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      膠體粒子與蛋白質(zhì)相互作用及其應(yīng)用

      2021-10-19 08:13:46牛付閣張秋萍杜藝軒潘偉春
      中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2021年9期
      關(guān)鍵詞:膠體緩沖液黏度

      牛付閣,周 娛,張秋萍,喻 嬌,杜藝軒,潘偉春

      (浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 杭州310018)

      食品的眾多性質(zhì),如感官、質(zhì)感乃至其在體內(nèi)的消化吸收,都和其結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)[1-2]。該食品的結(jié)構(gòu)的尺度從宏觀開(kāi)始,跨越介觀,直到納米尺度的微觀。和其它測(cè)試結(jié)構(gòu)的技術(shù)相比,機(jī)械流變存在以下優(yōu)點(diǎn):測(cè)量設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單,試驗(yàn)條件可控度高,能原位測(cè)試,測(cè)量結(jié)果是系統(tǒng)的平均行為,對(duì)應(yīng)的基礎(chǔ)理論成熟,因此,機(jī)械流變是研究食品以及其它高分子體系相互作用及各種結(jié)構(gòu)的重要手段[3]。然而,食品中存在一類結(jié)構(gòu),如蛋白簇[4],它非常脆弱,很容易被外力破壞,這限制了該技術(shù)在食品中的應(yīng)用。考慮到該類結(jié)構(gòu)在食品中廣泛存在,如酸奶、溶液乳化過(guò)程等,因此催生一種新的流變學(xué)技術(shù)--微流變技術(shù)(Micro rheology)[5-7]。除了繼承機(jī)械流變的優(yōu)點(diǎn)外,該技術(shù)還有用量少,速度快,可重復(fù)性高,沒(méi)有外加力對(duì)食品部分弱結(jié)構(gòu)造成影響,測(cè)量頻率范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[8-10]。

      微流變技術(shù)是通過(guò)測(cè)量小顆粒(直徑約1 μm)[11]在所測(cè)量體系中的布朗運(yùn)動(dòng),通過(guò)廣義Stokes-Einstein 關(guān)系式,來(lái)估算體系的流變學(xué)的相關(guān)參數(shù)。這些小顆粒被命名為示蹤粒子,常見(jiàn)的示蹤粒子既可以是體系本身所含的顆粒,也可以是高分子膠體粒子[12-14]。由于顆粒大小能顯著影響微流變技術(shù)所得結(jié)果,結(jié)構(gòu)清晰的高分子膠體顆粒受到了研究者的青睞。由于微流變測(cè)量中,顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)為熱量所驅(qū)動(dòng),示蹤粒子在體系中運(yùn)動(dòng)時(shí),除了受到周圍環(huán)境純流體力學(xué)的拖曳力外,應(yīng)不存在其它相互作用影響粒子運(yùn)動(dòng)。示蹤粒子的尺度應(yīng)小于體系中網(wǎng)格(如存在的話)的尺寸,同時(shí)示蹤粒子可以用硬球模型來(lái)表示,即示蹤粒子和體系中其它成分不存在相互作用。

      隨著微流變技術(shù)的普及,一些食品科學(xué)工作者開(kāi)始使用該技術(shù)。有些使用者在應(yīng)用的過(guò)程中對(duì)上述的要求不清晰,特別是容易忽略膠體粒子的表面性質(zhì)以及與蛋白質(zhì)分子之間的相互作用,使獲得的微流變信息與真實(shí)值具有一定差距。解決這一問(wèn)題的關(guān)鍵是將體系中添加的粒子與蛋白之間的相互作用進(jìn)行建模,選擇一個(gè)合適、簡(jiǎn)單且有效的模型研究體系的微流變行為。

      在研究過(guò)程中,溶液體系的黏度是影響測(cè)量結(jié)果的一個(gè)重要指標(biāo)[15-16]。然而,研究者往往會(huì)忽略黏度的校正,造成測(cè)量結(jié)果偏離真實(shí)值。黏度法是檢測(cè)蛋白分子構(gòu)象及溶液性質(zhì)的最基本的方法之一[17-18]。目前國(guó)內(nèi)利用微觀流變學(xué)研究蛋白溶液黏度的報(bào)道不多。本文將不同的蛋白質(zhì)與不同的膠體粒子之間的相互作用作為切入點(diǎn),利用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)建立一種有效的微觀測(cè)量溶液體系黏度的方法,為復(fù)雜食品體系的微流變研究提供理論依據(jù),為食品加工過(guò)程中蛋白質(zhì)的開(kāi)發(fā)和利用提供新的思路。

      1 材料與方法

      1.1 試驗(yàn)材料

      三羥甲基氨基甲烷(Tris),購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;聚苯乙烯微球(A)與聚苯乙烯-羧基微球(B),購(gòu)于蘇州智微納米科技有限公司;聚苯乙烯微球(C)、牛血清蛋白(BSA)(Lot #WXBC5159V)、溶菌酶(lys)(Lot # SLBJ4107V)、β-乳球蛋白(BLG)(Lot # SLBS6536)、卵白蛋白OVA(Lot # SLBQ9036V)等,均購(gòu)于Sigma 公司。

      1.2 樣品制備

      配制1 000 mL,20 mmol/L,pH=7.4 Tris-HCl緩沖液,放入4 ℃冰箱備用。準(zhǔn)確稱取0.4 g 的BSA、BLG、lysozyme 3 種蛋白質(zhì),用Tris-HCl 緩沖液分別溶解。使最終蛋白質(zhì)量濃度為20 mg/mL。稱取0.1 g OVA,用Tris-HCl 緩沖液溶解,使最終蛋白質(zhì)量濃度為10 mg/mL。為了使蛋白原始溶液充分水化溶解,將配好的4 種蛋白溶液分別放置在磁力攪拌器中攪拌2 h,攪拌速度為150 r/min,之后將溶液放置于4 ℃冰箱保存24 h。將放置24 h 后的4 種蛋白原始溶液用Tris-HCl 稀釋2~10倍5 個(gè)濃度梯度至10 mL,備用。

      1.3 動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)定

      動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)通過(guò)Stokes-Einstein 方程變形得到方程(1),通過(guò)測(cè)量體系中球形顆粒的平移擴(kuò)散系數(shù)來(lái)計(jì)算顆粒粒徑和液體黏度[19-22]。

      式中:η——溶劑的黏度,mPa·s;κB——波爾茨曼常數(shù),J/K;T——溫度,K;R——水力學(xué)半徑,nm;D——擴(kuò)散系數(shù),cm2/s。

      分散的膠體粒子在液體中做無(wú)規(guī)則布朗運(yùn)動(dòng)時(shí),在固定散射角θ 處觀測(cè)到的散射光光強(qiáng)Ι(t)隨時(shí)間漲落,相關(guān)時(shí)間的指數(shù)衰減函數(shù)如下:

      方程(2)中:Ι(t)——散射光光強(qiáng);τ——衰減時(shí)間,ms。衰減時(shí)間τ 與表征體系中粒子的集體布朗運(yùn)動(dòng)平移擴(kuò)散系數(shù)D有如下關(guān)系:

      式中:q——散射矢量,cm-1;n——樣品折射率;λ0——光在真空中的波長(zhǎng),nm;θ——散射角,°。將(3)式帶入(1)式得到最終黏度計(jì)算公式為:

      式中:η——溶劑的黏度,mPa·s;κB——波爾茨曼常數(shù),J/K;T——溫度,K;τ——衰減時(shí)間,ms;R——水力學(xué)半徑,nm。

      分別取2.5 mL Tris-HCl 緩沖液,快速經(jīng)過(guò)0.22 μm 的濾膜(水膜)過(guò)濾后,緩慢滴入3 個(gè)已經(jīng)由丙酮淋洗干凈的光散射專用測(cè)量瓶中,用移液槍取2 μL 3 種不同膠體粒子分別加入Tris-HCl緩沖液中,輕輕搖勻使膠體粒子充分分散在體系中避免氣泡給試驗(yàn)帶來(lái)干擾,等待測(cè)量。

      取2.5 mL 稀釋好的不同濃度梯度的蛋白溶液,快速經(jīng)過(guò)0.22 μm 的親水濾膜,放入已經(jīng)由丙酮淋洗干凈的光散射專用測(cè)量瓶中。重復(fù)3 次,在相同濃度蛋白溶液測(cè)試樣品中,分別用移液槍精確滴入2 μL 3 種膠體粒子(A,B,C),輕輕搖晃光散射瓶子30 s,使膠體粒子充分分散在溶液中。所測(cè)量的每種蛋白有15 個(gè)樣品,所有樣品均操作相同,清楚標(biāo)記每個(gè)樣品名稱。

      本試驗(yàn)選擇的測(cè)量波長(zhǎng)為632.8 nm,測(cè)量角度為90°,測(cè)量溫度為25 ℃,測(cè)量時(shí)間為30 s,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)量10 次。

      1.4 膠體粒子zata 電位測(cè)定

      取3 個(gè)試管,分別加入3 mL Tris-HCl 緩沖液,用移液槍取2 μL 3 種不同膠體粒子分別加入到3 個(gè)試管溶液中搖晃,使膠體粒子充分分散到溶液中,取樣加入到樣品池中25 ℃等待測(cè)量。樣品測(cè)試前在儀器中平衡60 s,設(shè)定蛋白模式程序,每組運(yùn)行11 次,運(yùn)行3 組,結(jié)果為多次測(cè)試的平均值。

      1.5 均方旋轉(zhuǎn)半徑Rg 的測(cè)定

      在25 ℃下,將動(dòng)態(tài)光散射所制備的樣品放入樣品瓶,利用光散射儀對(duì)BSA,BLG,lys 3 種蛋白與3 種粒子做靜態(tài)光散射分析。測(cè)試角度范圍為30°~60°,2°為一個(gè)梯度,測(cè)試誤差為5%,測(cè)試時(shí)間為30 s,測(cè)試中入射光強(qiáng)保持不變,待測(cè)樣品平行測(cè)定3 次。

      2 結(jié)果與討論

      2.1 蛋白質(zhì)與膠體粒子動(dòng)態(tài)光散射自相關(guān)函數(shù)分析

      圖1a 是A,B,C 3 種不同膠體粒子分散到Tris-HCl 緩沖液的自相關(guān)函數(shù),它們尺寸不同,其中,膠體粒子B 表面接有羧基基團(tuán)??梢钥闯鲞@3種膠體粒子相關(guān)函數(shù)均沿弛豫時(shí)間軸快速移動(dòng)到較短時(shí)間,說(shuō)明這3 種膠體粒子本身均一性較好,粒徑均呈單峰分布且較集中,沒(méi)有發(fā)生聚集現(xiàn)象,可以排除膠體粒子本身對(duì)試驗(yàn)準(zhǔn)確性造成的干擾。

      可以從圖1b 看出膠體粒子C 分散的溶液體系中自相關(guān)函數(shù)沿著弛豫時(shí)間并沒(méi)有快速移動(dòng),且相關(guān)函數(shù)沒(méi)有衰減到0,粒徑呈多峰分布。說(shuō)明在膠體粒子C 存在的體系中,lys 與膠體粒子C 發(fā)生強(qiáng)相互作用,發(fā)生較為嚴(yán)重的聚集現(xiàn)象且有大顆粒產(chǎn)生。所以,使用膠體粒子C 測(cè)蛋白黏度所得到的黏度值與真實(shí)值有偏差。從圖1c、1d 可以看出BSA 和BLG 體系的自相關(guān)函數(shù)沿著弛豫時(shí)間均快速移動(dòng)到較短時(shí)間,并且相關(guān)函數(shù)都能衰減到0,粒徑分布峰寬較窄且集中。說(shuō)明BLG 和BSA與3 種膠體粒子之間均沒(méi)有發(fā)生強(qiáng)相互作用產(chǎn)生大顆粒。而且整體來(lái)看,蛋白濃度的改變對(duì)粒子間相互作用影響不大。

      圖1 蛋白質(zhì)在3 種膠體粒子體系中的弛豫時(shí)間分布圖Fig.1 Dynamic light scattering attenuation curve of proteins in three colloidal particle systems

      2.2 膠體粒子Zeta 電位值測(cè)定分析

      由于膠體粒子C 與lys 混合體系存在大顆粒,為了進(jìn)一步探究膠體粒子與蛋白之間的相互作用,本試驗(yàn)測(cè)定了3 種膠體粒子單一分散體系的Zeta 電位值。從圖2 中可以看出,A,B,C 3 種膠體粒子均帶負(fù)電,并且A 與B 所帶負(fù)電荷明顯少于C,而蛋白溶液所處環(huán)境pH 值為7.4,在此條件下,BSA(pI=4.7),BLG(pI=5.2),OVA(pI=4.7),3種蛋白表面均帶大量負(fù)電荷,因此與膠體粒子之間沒(méi)有較強(qiáng)的靜電荷相互吸引作用。而lys 的等電點(diǎn)pI=11.35 高于7.4,蛋白表面會(huì)帶較多正電荷,因而會(huì)與膠體粒子C 發(fā)生較強(qiáng)的靜電相互吸引作用,甚至產(chǎn)生聚集現(xiàn)象。這也解釋了1 中的試驗(yàn)現(xiàn)象。因此在后續(xù)lys 體系黏度測(cè)量時(shí),我們選擇了A 與B 兩種膠體粒子。

      圖2 3 種膠體粒子A,B,C Zeta-電位值Fig.2 The Zeta-potential values of colloidal particles(A,B,C)

      2.3 膠體粒子Rg 測(cè)定分析

      為了進(jìn)一步說(shuō)明液體分散體系中蛋白與膠體粒子之間是否存在強(qiáng)相互作用,確保動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量蛋白黏度的可靠性,我們利用靜態(tài)光散射測(cè)量了旋轉(zhuǎn)半徑Rg[23-25]。通過(guò)監(jiān)測(cè)Rg 隨蛋白濃度梯度的變化,進(jìn)一步證實(shí)所測(cè)結(jié)果的變化是由粒子間相互作用減弱所致還是由顆粒本身的幾何形狀變化所致。

      通過(guò)圖3 可以看出,膠體粒子分散在緩沖液中測(cè)得的Rg 和分散到蛋白溶液中測(cè)得的Rg 相比沒(méi)有顯著性差異。只有在BLG 與膠體粒子B 的體系中,Rg 隨蛋白濃度改變出現(xiàn)輕微變化。從整體來(lái)看,蛋白濃度這一因素對(duì)粒子之間的相互作用沒(méi)有較大影響。

      圖3 蛋白-膠體粒子混合體系的Rg 變化Fig.3 Rg change of protein-colloidal particle hybrid system

      2.4 lys-膠體粒子體系黏度測(cè)定

      為了驗(yàn)證動(dòng)態(tài)光散射測(cè)量溶液黏度方法的可行性,首先在水溶液中加入粒徑不同的膠體粒子測(cè)定純水的黏度[27]。其次為了避免緩沖液對(duì)黏度的影響,在Tris-HCl 緩沖液中加入3 種膠體粒子測(cè)定了緩沖液黏度。結(jié)果顯示緩沖液與純水黏度差異不大,說(shuō)明緩沖液對(duì)黏度測(cè)量基本無(wú)影響。

      表1 水的黏度測(cè)定(25 ℃)Table 1 Determination of viscosity of water(25 ℃)

      可以從圖4 看出,lys 蛋白溶液的黏度隨著蛋白濃度的增加有輕微上升趨勢(shì)??赡苁怯捎趌ys 在較低濃度時(shí)對(duì)于蛋白黏度影響較小,蛋白溶液分子內(nèi)和分子之間的氫鍵作用比較弱。為了進(jìn)一步證明測(cè)得溶液黏度值真實(shí)有效,本試驗(yàn)結(jié)合宏觀流變測(cè)定了溶液黏度,如表3所示。通過(guò)將微觀與宏觀測(cè)得的黏度值進(jìn)行顯著性分析,發(fā)現(xiàn)A 與B得到的lys 黏度特性沒(méi)有明顯差異,說(shuō)明A,B 均可適用于lys 黏度的測(cè)定。從以上結(jié)果可以初步得出,膠體粒子的粒徑對(duì)lys 蛋白表觀黏度測(cè)定影響較小。

      表2 Tris-HCl 緩沖液的黏度測(cè)定(25 ℃,pH 7.4)Table 2 Viscosity determination of Tris-HCl buffer(25 ℃,pH 7.4)

      表3 10 mg/mL lys 宏觀與微觀黏度結(jié)果(25 ℃,pH 7.4)Table 3 Macroscopic and microscopic viscosity results of 10 mg/mL lys(25 ℃,pH 7.4)

      圖4 不同膠體粒子與質(zhì)量濃度下lys 黏度特性(25 ℃,pH 7.4)Fig.4 The viscosity characteristics of different concentration of lys with different colloidal particles(25 ℃,pH 7.4)

      2.5 BLG-膠體粒子體系黏度測(cè)定

      如圖5所示,在膠體粒子A 分散的BLG 蛋白溶液體系中,BLG 溶液黏度隨蛋白濃度提高有極小上升趨勢(shì),可能是由于分子間的引力沒(méi)有明顯變化。而B(niǎo) 與C 膠體粒子分散的體系中,在蛋白濃度較低時(shí)黏度趨勢(shì)不變,而隨著蛋白濃度進(jìn)一步提高,蛋白表觀黏度也有微小上升趨勢(shì),可能是由于蛋白溶液分子內(nèi)的氫鍵作用增強(qiáng)從而引起黏度的增加。用宏觀流變的方法測(cè)得溶液的黏度如表4所示。通過(guò)比較宏觀與微觀的黏度值,發(fā)現(xiàn)膠體粒子C 分散的溶液黏度與宏觀測(cè)得的黏度差距最小,說(shuō)明動(dòng)態(tài)光散射利用膠體粒子所測(cè)得的黏度是真實(shí)有效的,其中膠體粒子C 與BLG 相互作用最弱,膠體粒子C 更適宜微觀測(cè)黏度。

      圖5 不同膠體粒子與質(zhì)量濃度下BLG 黏度特性(25 ℃,pH 7.4)Fig.5 The viscosity characteristics of different concentration of BLG with different colloidal particles(25 ℃,pH 7.4)

      表4 8 mg/mL BLG 宏觀與微觀黏度結(jié)果(25 ℃,pH 7.4)Table 4 Macroscopic and microscopic viscosity results of 8 mg/mL BLG(25 ℃,pH 7.4)

      2.6 BSA-膠體粒子體系黏度測(cè)定

      圖6 顯示隨著蛋白濃度的提高,蛋白溶液黏度有所波動(dòng)。膠體粒子B 分散的體系中,隨蛋白濃度的提高,蛋白溶液黏度有輕微上升趨勢(shì)。膠體粒子C 分散的體系中,同BLG 一樣,在較低濃度時(shí)蛋白溶液黏度沒(méi)有隨蛋白濃度提高而發(fā)生明顯變化,而在蛋白濃度較高時(shí),蛋白溶液黏度有輕微上升趨勢(shì)。如表5所示,結(jié)合宏觀測(cè)得的黏度進(jìn)行顯著性分析,可以看出pH 7.4 條件下,膠體粒子A,B,C 均適宜測(cè)量BSA 溶液黏度。

      表5 10 mg/mL BSA 宏觀與微觀黏度結(jié)果(25 ℃,pH 7.4)Table 5 Macroscopic and microscopic viscosity results of 10 mg/mL BSA(25 ℃,pH 7.4)

      圖6 不同膠體粒子與質(zhì)量濃度下BSA 黏度特性(25 ℃,pH 7.4)Fig.6 The viscosity characteristics of different concentration of BSA with different colloidal particles(25 ℃,pH 7.4)

      2.7 OVA-膠體粒子體系黏度測(cè)定

      如圖7所示,隨著濃度的提高,OVA 溶液黏度有所波動(dòng),整體趨于穩(wěn)定,可能是由于蛋白濃度過(guò)低,蛋白分子間的氫鍵作用較弱導(dǎo)致黏度沒(méi)有顯著變化。結(jié)合表6,膠體粒子B 微觀測(cè)得的黏度與宏觀無(wú)顯著性差異。因此,通過(guò)DLS 選擇合適的膠體粒子微觀測(cè)得的黏度值可以信賴。可能對(duì)微觀測(cè)量結(jié)果造成偏差的主要原因有:1)顆粒團(tuán)聚,本研究在試驗(yàn)前均將分散體系充分搖晃,但即便如此,也無(wú)法保證顆粒在分散體系中不會(huì)出現(xiàn)顆粒團(tuán)聚現(xiàn)象。2)顆粒在待測(cè)液體樣品中可能存在分布不均勻的情況,局部顆粒濃度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致多重散射的現(xiàn)象。

      圖7 不同膠體粒子與質(zhì)量濃度下OVA 黏度特性(25 ℃,pH 7.4)Fig.7 The viscosity characteristics of different concentration of OVA with different colloidal particles(25 ℃,pH 7.4)

      表6 5 mg/mL OVA 宏觀與微觀黏度結(jié)果(25 ℃,pH 7.4)Table 6 Macroscopic and microscopic viscosity results of 5 mg/mL OVA(25 ℃,pH 7.4)

      3 結(jié)論

      本文利用光散射技術(shù)監(jiān)測(cè)蛋白-膠體粒子體系的相互作用,優(yōu)化了一種有效的微觀測(cè)定溶液黏度的方法,增加了研究蛋白分子構(gòu)象及溶液性質(zhì)的另一個(gè)維度。結(jié)果表明,膠體粒子的粒徑和蛋白濃度均對(duì)粒子間的相互作用影響較小,而膠體粒子與蛋白質(zhì)表面帶電性質(zhì)卻顯著影響分子間的相互作用,且對(duì)體系黏度測(cè)定也有較大影響。因此利用黏度測(cè)定的方法監(jiān)測(cè)分子間的相互作用是可行的。此外,比較宏觀與微觀測(cè)得的黏度值,發(fā)現(xiàn)表面接有羧基的膠體粒子在測(cè)量溶液黏度時(shí)適用性較高。這也說(shuō)明了DLS 微觀測(cè)得的黏度值是真實(shí)有效的,且DLS 測(cè)量蛋白溶液黏度具有顯著的優(yōu)勢(shì)。

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