洛 雪，劉 瑛，時 旭，史海粟，烏日娜，武俊瑞，楊巍巍，岳喜慶*

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院 沈陽112000 2 沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院 沈陽110034）

天然的CLA 主要存在于動物、植物、海產(chǎn)品中，如在牛、羊等反芻類動物的乳脂和肉制品中含量較高[1-2]。c9，t11-CLA 還被命名為瘤胃酸（rumenic acid）。自上世紀(jì)50年代開始，人們接連在反芻動物的脂肪組織、烤牛肉中[3-6]發(fā)現(xiàn)了CLA，并證實其抗癌功能[7]。發(fā)酵乳是經(jīng)乳酸菌發(fā)酵動物乳而制成的，因獨(dú)特的滋味和特殊的營養(yǎng)價值而受到人們的喜愛。對發(fā)酵乳產(chǎn)品的檢測，包括感官評價、理化指標(biāo)、污染物限量、真菌毒素限量、微生物限量、乳酸菌數(shù)等。對發(fā)酵乳發(fā)酵性能的檢測包括質(zhì)構(gòu)、流變、滋味、氣味、持水性等指標(biāo)。

目前，在原始發(fā)酵乳基礎(chǔ)上加入其它營養(yǎng)物質(zhì)，以提高發(fā)酵乳的營養(yǎng)特性、風(fēng)味特性和發(fā)酵特性的產(chǎn)品越來越多。加入益生菌的發(fā)酵乳營養(yǎng)更加豐富，攝入的益生菌在人體內(nèi)積累定植后，對改善宿主體內(nèi)的微生態(tài)平衡具有重要作用，益生菌乳制品同時還具有緩解乳糖不耐癥，抗高血壓，降低生殖道感染風(fēng)險，促進(jìn)Ca2+吸收和維生素生成等功能[8-9]。許多可生產(chǎn)CLA 的菌株均為乳酸菌[10]，可用于發(fā)酵。當(dāng)使用能生產(chǎn)CLA 的菌株生產(chǎn)功能性乳制品時，便可將CLA 較好地融入產(chǎn)品中，從而利于乳制品的多種有益功能[11-14]。有研究發(fā)現(xiàn)，將產(chǎn)CLA 的乳酸乳球菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌復(fù)配后發(fā)酵牛奶，所得產(chǎn)物中CLA 最大值為56.51 mg/mL[15]。目前大多CLA 在食品中應(yīng)用較少，如何能獲得高產(chǎn)CLA 的乳酸菌并應(yīng)用于發(fā)酵乳中，具有較大的意義[16]。本研究從發(fā)酵乳中篩選菌株，得到產(chǎn)共軛亞油酸的菌株，將其直接用于制作發(fā)酵乳，研究該菌株的發(fā)酵性能，測定CLA 的產(chǎn)量，評估發(fā)酵乳的綜合指標(biāo)，以獲得CLA 含量高，品質(zhì)好的發(fā)酵乳。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

發(fā)酵乳樣品和純牛奶采自內(nèi)蒙古呼和浩特和呼倫貝爾，采集后置于無菌容器，放于冰盒中帶回。

革蘭氏染色液試劑盒，索萊寶科技有限公司（北京）；細(xì)菌DNA 提取試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司（ 北京）；DL2000 DNA Marker、DL15000 DNA Marker，大連寶生物；2×Es Taq Master Mix（Dye）、6×SuperStain Loading Buffer，北京康為世紀(jì)；溶菌酶，北京索萊寶；瓊脂糖，北京中科瑞泰生物；亞油酸（LA），90%純度，上海聯(lián)邁生物；共軛亞油酸標(biāo)準(zhǔn)品（CLA），Sigma 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR 儀（Eppendorf）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf），德國Eppendorf 公司；超微量核酸蛋白定量儀（Thermo Fisher），Thermo Fisher 公司；質(zhì)構(gòu)儀（BROOKFIELD），美國BROOKFIELD；電子舌（Insent），日本Insent。

1.3 試驗方法

1.3.1 傳統(tǒng)發(fā)酵乳中乳酸菌的分離純化 發(fā)酵乳梯度稀釋后涂布MRS 平板，37 ℃培養(yǎng)2 d。挑取菌落狀態(tài)不同的透明和半透明單菌落，每個單菌落經(jīng)過3～4 次劃線純化后，37 ℃，靜置培養(yǎng)24～48 h，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 革蘭氏染色鑒定 挑取待檢菌落于載玻片，滴入生理鹽水稀釋，固定后進(jìn)行染色，具體操作見革蘭氏染色液試劑盒說明書，染色后于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.3.3 CLA 含量測定 選取CLA 質(zhì)量濃度為0.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0 μg/mL 的樣品，測定吸光度值（λ=233 nm），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

選取革蘭氏染色陽性菌株接種MRS 培養(yǎng)基（0.5 mg/mL LA），37 ℃培養(yǎng)24～48 h，加入正己烷充分振蕩，4 ℃，10 000 g 離心10 min，取上清液測定吸光度值（λ=233 nm），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算生成CLA 的含量。

1.3.4 16 s rDNA 鑒定菌種 利用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取已篩選的乳酸菌基因組，稀釋基因組DNA 至終質(zhì)量濃度為20 ng/μL，以此為模板，用16 s 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 驗證結(jié)果呈陽性的菌株送交上海派森諾生物科技股份有限公司測序。

1.3.5 單因素試驗 以發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性、滋味特性和CLA 產(chǎn)量作為考察指標(biāo)，研究植物乳桿菌HAC01 接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵pH 值、LA 添加量，發(fā)酵結(jié)束后后熟時間對發(fā)酵性質(zhì)的影響。利用質(zhì)構(gòu)儀測定硬度、稠度、黏度、黏聚性等指標(biāo)，測定條件及參數(shù)為：探針選擇直徑為2.5 cm 的平底圓柱形探針，測定模式選擇阻力測試，感應(yīng)力選擇自動感應(yīng)10 g，測定前下降速度1.0 mm/s，測定速率2.0 mm/s，測定后速度8 mm/s，進(jìn)入樣品深度20 mm，對測試樣品進(jìn)行兩次壓縮，間隔時間5 s。利用電子舌測定樣品的綜合味覺信息，指標(biāo)包括酸、甜、苦、咸、鮮。

1.3.6 均勻設(shè)計 使用DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)V7.05進(jìn)行均勻設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，優(yōu)化反應(yīng)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 乳酸菌分離純化

為得到具有較高CLA 產(chǎn)量的菌株，本試驗從采集的發(fā)酵乳樣品分離純化菌種，利用菌落形態(tài)和革蘭氏染色進(jìn)行初步鑒定，結(jié)果如表1所示，乳酸菌菌落形態(tài)基本呈半透明、圓形隆起狀，革蘭氏染色為陽性。

表1 菌株分離初鑒定表Table 1 Preliminary identification of strains

2.2 菌株CLA 含量

測定篩選出的25 株革蘭氏陽性菌的CLA 產(chǎn)量，結(jié)果見圖1所示，其中產(chǎn)量最高的為7 號菌株，CLA 產(chǎn)量為（2.7197±0.0056）μg/mL，選取產(chǎn)量相對高的10 株菌進(jìn)行后續(xù)試驗；CLA 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到回歸方程：Y=0.0741X+0.0032，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9991。

圖1 菌株CLA 產(chǎn)量Fig.1 Production of CLA in selected strains

圖2 CLA 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 CLA standard curve

2.3 菌株鑒定

選取CLA 含量最高的10 株菌提取基因組DNA 進(jìn)行16S rDNA 鑒定，結(jié)果如圖3所示。篩選菌株均在1 700 bp 左右有特異性條帶，送交公司測序。測序結(jié)果在NCBI 中比對后如表2所示，其中瑞士乳桿菌3 株，副干酪乳桿菌2 株，戊糖片球菌、克菲爾乳桿菌、植物乳桿菌、屎腸球菌各1 株，選擇CLA 產(chǎn)量最高的植物乳桿菌，命名為HB-01測定其發(fā)酵性質(zhì)。

表2 菌株鑒定表Table 2 Table of strain identification

圖3 16S 鑒定Fig.3 16S identification

2.4 發(fā)酵條件對發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)的影響

將植物乳桿菌接種純牛奶發(fā)酵進(jìn)行單因素試驗，所得發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)變化如圖4～圖8所示。

圖4 不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性Fig.4 Texture characteristics of fermented milk at different temperatures

圖8 不同LA 添加量下發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性Fig.8 Texture characteristics of fermented milk at different LA concentrations

不同發(fā)酵溫度所得發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)結(jié)果表明，硬度、黏度、膠著性和咀嚼性隨溫度的增加呈先上升后下降的趨勢，在37 ℃時發(fā)酵乳的硬度最大（0.2300±0.0100）N。不同發(fā)酵時間所得發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)結(jié)果表明，硬度、黏度、膠著性和咀嚼性的值在36 h 為最大值，硬度最大為（0.2467±0.0058）N，發(fā)酵性能更好。不同接種量所得發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)結(jié)果表明，硬度、黏度、膠著性和咀嚼性的值在4%為最大值，硬度最大為（0.2567±0.0115）N。不同pH 值所得發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)結(jié)果表明，硬度、黏度、膠著性和咀嚼性的值隨pH 值的變化不大，在pH 值為6.5 時硬度最大為（0.2200±0.0100）N。不同LA添加量所得發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)結(jié)果表明，硬度、黏度、膠著性和咀嚼性的值隨LA 添加量的變化不大，在0.5 mg/mL 時硬度最大為（0.2333±0.0115）N。

2.5 發(fā)酵條件對發(fā)酵乳滋味的影響

植物乳桿菌接種純牛奶進(jìn)行發(fā)酵試驗，發(fā)酵乳經(jīng)電子舌檢測結(jié)果如圖9～圖13所示。結(jié)果顯示，溫度、接種量和pH 值對成品的酸度影響較大，隨著溫度的升高酸度逐漸加強(qiáng)，甜味、苦味、咸味和鮮味無明顯變化，發(fā)酵時間和LA 添加量與5種滋味的關(guān)聯(lián)性也不大，所以選擇適宜的發(fā)酵溫度、接種量和pH 值有利于得到滋味更好的發(fā)酵乳。

圖5 不同發(fā)酵時間下發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性Fig.5 Texture characteristics of fermented milk at different time

圖9 不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵乳的滋味Fig.9 Taste of fermented milk fermented at different temperatures

圖13 不同LA 添加量下發(fā)酵乳的滋味Fig.13 Taste of fermented milk fermented at different LA concentrations

圖6 不同植物乳桿菌接種量下發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性Fig.6 Texture characteristics of fermented milk at different inoculations

圖7 不同pH 值下發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性Fig.7 Texture characteristics of fermented milk at different pH

2.6 發(fā)酵條件對CLA 產(chǎn)量的影響

根據(jù)單因素試驗，得到CLA 產(chǎn)量的結(jié)果如圖14所示。

圖14 不同發(fā)酵條件下發(fā)酵乳的CLA 含量Fig.14 CLA content of fermented milk under different conditions

從結(jié)果看，發(fā)酵乳的CLA 產(chǎn)量隨植物乳桿菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵pH 值、LA 添加量的增加而逐漸增大，最后又有小幅度降低，其中LA 添加量的影響最大。根據(jù)質(zhì)構(gòu)、滋味和CLA 含量結(jié)果，得到最優(yōu)反應(yīng)條件為：接種量4%，LA 添加量0.5 mg/mL，在pH 6.5、37 ℃條件下發(fā)酵36 h，4 ℃后熟12 h，所得發(fā)酵乳的狀態(tài)和CLA 含量最佳。

經(jīng)過單因素試驗后發(fā)現(xiàn)，隨著接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、發(fā)酵pH 值、LA 添加量的不斷升高，硬度、黏度、膠著性和咀嚼性等性質(zhì)總體上呈先上升后下降的趨勢，雖然個別仍會升高，但增幅不大，相比較而言，溫度、時間、植物乳桿菌接種量對發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)影響更大。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)攪拌型酸奶的硬度值在33.9～39.9 g（1 g=0.00981 N）的范圍口感較好，硬度對膠著性和咀嚼性都有一定影響[17-18]。由該菌株發(fā)酵所得發(fā)酵乳不管如何改變發(fā)酵條件，所得發(fā)酵乳的硬度、黏度、膠著性、咀嚼性等指標(biāo)與普通的發(fā)酵乳相比都存在偏小的情況，原因可能是正常發(fā)酵乳在發(fā)酵過程中會加入乳粉、明膠等增加發(fā)酵乳的固形物含量，從而提高發(fā)酵乳的硬度、黏性等流變性能和質(zhì)構(gòu)性能[19]，本部分試驗主要目的是研究植物乳桿菌的單一發(fā)酵性質(zhì)，為后續(xù)優(yōu)化CLA 產(chǎn)量奠定一定基礎(chǔ)，所以未添加其它物質(zhì)。

2.7 均勻設(shè)計優(yōu)化試驗

圖10 不同發(fā)酵時間下發(fā)酵乳的滋味Fig.10 Taste of fermented milk fermented at different time

圖11 植物乳桿菌不同接種量下發(fā)酵乳的滋味Fig.11 Taste of fermented milk at different inoculum of Lactobacillus plantarum

圖12 不同pH 值下發(fā)酵乳的滋味Fig.12 Taste of fermented milk fermented at different pH

用DPS 設(shè)計的均勻設(shè)計表進(jìn)行試驗并得到結(jié)果，對質(zhì)構(gòu)和滋味結(jié)果進(jìn)行評價轉(zhuǎn)換，狀態(tài)越好分值越高，轉(zhuǎn)換結(jié)果滿分為10 分，所得結(jié)果Y1、Y2、Y3用模糊數(shù)學(xué)進(jìn)行數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化[20-21]處理后得Y1*、Y2*、Y3*，再以bn=0.30Y1*+0.30Y2*+0.40Y3*為目標(biāo)因變量進(jìn)行二次多項式逐步回歸，結(jié)果見表3，獲得的回歸方程為：Y*=0.6817+0.0225X1-0.0004X1X1-0.0008X3X3-0.0001X1X2+0.0442X3X5，其中Y*為綜合評價bn，所得相關(guān)系數(shù)R2=1，F(xiàn)值=4 628.4073，顯著水平P=0.0112，剩余標(biāo)準(zhǔn)差S=0.0013，由此得到指標(biāo)最高時的組合為X1=37，X2=32，X3=4，X4=6.5，X5=0.7 與實際基本一致，符合試驗要求。

表3 均勻設(shè)計發(fā)酵試驗水平表及結(jié)果Table 3 Table and results of uniform design fermentation experiment

3 結(jié)論

發(fā)酵乳樣品經(jīng)篩選鑒定一株CLA 產(chǎn)量相對較高的植物乳桿菌，利用單因素試驗和均勻設(shè)計試驗優(yōu)化植物乳桿菌發(fā)酵性能，結(jié)果顯示，在接種量4%，LA 添加量為0.7 mg/mL，pH 6.5、37 ℃條件下發(fā)酵32 h，4 ℃后熟12 h，發(fā)酵乳的性能較好，CLA 含量最高。均勻設(shè)計的優(yōu)化結(jié)果與其相似，為后續(xù)基因改造植物乳桿菌，提高CLA 產(chǎn)能和CLA生成機(jī)理研究奠定一定基礎(chǔ)。