發(fā)酵劑和蛋清對調(diào)理肉餅中亞硝胺含量的影響

孫學(xué)穎，王 甜，劉建林，王 丹，張曉蓉，靳 燁，趙麗華

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 呼和浩特010018）

調(diào)理肉制品是以畜禽肉為主要原料，添加一定量的輔料，經(jīng)適當(dāng)加工，在低溫冷藏以及冷凍條件下貯藏，再經(jīng)簡單加工后便可食用的肉制品[1]。犢牛肉營養(yǎng)價值高，富含豐富的維生素，特別是維生素B12，還可以提供高質(zhì)、優(yōu)量且比例合適的蛋白質(zhì)。犢牛肉蛋白質(zhì)和碳水化合物含量與成年牛肉相似，比成年牛肉具有更高的人體必需氨基酸含量[2]。據(jù)統(tǒng)計，一些奶業(yè)發(fā)達(dá)的國家市場上有60%的牛肉來自于被淘汰的牛[3]。在我國，一些不被用于育種的小公犢大多會以較低廉的價格售出，一些生物科技公司采集血清后將犢牛肉以下腳料的價格售出，因而存在屠宰率低、肉質(zhì)差、經(jīng)濟(jì)效益差或其它問題，而關(guān)于這方面的研究、開發(fā)和利用較少，是企業(yè)亟待解決的問題[4]。蛋清是由蛋白質(zhì)組成的透明膠質(zhì)物質(zhì)，含水量約89%，且含有少量脂肪與微量元素。其主要成分包括卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵類黏蛋白等，蛋清蛋白除具有環(huán)保性、營養(yǎng)性外，還具有凝膠性。凝膠的形成不僅可以改進(jìn)食品形態(tài)和質(zhì)地，而且在提高食品的持水力、增稠等方面有諸多應(yīng)用，可以添加到肉制品、魚糜制品、冷凍制品等系列產(chǎn)品中?？妆ＨA等[5]研究表明，蛋清蛋白的添加能夠改善乳化腸質(zhì)構(gòu)，增加產(chǎn)品的硬度、彈性，使乳化腸的結(jié)構(gòu)致密，口感更好。為了賦予肉制品更好的色澤、風(fēng)味，通常加入硝酸鹽或亞硝酸鹽進(jìn)行腌制。硝酸鹽可被還原生成亞硝酸鹽，而亞硝酸鹽可與二級胺經(jīng)亞硝基化作用在體內(nèi)、外結(jié)合生成亞硝胺[6]。調(diào)理肉制品一般在解凍結(jié)束后經(jīng)煎制成熟后食用，而高溫加熱會導(dǎo)致亞硝胺含量增加[7]。如何控制肉制品中N-亞硝胺的生成量，對于食品安全和品質(zhì)控制具有十分重要的意義。

目前國內(nèi)外學(xué)者對亞硝胺形成的抑制主要通過外源添加物進(jìn)行控制。研究表明，當(dāng)環(huán)境中存有NO3-時，細(xì)菌在亞硝胺的形成過程中可將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，蛋白質(zhì)降解為仲胺同時產(chǎn)生活性酶能促進(jìn)亞硝基化反應(yīng)，并為亞硝基化作用形成適宜的pH 值，提高亞硝胺合成水平[8]。試驗證明腸菌屬和梭菌屬均具有合成亞硝胺的能力，一些細(xì)菌的存在還能促進(jìn)亞硝胺的形成[9]。而一些乳酸菌，如彎曲乳桿菌能夠抑制發(fā)酵風(fēng)干腸中N-亞硝胺的形成[10]。其降解機(jī)理可能是由于乳酸菌的吸附、降解作用[11]，或是在肉制品加工過程中產(chǎn)生了一些能夠降解N-亞硝胺等有害物質(zhì)的酶[12]。

本試驗在腌制階段分別添加植物乳桿菌37X-6 和蛋清，經(jīng)發(fā)酵、速凍、熟制得對照組、發(fā)酵劑組和蛋清組3 組調(diào)理肉餅產(chǎn)品。通過對產(chǎn)品的理化指標(biāo)、亞硝酸鹽和N-亞硝胺含量的測定，與對照組相比，分析植物乳桿菌37X-6 和蛋清對調(diào)理肉餅安全品質(zhì)的影響。

1 材料及方法

1.1 材料與試劑

采集血清后的犢牛肉；蛋清、白砂糖、變性淀粉、紅曲紅、乙基麥芽酚、葡萄糖、蔗糖、食鹽、味精、醬油；植物乳桿菌（37X-6），內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品微生物實(shí)驗室提供，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），保藏登記編號為CGMCC.No.16189。

7 種N-亞硝胺標(biāo)品：N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亞硝胺（Nnitrosodiethylamine，NDEA）、N-二丙基亞硝胺（Nnitrosodipropylamine，NDPA）、N-二丁基亞硝胺（N-nitrosodibutylamide，NDBA）、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-亞硝基哌啶（Nnitrosopiperidine，NPIP）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR），美國Sigma 公司；甲醇、維生素C、亞硝酸鈉、復(fù)合磷酸鹽（三聚磷酸鹽∶焦磷酸鹽=1∶1），呼和浩特市達(dá)音商貿(mào)有限公司。配制以上試劑的水為超純水，甲醇為色譜純，其余為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260vwd 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；DSH-300A 回旋式水域恒溫振蕩器，上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司；UV-1800 型紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；ZXMPA1430 恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BS210S 電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-6 數(shù)顯式恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；pH 400 pH 計，安萊立思儀器科技（上海）有限公司；Lab Master-a 水分活度儀，瑞士NOVASINA 公司；TCP 2 全自動測色色差計，北京奧依克儀器有限公司；HJ-6 多頭磁力加熱攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 調(diào)理肉餅制作 各試驗組調(diào)理肉餅的工藝流程[13]：原料肉→去除筋膜制成肉糜→攪拌均勻（加入輔料）→腌制→發(fā)酵→壓模成型→上糠→速凍→熟制。

腌制：各組分別稱取用攪碎機(jī)攪碎后的犢牛肉，對照組按犢牛肉質(zhì)量分?jǐn)?shù)加入食鹽2%、味精0.5%、醬油0.3%、維生素C 0.03%、亞硝酸鈉0.01%；在對照組的基礎(chǔ)上，發(fā)酵劑組按2%接種發(fā)酵劑，蛋清組按12%添加蛋清。攪拌均勻后在溫度為4 ℃條件下腌制24 h。

發(fā)酵：將腌制后的肉糜轉(zhuǎn)移到恒溫恒濕箱于溫度25 ℃、相對濕度90%的條件下發(fā)酵24 h。

壓模成型：將發(fā)酵后的牛肉置于模具中壓模成型，并保持0～4 ℃的低溫條件下壓制3～4 h。

上糠：將壓合成型的肉餅表面添加約18%～25%的面包糠，使其硬化。

速凍：將壓合成型的肉餅進(jìn)行速凍，速凍時間為12～14 h，溫度為-18 ℃。

熟制：將調(diào)理肉餅進(jìn)行煎制。

1.3.2 試驗設(shè)計 本試驗制作3 組調(diào)理肉餅：對照組（自然發(fā)酵：不添加發(fā)酵劑和蛋清）、發(fā)酵劑組（接種發(fā)酵劑）和蛋清組（加入蛋清）。分別于腌制后、發(fā)酵后、解凍后、煎制后取樣用于亞硝胺、亞硝酸鹽及理化指標(biāo)的測定。

1.3.3 pH 值、水分活度、色差的測定 pH 值參照GB 5009.237-2016 進(jìn)行測定[14]；水分活度參照GB 5009.238-2016 進(jìn)行測定[15]；色差使用全自動色差計進(jìn)行測定。

1.3.4 亞硝酸鹽值的測定 按照GB 5009.33-2010 測定發(fā)酵羊肉香腸中亞硝酸鹽的含量[16]。

1.3.5 亞硝胺含量的測定 參照溫演慶等[17]的方法略作改進(jìn)。采用高效液相色譜儀聯(lián)合C18 柱（柱長250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，柱填料粒徑5 μm）和紫外檢測器檢測。樣品進(jìn)樣量10 μL，流動相流速0.8 mL/min，柱溫40 ℃，紫外檢測波長230 nm。梯度洗脫程序：流動相A、B 起始質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為90%，10%保持5 min，第5 分鐘時流動相A、B 分別為80%，20%保持15 min，第20 分鐘流動相A降至30%保持10 min，第30 分鐘流動相A 降至20%保持10 min，在40 min 流動相A、B 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%，10%保持至第45 分鐘。流動相A 為緩沖液溶液，流動相B 為甲醇。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用分析軟件SPSS 18.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和顯著性差異分析，每個試驗重復(fù)3 次。統(tǒng)計學(xué)顯著性分析P<0.05 表示差異性顯著。采用Origin 2018 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵劑和蛋清對調(diào)理肉餅pH 值的影響

由圖1 可以看出，腌制結(jié)束后（0 d），各組的pH 值在5.8～6.0（P<0.05）。發(fā)酵結(jié)束后各組的pH值降為最低（P<0.05）。其中發(fā)酵劑組下降至5.09，蛋清組最低5.07。這可能是在發(fā)酵的過程中，由于溫度升高，發(fā)酵劑迅速生長成香腸中的優(yōu)勢菌，增加了發(fā)酵速度，優(yōu)勢菌乳酸菌代謝的產(chǎn)物乳酸促進(jìn)了發(fā)酵香腸的pH 值下降。解凍結(jié)束，發(fā)酵劑組的pH 值由5.09 升到5.21，蛋清組pH 值由5.07升到5.32。可能是發(fā)酵劑和蛋清中的有效成分促進(jìn)微生物及肉組織中的酶發(fā)揮作用，使發(fā)酵香腸中產(chǎn)生了一些堿性的含氮物質(zhì)[18]。煎制結(jié)束，各組pH 值均有適當(dāng)?shù)幕厣赡苁翘妓衔锉幌?，含氮化合物被乳酸菌利用，蛋白酶作用蛋白質(zhì)降解使堿性物質(zhì)濃度增加引起[19]。此研究結(jié)果與賈娜等[20]研究結(jié)果一致。pH 值回升會為調(diào)理肉餅增添適合食用的口感，而不至于出現(xiàn)酸澀味[21]。

圖1 發(fā)酵劑和蛋清不同處理組調(diào)理肉餅在加工過程中pH 值的變化Fig.1 Change of pH value in the processing of beef patties processed with different treatments of starter and albumen

2.2 發(fā)酵劑和蛋清對調(diào)理肉餅水分活度的影響

由圖2 可知，隨著加工階段的變化，各組的aw 值逐漸降低。aw 值是肉制品貨架期和食用安全的一個重要因素，低aw 值可以有效地抑制發(fā)酵香腸中的腐敗菌和致病菌的生長。腌制結(jié)束后各組調(diào)理肉餅的aw 值在0.92 左右，各組aw 值無明顯差異（P>0.05）。發(fā)酵結(jié)束至解凍結(jié)束，各組的aw值呈下降趨勢。煎制結(jié)束，各組的aw 值明顯下降至0.8 左右（P<0.05），可以有效抑制腐敗微生物的生長。對照組和蛋清組aw 值低于發(fā)酵劑組aw 值（P<0.05），同pH 值結(jié)果一致。aw 值的下降與pH值有關(guān)，pH 值的降低會使蛋白質(zhì)發(fā)生凝膠化，香腸表面的水分會分散到空氣中，導(dǎo)致aw 值降低[22]。

圖2 發(fā)酵劑和蛋清不同處理組調(diào)理肉餅在加工過程中aw 值的變化Fig.2 Change of aw value in the processing of beef patties processed with different treatments of starter and albumen

2.3 發(fā)酵劑和蛋清對調(diào)理肉餅色澤的影響

色澤是肉制品品質(zhì)評定的重要指標(biāo)之一。段艷[23]研究表明，e值對評判肉制品色澤變化趨勢具有重要意義，因此通過測定樣品的亮度值L*、紅度值a*、黃度值b*得出e值反映調(diào)理肉餅加工過程中色差的變化情況。3 組調(diào)理肉餅各階段的色差變化情況如圖3所示。

由圖3a、3b、3c 可以看出，腌制結(jié)束后，試驗組亮度值L*均高于對照組47.88，蛋清組紅度值a*和黃度值b*均高于對照組和發(fā)酵劑組。發(fā)酵結(jié)束后，蛋清組亮度值L*低于對照組和發(fā)酵劑組，而紅度值a*高于其它兩組，黃度值b*無顯著差異（P>0.05）。解凍結(jié)束后，蛋清組亮度值L*、黃度值b*均高于其它兩組，紅度值低于其它兩組。由圖3d 可以看出，在腌制結(jié)束后，3 組e值差異不顯著（P>0.05），煎制結(jié)束后，試驗組e值顯著高于對照組1.46（P<0.05），說明在調(diào)理肉餅中添加蛋清和接種發(fā)酵劑可以有效提高調(diào)理肉餅的色澤，使其顏色更鮮艷，更容易吸引消費(fèi)者。

圖3 發(fā)酵劑和蛋清不同處理組調(diào)理肉餅在加工過程中色差的變化Fig.3 Change of value of colour difference in the processing of beef patties processed with different treatments of starter and albumen

2.4 調(diào)理肉餅亞硝酸鹽含量的變化

肉制品中添加亞硝酸鹽主要具有發(fā)色、抗氧化、抑制肉毒梭狀芽孢桿菌的生長、延緩腐敗等作用[24]。在肉制品中亞硝酸鹽是強(qiáng)致癌物N-亞硝胺的前體物質(zhì)，在胃液酸性條件下亞硝酸鹽與胺類物質(zhì)反應(yīng)形成強(qiáng)致癌性的亞硝基化合物[25]。若缺少高鐵血紅蛋白還原酶，食用過量的亞硝酸鹽會導(dǎo)致組織缺氧，嚴(yán)重可造成死亡[26]。

由表1 可知，在調(diào)理肉餅加工過程中，隨著時間的延長，亞硝酸鹽含量逐漸降低，這與賈仁勇等[27]研究結(jié)果一致。在發(fā)酵結(jié)束后，3 組亞硝酸鹽含量均有所降低，發(fā)酵劑組和蛋清組亞硝酸鹽含量顯著低于對照組2.041 mg/kg（P<0.05）。解凍結(jié)束，亞硝酸鹽含量無明顯變化。煎制結(jié)束后，試驗組亞硝酸鹽含量均低于對照組（P<0.05），其中發(fā)酵劑組最低為0.75 mg/kg。說明在肉制品中添加發(fā)酵劑和蛋清對亞硝酸鹽含量有抑制作用，提高產(chǎn)品安全性。該結(jié)果與徐君強(qiáng)[28]研究的結(jié)果一致。整個試驗過程中，各組的亞硝酸鹽殘留量低于國家規(guī)定30 mg/kg，亞硝酸鹽沒有超標(biāo)，保障了香腸的安全問題。

表1 發(fā)酵劑和蛋清不同處理組調(diào)理肉餅在加工過程中亞硝酸鹽含量的變化（mg/kg）Table 1 Change of nitrite content in the processing of beef patties processed with different treatments of starter and albumen（mg/kg）

2.5 調(diào)理肉餅中亞硝胺含量的變化

如圖4所示3 組調(diào)理肉餅中7 種N-亞硝胺總量隨加工時間的變化。目前NDMA 為肉制品中最主要的N-亞硝胺[29]，NDMA 的含量總體呈逐漸升高的趨勢，成品中添加發(fā)酵劑和蛋清均可抑制NDMA 含量。腌制結(jié)束和發(fā)酵結(jié)束后，蛋清組NDMA 含量均顯著低于對照組和發(fā)酵劑組（P<0.05）。解凍結(jié)束，對照組NDMA 含量上升，而試驗組NDMA 含量均顯著低于對照組24.16 μg/kg（P<0.05）。煎制結(jié)束，試驗組NDMA 含量均顯著低于對照組27.44 μg/kg（P<0.05），其中蛋清組含量最低為7.59 μg/kg。說明添加發(fā)酵劑和蛋清可以不同程度地減少NDMA 的含量，這可能是由于發(fā)酵劑菌株和蛋清可以產(chǎn)生可降解NDMA 的酶系[30]，或者菌體和蛋清本身對NDMA 具有吸附作用[31]。

對于NDEA（圖4d），腌制結(jié)束，各組NDEA的含量差異不顯著（P>0.05）。發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵劑組NDEA 的含量最低為2.34 μg/kg，差異不顯著（P>0.05）。可能是在發(fā)酵階段，pH 值降到最低，乳酸菌對亞硝胺起到降解作用。解凍結(jié)束，各組NDEA的含量均有降低且蛋清組含量最低。煎制結(jié)束，各組NDEA 的含量升高且差異不顯著（P>0.05），且蛋清組含量最低為2.29 μg/kg。由圖4e 可知，腌制結(jié)束和發(fā)酵結(jié)束后，試驗組NPIP 含量顯著低于對照組0.17 μg/kg（P<0.05），解凍結(jié)束后，3 組調(diào)理肉餅中NPIP 含量差異不顯著（P>0.05），煎制結(jié)束后，試驗組NPIP 含量均顯著低于對照組0.15 μg/kg，但差異不顯著（P>0.05），說明發(fā)酵劑和蛋清均可以減少NPIP 的含量。

圖4 發(fā)酵劑和蛋清不同處理組調(diào)理肉餅在加工過程中7 種亞硝胺含量的變化Fig.4 Changes in the contents of seven nitrosamine in beef patties processed with different treatments of starter and albumen

由圖4b 可知，各組NMOR 的含量呈逐漸上升趨勢，煎制結(jié)束后發(fā)酵劑組NMOR 含量顯著低于對照組30.97 μg/kg（P<0.05），可見發(fā)酵劑可降低調(diào)理肉餅中NMOR 含量。而對于NPYR（圖4c）、NDPA（圖4f）和NDBA（圖4g），各組在不同加工階段的含量并未呈現(xiàn)較強(qiáng)規(guī)律性。

3 結(jié)論

接種植物乳桿菌37X-6 可以顯著降低煎制調(diào)理肉餅中N-亞硝基二甲胺（23.30 μg/kg）、N-亞硝基嗎啉（25.75 μg/kg）和N-亞硝基哌啶（0.12 μg/kg）的積累，添加蛋清可以顯著降低調(diào)理肉餅中N-亞硝基二甲胺（7.59 μg/kg）和N-亞硝基哌啶（0.13 μg/kg）的積累，添加植物乳桿菌37X-6 和蛋清還能促進(jìn)調(diào)理肉餅pH 值和水分活度的降低，可以一定程度上抑制致病菌和腐敗菌的生長，縮短發(fā)酵周期、延長產(chǎn)品的貨架保質(zhì)期，進(jìn)而提高發(fā)酵羊肉干的產(chǎn)品安全性。植物乳桿菌37X-6 和蛋清還可以減少亞硝酸鹽殘留量，并改善產(chǎn)品的色澤。將發(fā)酵劑菌株和蛋清應(yīng)用到調(diào)理肉餅的生產(chǎn)中，既可以提高產(chǎn)品安全性又可以改善發(fā)酵調(diào)理肉餅的色澤，提升消費(fèi)者的購買欲。