子液體也存在類(lèi)似的微乳液相行為特點(diǎn)[36]。與此相反，在[P4444]CF3COO/TX-100/正丁醇/水和[P4448]Br/TX-100/正丁醇/水微乳液中，單相面積隨溫度升高而降低[23]。這可能是因?yàn)槁蚜字瑵B透到離子液體相后，更多地進(jìn)入了柵欄層，升高溫度使其在離子液體中的溶解度增加，從而使單相面積增大[37]。另一方面，[P4444]CF3COO 微乳液的單相區(qū)面積隨溫度變化較大，說(shuō)明該離子液體的疏水性受溫度影響顯著，可以通過(guò)調(diào)控溫度實(shí)現(xiàn)“破乳”和蝦青素的分離純化以及離子液體的循環(huán)利用。而[P4448]Br/卵磷脂/正丁醇/水微乳液體系的相平衡隨溫度變化相對(duì)較弱，說(shuō)明該體系熱物理學(xué)性質(zhì)更加穩(wěn)定。

圖2 離子液體微乳液體系的擬三元相圖Fig.2 Phase diagrams of ionic liquid microemulsions

2.1.2 微觀結(jié)構(gòu) 通過(guò)測(cè)定電導(dǎo)率來(lái)劃分微乳液?jiǎn)蜗鄥^(qū)是研究微乳液微觀結(jié)構(gòu)的常用方法。如圖3所示，含水量較低時(shí)，電導(dǎo)率隨水分子含量的增加而迅速升高。當(dāng)水分含量增加到一定程度，導(dǎo)電的微粒間距較大而彼此不相連，只能靠分散水滴碰撞導(dǎo)電，因此電導(dǎo)率緩慢上升，直至混合體系出現(xiàn)渾濁。據(jù)此判斷，離子液體/卵磷脂/正丁醇/水微乳液體系的微觀結(jié)構(gòu)主要包括離子液體包水（W/IL）型和雙連續(xù)（B）型兩種，是因?yàn)槁蚜字腍LB值較低，油脂含量較高，有助于W/IL 型微乳液的形成。根據(jù)電導(dǎo)率變化關(guān)系，繪制離子液體微乳液微區(qū)結(jié)構(gòu)（圖4），為該溶劑體系萃取蝦青素選擇合適的組分比例提供依據(jù)。

圖3 30 ℃下離子液體微乳液的電導(dǎo)率Fig.3 Conductivity of ionic liquid micromulsions at 30 ℃

圖4 30 ℃下離子液體微乳液體系微區(qū)劃分Fig.4 Microsctructure of ionic liquid microemulsions at 30 ℃

2.1.3 粒徑分布 根據(jù)離子液體微乳液的微區(qū)，按照離子液體∶卵磷脂∶正丁醇∶水質(zhì)量比為0.2∶0.12∶0.48∶0.2 配制了雙連續(xù)型微乳液體系，并在30～60 ℃范圍內(nèi)測(cè)定其粒徑分布和平均粒徑。如圖5所示，[P4448]Br 和[P4444]CF3COO 兩種離子液體微乳液在30 ℃時(shí)的平均粒徑分別為56.74 nm 和60.04 nm，均小于100 nm，證明在該溫度下[P4448]Br和[P4444]CF3COO 能夠與卵磷脂、正丁醇、水形成微乳液（<100 nm）。該結(jié)論與圖2 和圖4 中離子液體微乳液的相平衡結(jié)果相一致。

圖5 [P4444]CF3COO 微乳液和[P4448]Br 微乳液的粒徑分布Fig.5 Size distribution of[P4444]CF3COO-based microemulsions and[P4448]Br-based microemulsions

文獻(xiàn)報(bào)道1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽/TX-100/環(huán)己烷微乳液的粒徑隨溫度升高而增大，出現(xiàn)這一結(jié)果的主要原因是溫度升高致使表面活性劑尾基在有機(jī)溶劑中溶解度增強(qiáng)，減少了表面活性劑膜的界面曲率和分散水分子之間的氫鍵或水化作用，最終導(dǎo)致粒徑增加[38]。對(duì)于[P4448]Br 和[P4444]CF3COO 微乳液，粒徑隨溫度升高整體也呈現(xiàn)增大趨勢(shì)。當(dāng)溫度由30 ℃升高至60 ℃，[P4444]CF3COO 微乳液體系粒徑由60.04 nm 增至1 167 nm，較[P4448]Br 微乳液（由56.74 nm 增至133.0 nm）變化更顯著，與其相圖中單相區(qū)域面積變化規(guī)律一致（圖2），這從微觀角度進(jìn)一步解釋了[P4448]Br 和[P4444]CF3COO 微乳液相平衡隨溫度變化差異的原因。即溫度的增加使[P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水體系各組分的乳化作用增強(qiáng)，進(jìn)而膠束溶脹形成微乳液。然而，溫度過(guò)高不僅促使體系揮發(fā)過(guò)快，導(dǎo)致反應(yīng)環(huán)境縮小，而且加劇粒子相互碰撞，破壞微乳液熱力學(xué)穩(wěn)定體系，最終因產(chǎn)生團(tuán)聚而導(dǎo)致粒徑增大。

2.2 離子液體微乳液提取蝦青素

2.2.1 比較不同溶劑的影響 乙醇是工業(yè)中提取蝦青素常用的試劑[39]。首先將離子液體微乳液萃取蝦青素的能力與水、有機(jī)試劑、純離子液體相比較，結(jié)果如圖6所示。不同溶劑從南極磷蝦殼中提取蝦青素的能力如下：[P4444]CF3COO 微乳液≈[P4448]Br 微乳液≈乙醇≈正丁醇>[P4444]CF3COO >水>>[P4448]Br。當(dāng)溫度為30 ℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%，提取時(shí)間為30 min 時(shí)，采用[P4444]CF3COO 微乳液提取蝦青素的結(jié)果為（25.41±0.48）μg/g。

值得注意的是，純離子液體常因離子液體分子之間以團(tuán)簇形式相互作用形成黏度大的分子結(jié)構(gòu)不利于傳質(zhì)而在生物分子萃取領(lǐng)域受到局限[31]。[P4448]Br 在室溫下呈現(xiàn)黏稠狀，難以提取蝦青素。[P4444]CF3COO 具有一定流動(dòng)性，但是傳質(zhì)速率仍然很低。離子液體微乳液體系因含有一定質(zhì)量的水和醇類(lèi)表面活性劑從而黏度小，利于蝦青素的遷移。因此，離子液體微乳液不僅保留了純離子液體的極性特征，而且黏度低，可以替代有機(jī)溶劑作為蝦青素的理想溶劑。

2.2.2 固液比的影響 為了進(jìn)一步促進(jìn)蝦青素在離子液體微乳液體系中的溶解能力，采用超聲輔助微乳液從南極磷蝦殼中提取蝦青素。Amiri-Rigi等[40]以皂苷作表面活性劑、甘油為助表面活性劑、雙蒸水作水相構(gòu)建微乳液體系并從番茄工業(yè)廢棄物中提取番茄紅素，當(dāng)在一定范圍內(nèi)增大微乳液的用量時(shí)，番茄紅素的溶解度顯著增加。類(lèi)似的，[P4444]CF3COO 微乳液固液比從1∶10 增加到1∶90，蝦青素的提取量從（9.17±1.20）μg/g 增加到（55.54±5.22）μg/g，但[P4444]CF3COO 微乳液固液比增至1∶60 后微乳液用量的進(jìn)一步增加對(duì)提高蝦青素提取量沒(méi)有顯著性影響（圖6）。因此，當(dāng)超聲功率與超聲時(shí)間分別為60 W 和30 min，微乳液體系組成為[P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水（質(zhì)量比=0.2∶0.12∶0.48∶0.2），質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.7%時(shí)，蝦青素提取量達(dá)到（45.09±2.67）μg/g。

2.2.3 組分的影響 不同的組分比例對(duì)離子液體微乳液的微觀結(jié)構(gòu)有顯著影響，從而決定了對(duì)生物分子的溶解能力。在超聲功率60 W，超聲時(shí)間30 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.7%條件下，測(cè)定了微乳液的不同組分質(zhì)量比（離子液體∶卵磷脂∶正丁醇∶水）對(duì)蝦青素提取量的影響。

從圖6 可以看出，當(dāng)[P4444]CF3COO 含量由20%增至35%，離子液體微乳液對(duì)蝦青素的提取量由（45.09±2.67）μg/g 降低至（38.53±0.08）μg/g。一方面因?yàn)閇P4444]CF3COO 用量過(guò)多導(dǎo)致微乳液體系黏度增大而不利于傳質(zhì)，這與圖6a 中純離子液體對(duì)蝦青素提取率較低的結(jié)果一致。另一方面，離子液體含量的逐漸增大促使微乳液的微觀結(jié)構(gòu)從雙連續(xù)型轉(zhuǎn)變?yōu)殡x子液體包水型（圖4），蝦青素難以溶解在“水池”中，因此該微觀結(jié)構(gòu)不利于蝦青素的提取。當(dāng)微乳液體系組成為[P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水（質(zhì)量比=0.2∶0.12∶0.48∶0.2）時(shí)，微乳液為雙連續(xù)型微觀結(jié)構(gòu)，對(duì)蝦青素溶解能力強(qiáng)。

圖6 [P4444]CF3COO 微乳液提取蝦青素Fig.6 Extraction of astaxanthin by[P4444]CF3COO-based microemulsions

2.2.4 超聲功率和時(shí)間的影響 與乙醇等有機(jī)試劑相比，離子液體微乳液黏度較純離子液體雖有降低，但仍存在較大的內(nèi)摩擦力。因此傳統(tǒng)植物油提取法常采用升溫降低溶劑體系黏度進(jìn)行萃取。例如，向日葵油或向日葵油甲酯于70 ℃處理蝦廢棄物150 min，所獲蝦青素提取率分別為60%和80%[41]。然而，該方法不僅提取率低而且不利于生物分子活性的保持。超聲輔助是常溫下提取生物分子的重要輔助手段之一[42]。Zhao 等[43]利用超聲輔助探究蝦青素穩(wěn)定性隨超聲功率和時(shí)間的變化規(guī)律，結(jié)果表明超聲時(shí)間的增加利于增加物料與液體的有效接觸時(shí)間，促進(jìn)蝦青素的有效溶解，從而獲得更高提取量。然而，超聲功率以及處理時(shí)間的進(jìn)一步增長(zhǎng)均會(huì)導(dǎo)致蝦青素降解加速。

為了進(jìn)一步提高蝦青素的提取效率，以[P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水（質(zhì)量比=0.2∶0.12∶0.48∶0.2）為介質(zhì)，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.7%條件下超聲輔助從南極磷蝦殼中提取天然蝦青素，結(jié)果如圖7所示。當(dāng)超聲輔助提取30 min 后，蝦青素提取量基本接近飽和，達(dá)到（45.09±2.67）μg/g。然而，超聲輔助提取2 min 即可達(dá)到最大提取量的97.98%，這一結(jié)果表明[P4444]CF3COO 微乳液體系在超聲輔助條件下短時(shí)間內(nèi)可達(dá)到良好的提取效果，不僅降低了經(jīng)濟(jì)成本，而且利于維持蝦青素的穩(wěn)定性。此外，適宜的超聲功率可促進(jìn)溶質(zhì)的溶解分散，但是當(dāng)超聲功率過(guò)高，超聲波所產(chǎn)生的機(jī)械作用過(guò)于強(qiáng)烈時(shí)會(huì)使提取物的微觀結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致蝦青素提取量降低。綜上所述，當(dāng)超聲輔助提取的功率和時(shí)間分別為100 W 和2 min，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.7%，[P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水（質(zhì)量比=0.2∶0.12∶0.48∶0.2）的蝦青素提取量達(dá)到（48.21±0.07）μg/g，此時(shí)提取率為97.75%。

圖7 超聲輔助對(duì)[P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水微乳液提取蝦青素的影響Fig.7 Effect of ultrasonic assistance on astaxanthin extraction by[P4444]CF3COO/lecithin/n-butanol/water microemulsions

2.3 蝦青素的穩(wěn)定性

Qiao 等[44]在評(píng)價(jià)游離蝦青素和蝦青素酯穩(wěn)定性的研究中明確指出，當(dāng)處理溫度由40 ℃升至80℃，蝦青素降解增大，具有熱敏性的特點(diǎn)。吸光值是用來(lái)衡量光被吸收程度的物理量，通過(guò)在474 nm 處測(cè)定蝦青素的吸光值，可評(píng)價(jià)蝦青素穩(wěn)定性情況。為了證明蝦青素在離子液體微乳液體系中的穩(wěn)定性，測(cè)定了25，35，45，55 ℃下蝦青素在[P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水微乳液中的吸光值。結(jié)果如圖8所示，經(jīng)過(guò)12 h 水浴恒溫處理，所測(cè)吸光值分別為0.653，0.649，0.636 和0.624，降解率由2.54%增至5.88%。這一結(jié)果表明隨溫度升高，蝦青素降解增大，這是因?yàn)闇囟壬呒铀倭薣P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水微乳液中各物質(zhì)的分子運(yùn)動(dòng)，從而導(dǎo)致蝦青素部分降解，吸光值下降，穩(wěn)定性受到破壞。

提取時(shí)間是影響蝦青素穩(wěn)定性的另一個(gè)主要原因。隨著加熱時(shí)間延長(zhǎng)，游離蝦青素兩端的羥基易被脂肪酸取代，從而增加了蝦青素酯的穩(wěn)定性，因此，蝦青素在短時(shí)間內(nèi)降解不大[45]。但是，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)至12 h，45 ℃下所測(cè)蝦青素吸光值分別為0.654（2 h），0.650（4 h），0.650（8 h），0.644（10 h），0.636（12 h），降解率由0%增至2.54%。這是因?yàn)槲r青素所富含的電子共軛雙鍵結(jié)構(gòu)長(zhǎng)期處于高溫下對(duì)物理和化學(xué)降解高度敏感，導(dǎo)致降解增加[46]。類(lèi)似的，Parjikolaeib 等[41]利用向日葵油在70 ℃下處理北極甜蝦2.5 h 提取蝦青素的研究與談俊曉等[47]利用堿性蛋白酶與木瓜蛋白酶和乙醇混合溶劑體系在51 ℃下處理南極磷蝦2.1 h 提取蝦青素的研究均存在高溫且耗時(shí)長(zhǎng)的不足，蝦青素易發(fā)生降解。與此相反，由圖8 可知，在[P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水微乳液中，蝦青素經(jīng)25℃水浴恒溫12 h 與在35，45，55 ℃下水浴恒溫2 h 的吸光值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異不顯著，表明在該條件范圍內(nèi)利于蝦青素穩(wěn)定性的保持。

圖8 蝦青素在[P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水微乳液中的穩(wěn)定性Fig.8 Stability of astaxanthin in[P4444]CF3COO/lecithin/n-butanol/water microemulsions

2.4 雙連續(xù)型離子液體微乳液提取蝦青素的機(jī)理

離子液體結(jié)構(gòu)內(nèi)部的氫鍵、π-π 鍵、范德華力以及離子間作用力使其對(duì)生物分子具有良好的溶解特性。為了考察[P4444]CF3COO 和[P4448]Br 微乳液對(duì)南極磷蝦殼的溶解作用，采用掃描電鏡觀察了提取前后南極磷蝦殼的表觀形貌。如圖9所示，未處理的南極磷蝦殼表面光滑且呈現(xiàn)致密的多層結(jié)構(gòu)，但經(jīng)過(guò)[P4444]CF3COO 微乳液處理后的蝦殼出現(xiàn)不同程度的彎曲，且多層結(jié)構(gòu)遭到破壞。這可能是因?yàn)槲⑷橐后w系中的離子液體陽(yáng)離子和卵磷脂疏水端通過(guò)靜電作用形成的晶體空間點(diǎn)陣吸引了具有共軛雙鍵和β-紫羅蘭酮環(huán)的蝦青素分子。此外，研究表明番茄紅素分子與卵磷脂疏水尾的相互作用能力是番茄紅素在微乳液中具有良好溶解性的重要原因[30]。類(lèi)似的，Liu 等[48]以膽固醇為油相、卵磷脂和膽鹽為表面活性劑和助表面活性劑并結(jié)合聚氧乙烯蓖麻油水相制備微乳從穿心蓮中提取穿心蓮內(nèi)酯、二萜內(nèi)酯等酯類(lèi)化合物，證明親脂性脂肪酸結(jié)構(gòu)的卵磷脂對(duì)于疏水性分子的提取起到重要的作用。另一方面，微乳液體系中的離子液體陰離子與正丁醇和蝦青素分子共軛雙鍵的氫鍵作用也是促進(jìn)南極磷蝦殼內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)形成的重要原因。

圖9 [P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水微乳液處理蝦殼前后對(duì)比Fig.9 Comparison of[P4444]CF3COO/lecithin/n-butanol/water treatment of Antarctic krill shells

綜上所述，雙連續(xù)型離子液體微乳液提取蝦青素的機(jī)理為（圖10）：1）[P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水或[P4448]Br/卵磷脂/正丁醇/水微乳液通過(guò)破壞瓦解南極磷蝦殼內(nèi)部結(jié)構(gòu)，增大蝦殼與微乳液的接觸面積，利于蝦殼表面及內(nèi)部的蝦青素向溶劑中遷移。2）蝦青素的共軛雙鍵和β-紫羅蘭酮環(huán)與微乳液中卵磷脂和離子液體的陽(yáng)離子疏水端存在較強(qiáng)的靜電作用，蝦青素的氫鍵與正丁醇、離子液體陰離子之間存在較強(qiáng)的氫鍵相互作用。

圖10 [P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水體系提取蝦青素的機(jī)理Fig.10 Mechanism of[P4444]CF3COO/lecithin/n-butanol/water extracting astaxanthin

3 結(jié)論

本文采用卵磷脂作為乳化劑與離子液體構(gòu)建雙連續(xù)型微乳液體系，并從南極磷蝦殼中提取天然蝦青素。在20～70 ℃范圍內(nèi)，[P4448]Br 和[P4444]CF3COO 能夠與卵磷脂、正丁醇和水形成微乳液體系。該微乳液體系不僅能夠破壞蝦殼的致密組織，形成多孔疏松的結(jié)構(gòu)，而且卵磷脂和離子液體與蝦青素之間的疏水性作用和氫鍵作用提高了蝦青素的溶解度。在超聲輔助條件下（100 W 和2 min），當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.7%時(shí)，[P4444]CF3COO/卵磷脂/正丁醇/水（質(zhì)量比=0.2∶0.12∶0.48∶0.2）微乳液的蝦青素提取量達(dá)（48.21±0.07）μg/g。研究結(jié)果為天然蝦青素的提取提供了一種溫度低、時(shí)間短、提取率高、蝦青素穩(wěn)定性強(qiáng)的新方法。當(dāng)然離子液體微乳液體系組分復(fù)雜，破乳困難，生物分子的分離純化是需要進(jìn)一步突破的科學(xué)問(wèn)題。