王金葉,賈麗麗,徐勇,張軍華,*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院,陜西 楊凌 712100；2. 南京林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,南京 210037)

楊樹生長(zhǎng)迅速，分布廣泛，是我國最主要的造林樹種。在楊木生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的刨花鋸末等廢棄物是一種優(yōu)良的木質(zhì)纖維材料，其可以通過纖維素酶水解糖化進(jìn)而利用微生物發(fā)酵制備生物燃料，可減少對(duì)化石燃料的依賴[1]。木質(zhì)纖維素由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素所構(gòu)成，半纖維素覆蓋在纖維素微纖絲表面，通過氫鍵相互連接，而木質(zhì)素則通過共價(jià)鍵與半纖維素相連，形成穩(wěn)定的疏水結(jié)構(gòu)[2]。木質(zhì)素是纖維素酶水解的主要障礙物，其覆蓋在纖維素表面形成物理屏障，且對(duì)纖維素酶產(chǎn)生無效吸附，使纖維素酶酶解效率降低[3-4]。因此，為提高纖維素酶水解效率，通常需要將木質(zhì)纖維原料進(jìn)行預(yù)處理，以破壞其致密的結(jié)構(gòu)，脫除半纖維素和木質(zhì)素，提高纖維素酶的可及性[5-6]。

Wen等[7]研究表明，采用5%(體積分?jǐn)?shù))的乙酸在170 ℃下處理?xiàng)钅究梢愿咝е苽涞途勰咎?，但是預(yù)處理后楊木中殘留的木質(zhì)素含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))高達(dá)35.6%，當(dāng)酶劑量為20 FPU/g干物質(zhì)量(DM)時(shí)，預(yù)處理后楊木的纖維素水解得率僅22.5%。因此，想要提高乙酸預(yù)處理后楊木的纖維素酶解率，需進(jìn)一步脫除殘留的木質(zhì)素。堿性亞硫酸鹽預(yù)處理技術(shù)廣泛應(yīng)用在制漿造紙工業(yè)中，其對(duì)木質(zhì)素的脫除效率較高[8]。因此，采用乙酸預(yù)處理?xiàng)钅局苽涞途勰咎呛?，再?jīng)亞硫酸鹽預(yù)處理移除木質(zhì)素，可提高楊木纖維素的轉(zhuǎn)化率。經(jīng)過兩步預(yù)處理后楊木樣品中剩余木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)和分布發(fā)生變化，這可能會(huì)引起木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附及抑制特性發(fā)生改變。

筆者在前期的研究中已證實(shí)乙酸預(yù)處理會(huì)增強(qiáng)木質(zhì)素對(duì)纖維素酶水解的抑制作用[9]，而亞硫酸鹽二次預(yù)處理后木質(zhì)素對(duì)纖維素酶水解的影響有待進(jìn)一步探究。為探明二次預(yù)處理對(duì)楊木的酶解效率以及對(duì)楊木木質(zhì)素非生產(chǎn)性吸附纖維素酶的影響，分離了乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理前后的楊木木質(zhì)素，并運(yùn)用凝膠滲透色譜(GPC)、二維異核單量子關(guān)系核磁(HSQC-NMR)、定量磷譜(31P NMR)等技術(shù)分析了木質(zhì)素在兩步預(yù)處理過程中的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的變化，考察了預(yù)處理后楊木纖維素酶解率以及兩步預(yù)處理對(duì)木質(zhì)素吸附/脫附纖維素酶的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

楊木(PopulusL.)屑產(chǎn)自江蘇宿遷。首先將楊木屑進(jìn)行粉碎、過60目篩(孔徑為0.3 mm)制備楊木粉備用。用有機(jī)溶劑(甲苯和乙醇體積比為2∶1)對(duì)楊木粉脫蠟6 h，將剩余固體在45 ℃下通風(fēng)干燥24 h。經(jīng)測(cè)定楊木的化學(xué)組成(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為：46.33%葡聚糖、18.25%木聚糖和29.83%木質(zhì)素(其中包含25.12%的酸不溶木質(zhì)素和4.71%的酸溶木質(zhì)素)。參照文獻(xiàn)[10]報(bào)道的球磨條件，對(duì)上述脫蠟后的楊木粉進(jìn)行球磨，制得球磨后楊木樣品(BM-poplar)。

商品纖維素酶Cellic Ctec2，購自丹麥Novozyme公司，其酶活為137.8 FPU/mL；微晶纖維素Avicel PH-101、木聚糖酶(來自Aspergillusoryzae)、蛋白酶(來自Streptomycesgriseus)、葡萄糖、氯仿-d1、二甲基亞砜-d6、2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧磷雜環(huán)戊烷、環(huán)己醇、乙酰丙酮鉻(Ⅲ)、吡啶、乙酸酐以及乙酸，購自美國Sigma-Aldrich公司；蛋白檢測(cè)試劑盒(二喹啉甲酸，BCA法)購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 楊木預(yù)處理

將BM-poplar和5%(體積分?jǐn)?shù))乙酸按照固液比1∶10(g∶mL)在170 ℃反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)釜迅速冷卻至20 ℃。采用真空抽濾收集反應(yīng)剩余固體，并用蒸餾水將其洗至中性，最后將固體部分凍干即得到乙酸預(yù)處理后的楊木樣品(AA-poplar)。

參照文獻(xiàn)[8]報(bào)道的條件，采用堿性亞硫酸鹽對(duì)AA-poplar進(jìn)行第2步預(yù)處理。具體操作如下：將AA-poplar與含有1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的氫氧化鈉和4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的亞硫酸鈉的水溶液按照固液比1∶10(g∶mL)在121 ℃下反應(yīng)60 min。反應(yīng)結(jié)束后，用真空抽濾收集剩余固體，并用蒸餾水將其洗至中性，最后將固體剩余物凍干即得到乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后的楊木樣品(AA-AS-poplar)。參照文獻(xiàn)[11]分析預(yù)處理后楊木樣品的化學(xué)組分，結(jié)果為2次重復(fù)測(cè)定的平均值。

1.3 楊木的X射線光電子能譜分析

采用Escalab 250Xi型X射線光電子能譜儀(XPS，美國Thermo Fisher Scientific)對(duì)楊木樣品表層(2～10 nm)碳原子的化學(xué)環(huán)境進(jìn)行檢測(cè)，且樣品表面木質(zhì)素的覆蓋率S木質(zhì)素按下式計(jì)算[12]：

S木質(zhì)素=[n(O/C)-0.83]/(0.33-0.83)×100%

(1)

式中：n(O/C)為XPS測(cè)得的楊木樣品表面的氧碳比；0.83為n(O/C碳水化合物)值；0.33為n(O/C木質(zhì)素)值。

1.4 木質(zhì)素的制備

用纖維素酶(60 FPU/g DM)和木聚糖酶(299.4 U/g DM)在50 ℃下水解楊木樣品(BM-poplar和AA-AS-poplar)72 h，重復(fù)3次，水解結(jié)束后，5 000 r/min下離心5 min得到固體殘?jiān)⑸鲜鏊鈿堅(jiān)鶆蚍稚⒃趐H 7.0的磷酸緩沖液中配成固含量為5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的物料體系，添加蛋白酶(20 U/g DM)在37 ℃水解24 h。水解結(jié)束后，用蒸餾水對(duì)水解殘?jiān)M(jìn)行充分洗滌，然后5 000 r/min下離心5 min得到固體殘?jiān)?，凍干后即得到BM-poplar和AA-AS-poplar的酶解殘?jiān)?。?jīng)測(cè)定，AA-AS-poplar的酶解殘?jiān)械哪举|(zhì)素含量大于93%，無須進(jìn)一步提取純化，直接將其作為乙酸-亞硫酸鹽預(yù)處理后的木質(zhì)素樣品(AA-AS-lignin)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。參照文獻(xiàn)[13]報(bào)道的提取方法，采用二氧六環(huán)(二氧六環(huán)和水體積比為96∶4)從BM-poplar的酶解殘?jiān)刑崛》蛛x得到木質(zhì)素樣品(BM-lignin)。

1.5 纖維素酶水解實(shí)驗(yàn)

在預(yù)處理后的2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))楊木樣品中分別添加5，10和20 FPU/g DM的纖維素酶，并在pH 5.0、50 ℃的條件下水解48 h。待水解完成后，用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定水解上清液中的葡萄糖含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為2組平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

為考察預(yù)處理后楊木木質(zhì)素對(duì)纖維素酶水解的影響，將BM-lignin和AA-AS-lignin分別添加到2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Avicel的酶解體系中，在50 ℃下水解6～48 h，其中木質(zhì)素的添加量為200 mg/g纖維素，纖維素酶劑量為10 FPU/g纖維素。待水解完成后，于5 000 r/min下離心10 min取上清液，采用HPLC測(cè)定上清液中的葡萄糖含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為2組平行實(shí)驗(yàn)的平均值，且標(biāo)準(zhǔn)誤差以誤差線顯示。

1.6 纖維素酶吸附實(shí)驗(yàn)

將不同含量的纖維素酶(24～480 mg/g 木質(zhì)素)與1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))木質(zhì)素在pH 5.0、4 ℃、磁力攪拌的條件下平衡1 h。然后，將固液兩相離心分離(4 ℃、5 000 r/min、10 min)，上清液中游離蛋白含量的測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[9]。木質(zhì)素吸附的酶蛋白量為初始添加的酶蛋白量與上清液中游離蛋白量的差值。根據(jù)Langmuir吸附等溫線方程可計(jì)算得到木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附參數(shù)[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為2組平行測(cè)定的平均值，標(biāo)準(zhǔn)誤差以誤差線顯示。

1.7 纖維素酶脫附實(shí)驗(yàn)

將1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))木質(zhì)素與纖維素酶(480 mg/g木質(zhì)素)在4 ℃下進(jìn)行吸附-脫附實(shí)驗(yàn)，具體操作流程及纖維素酶脫附回收率計(jì)算公式見文獻(xiàn)[14]。采用蛋白質(zhì)量檢測(cè)BCA法測(cè)定所得到的吸附和脫附上清液中的蛋白含量。將最終所得的固體殘?jiān)?木質(zhì)素-纖維素酶復(fù)合物)分成2等份，其中一份作為纖維素酶源于50 ℃水解1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Avicel 48 h，待水解結(jié)束后，用HPLC測(cè)定上清液中的葡萄糖含量；另一半用于氮元素分析。采用有機(jī)元素分析儀(德國Elementar Analysen systeme GmbH)對(duì)木質(zhì)素-纖維素酶復(fù)合物中的氮元素含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)試結(jié)果為2組重復(fù)測(cè)定的平均值。

1.8 木質(zhì)素的表征

將木質(zhì)素粉末與乙酸酐/吡啶混合液(體積比1∶1)按照固液比25∶1(mg∶mL)混合，在室溫、磁力攪拌的條件下反應(yīng)24 h將木質(zhì)素乙酰化[15]，然后將乙酰化的木質(zhì)素溶解到四氫呋喃溶劑中，采用GPC測(cè)定木質(zhì)素的分子量。流動(dòng)相為四氫呋喃，流速為1.0 mL/min，所用的凝膠滲透色譜儀型號(hào)為Waters1525(美國Waters)，檢測(cè)器為Waters 2414示差折光檢測(cè)器，色譜柱型號(hào)為Agilent PL gel 5 μm MIXED-C(美國Agilent)。

取50 mg木質(zhì)素溶解于1 mL DMSO-d6，將溶解好的樣品轉(zhuǎn)移至直徑為5 mm的核磁管中待測(cè)。采用500 MHz的AVIII核磁波譜儀(瑞士Bruker)對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行HSQC-NMR分析。參數(shù)設(shè)置為：標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列“hsqcetgpsi”；1H維度的采樣點(diǎn)數(shù)為1 024，13C維度的采樣點(diǎn)數(shù)為256；弛豫時(shí)間為1.5 s(D1)，累加(NS)64次。以環(huán)己醇作為內(nèi)標(biāo)，采用定量31P NMR對(duì)木質(zhì)素的各類羥基含量進(jìn)行測(cè)定[16]。測(cè)試條件：脈沖延遲時(shí)間25 s，累積次數(shù)192次。采用TopSpin 3.5軟件對(duì)核磁譜圖進(jìn)行定量積分計(jì)算。

采用有機(jī)元素分析儀測(cè)定木質(zhì)素樣品的硫元素含量，測(cè)試結(jié)果為3次重復(fù)測(cè)定的平均值。木質(zhì)素的Zeta電位和疏水性的測(cè)定步驟見文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)處理后楊木的化學(xué)組分及酶水解

楊木經(jīng)乙酸預(yù)處理可以高效制備低聚木糖[7]。預(yù)處理后楊木的化學(xué)組分見表1。乙酸預(yù)處理對(duì)木質(zhì)素的脫除效果較差。為進(jìn)一步有效脫除乙酸預(yù)處理后楊木中的剩余木質(zhì)素，對(duì)其進(jìn)行了亞硫酸鹽第2步預(yù)處理。結(jié)果顯示，亞硫酸鹽預(yù)處理后殘?jiān)心举|(zhì)素的含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)從34.23%減少到26.75%，這可能是因?yàn)槟举|(zhì)素以木質(zhì)素磺酸鹽的形式溶出[17]。經(jīng)過乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后，楊木木聚糖的含量從18.25%降低到0.65%。這說明在乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理過程中楊木半纖維素大量溶出。隨著木質(zhì)素和木聚糖含量的減少，葡聚糖的相對(duì)含量從46.33%增加到72.60%。

表1 預(yù)處理后楊木的化學(xué)組分Table 1 Chemical compositions of poplar after pretreatment

圖1 預(yù)處理后楊木的XPS譜圖Fig. 1 XPS spectras of poplar samples after pretreatment

乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后楊木水解的葡萄糖得率有明顯的提高，當(dāng)酶劑量為20 FPU/g DM時(shí)，葡萄糖得率可達(dá)到67.1%，而在同等條件下BM-poplar水解的葡萄糖得率僅為32.4%。這歸因于第2步預(yù)處理后楊木中的木聚糖和木質(zhì)素得到了進(jìn)一步的脫除，增加了纖維素的可及性。盡管兩步預(yù)處理對(duì)木質(zhì)素的脫除效果有限，而且AA-AS-poplar樣品表面的木質(zhì)素覆蓋率高達(dá)44.27%(表1)，但是兩步預(yù)處理后楊木的水解得率仍然有明顯提高，這說明預(yù)處理后木質(zhì)素在原料中的分布以及結(jié)構(gòu)變化均會(huì)對(duì)原料的纖維素酶水解產(chǎn)生影響。然而，在酶增加到20 FPU/g DM時(shí)AA-AS-poplar的水解得率仍未超過70%。因此，有必要對(duì)乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后楊木木質(zhì)素的化學(xué)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)進(jìn)行表征，進(jìn)而探明其對(duì)纖維素酶水解的影響。

2.2 木質(zhì)素的表征

木質(zhì)素樣品的化學(xué)組分分析表明，兩種木質(zhì)素樣品的純度較高，木質(zhì)素含量均大于93%。其中，BM-lignin含有少量的葡聚糖(0.7%)和木聚糖(1.8%)，可能是因?yàn)槟举|(zhì)素-碳水化合物連接鍵在球磨及酶水解過程中不易斷裂[5]。AA-AS-lignin是未經(jīng)有機(jī)溶劑萃取的酶解殘?jiān)?，因而有少量的葡聚?1.3%)以及木聚糖(0.6%)殘留。木質(zhì)素分子量測(cè)定結(jié)果顯示，乙酸-亞硫酸鹽兩步處理后木質(zhì)素的重均分子量(Mw)和數(shù)均分子量(Mn)分別從12 211和6 372 g/mol(BM-lignin)降低到了1 206 和844 g/mol，推測(cè)是因?yàn)樵陬A(yù)處理過程中木質(zhì)素的醚鍵大量斷裂[19]，而且木質(zhì)素以木質(zhì)素磺酸鹽的形式溶出[17]。此外，乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后木質(zhì)素分子量分散系數(shù)(PDI)從1.91減小至1.43，說明預(yù)處理使木質(zhì)素的分子量大小變得更加均一。

采用HSQC-NMR對(duì)木質(zhì)素樣品的結(jié)構(gòu)單元及連接鍵進(jìn)行定量分析(圖2)。木質(zhì)素的主要結(jié)構(gòu)單元和連接鍵分別在HSQC譜圖的芳環(huán)區(qū)(δ100.0～140.0/6.0～8.0)和側(cè)鏈區(qū)(δ50.0～90.0/2.5～6.0)進(jìn)行定量計(jì)算[15]，計(jì)算結(jié)果列于表2中。

圖2 木質(zhì)素的二維HSQC核磁譜圖Fig. 2 HSQC-NMR spectras of lignin

表2 采用二維HSQC核磁分析得到的木質(zhì)素子結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量Table 2 Quantitative information of lignin substructures by HSQC-NMR analysis

在HSQC譜圖的芳環(huán)區(qū)，木質(zhì)素的紫丁香基(S)、愈創(chuàng)木基(G)和對(duì)羥苯基(PB)單元的相對(duì)含量分別由S單元的C2,6—H2,6相關(guān)信號(hào)、G單元的C2—H2相關(guān)信號(hào)以及PB單元的C2,6—H2,6相關(guān)信號(hào)進(jìn)行積分計(jì)算。其中，各結(jié)構(gòu)單元的含量是被測(cè)結(jié)構(gòu)單元占S和G單元總數(shù)的百分?jǐn)?shù)。由表2可知，乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后木質(zhì)素的S單元增加，而G單元的含量減少，因而S/G值從1.4(BM-lignin)增加到4.0(AA-AS-lignin)，而PB單元的含量隨著S/G的增加而減少。在木質(zhì)素的側(cè)鏈區(qū)，采用β-O-4醚鍵(A)、樹脂醇結(jié)構(gòu)(β-β，B)以及苯基香豆?jié)M結(jié)構(gòu)(β-5，C)的α位碳?xì)湎嚓P(guān)信號(hào)(Cα-Hα)進(jìn)行積分計(jì)算各連接鍵的相對(duì)含量。其中，各連接鍵的含量是指被測(cè)連接鍵占β-O-4、β-β和β-5總數(shù)的比例。乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后木質(zhì)素的β-O-4醚鍵減少，而β-β和β-5的相對(duì)含量增加。這是因?yàn)樵谒嵝曰蛘邏A性環(huán)境的高溫預(yù)處理過程中，木質(zhì)素醚鍵的斷裂會(huì)伴隨著木質(zhì)素碎片的再縮合反應(yīng)發(fā)生[19]。結(jié)合木質(zhì)素的分子量數(shù)據(jù)，推測(cè)在兩步預(yù)處理過程中木質(zhì)素的解聚和縮合同時(shí)發(fā)生，而解聚反應(yīng)占據(jù)主導(dǎo)地位，最終導(dǎo)致木質(zhì)素的分子量減小。另外，在AA-AS-lignin的側(cè)鏈區(qū)可以看到木聚糖及葡聚糖的相關(guān)信號(hào)(圖2)，位于δ72.8～75.2/3.2～3.5。這是由于AA-AS-lignin是未經(jīng)有機(jī)溶劑萃取提純的酶解殘?jiān)渲械奶妓衔锉热缙暇厶呛肯鄬?duì)較高。

以環(huán)己醇為內(nèi)標(biāo)，對(duì)磷化后的木質(zhì)素樣品進(jìn)行定量磷譜分析(圖3)，譜圖的歸屬情況見前期報(bào)道[9]。結(jié)果顯示，乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后木質(zhì)素的脂肪族羥基含量減少，而酚羥基(S—OH、G—OH及PB—OH)的含量明顯增加(表3)，這可能是由于木質(zhì)素β-O-4醚鍵斷裂后形成了新的酚羥基[13]。乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后隨著木質(zhì)素S—OH和G—OH的含量增加，PB—OH的含量則從0.45 mmol/g降低到0.08 mmol/g，這與表2中木質(zhì)素PB單元的相對(duì)含量的變化趨勢(shì)一致。此外，AA-AS-lignin的譜圖中可以看到一些雜峰位于δ144～145，這可能是木質(zhì)素樣品中殘留多糖的羥基峰[16]。

圖3 木質(zhì)素的定量磷譜圖Fig. 3 Quantitative 31P NMR spectra of lignin

木質(zhì)素的靜電特性和疏水性會(huì)影響其對(duì)纖維素酶的吸附能力[20]。兩個(gè)木質(zhì)素在水相環(huán)境下均帶負(fù)電荷，且兩步預(yù)處理后木質(zhì)素的Zeta電位從-47.63 mV(BM-lignin)略降低到-44.23 mV(AA-AS-lignin)。據(jù)報(bào)道，木質(zhì)素羥基和羧基可以在水相環(huán)境下解離而帶負(fù)電荷[21]。與BM-lignin(0.05%)相比，AS-AA-lignin的硫元素含量增加到0.76%，說明亞硫酸鹽預(yù)處理后木質(zhì)素中發(fā)生了磺化。因而AS-AA-lignin的負(fù)電荷可能來自于磺酸基、羥基和羧基的解離。木質(zhì)素基團(tuán)的解離能力與其所處化學(xué)環(huán)境有關(guān)[21]，故而乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后木質(zhì)素Zeta電位略降低的原因是很可能與其脂肪族羥基、酚羥基、羧基和磺酸基含量變化有關(guān)(表3)。未預(yù)處理的BM-lignin的疏水性較高為3.7 L/g，而經(jīng)過兩步預(yù)處理后木質(zhì)素的疏水性降低至0.89 L/g。木質(zhì)素的疏水性基團(tuán)(如甲氧基和芳基等)和親水性基團(tuán)(如羥基和羧基等)的比例決定其總的疏水性大小。因此，預(yù)處理后木質(zhì)素官能團(tuán)的形成與消去會(huì)影響其整體疏水性的大小。BM-lignin較高的疏水性表明楊木的原本木質(zhì)素含有較多的疏水性基團(tuán)。AA-AS-lignin疏水性的降低可能是由于木質(zhì)素側(cè)鏈斷裂之后形成了大量的親水性官能團(tuán)，如羥基和羧基(表3)。此外，木質(zhì)素的磺化也會(huì)降低其疏水性[8,22]。

表3 采用定量磷譜對(duì)木質(zhì)素各羥基含量的測(cè)定結(jié)果Table 3 Quantitative information on OH groups in lignin by a quantitative 31P NMR method mmol/g

2.3 木質(zhì)素對(duì)纖維素酶水解的影響

一般認(rèn)為，從球磨后的木質(zhì)纖維原料中分離得到的木質(zhì)素樣品保留了原料中木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)特征[13]。結(jié)果表明，添加BM-lignin后Avicel水解的葡萄糖得率幾乎沒有降低，而添加AA-AS-lignin后對(duì)Avicel酶水解的抑制率達(dá)到了16.5%(圖4)。Kellock等[23]的研究表明纖維素酶對(duì)原本木質(zhì)素的吸附能力較弱，這可以解釋BM-lignin對(duì)纖維素酶水解較弱的抑制作用。然而，乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后木質(zhì)素對(duì)纖維素酶水解的抑制作用明顯增強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，木質(zhì)素磺酸鹽可以表現(xiàn)出表面活性劑的特性，通過靜電斥力減少木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附，進(jìn)而促進(jìn)纖維素酶水解[17]。盡管AA-AS-lignin也被磺化，但是AA-AS-lignin卻表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，導(dǎo)致二者對(duì)纖維素酶水解產(chǎn)生不同影響的原因很可能是其結(jié)構(gòu)差異較大。木質(zhì)素磺酸鹽是亞硫酸鹽預(yù)處理水解液中的游離態(tài)木質(zhì)素衍生物，而AA-AS-lignin是經(jīng)過乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后的剩余木質(zhì)素固體殘?jiān)?。兩步預(yù)處理過程中木質(zhì)素分子側(cè)鏈的斷裂產(chǎn)生的大量酚羥基很可能是導(dǎo)致其抑制作用增強(qiáng)的原因之一[13]。此外，AA-AS-lignin較高的S/G比值也可能是導(dǎo)致其對(duì)纖維素酶水解抑制增強(qiáng)的原因[24-25]，究其原因可能是木質(zhì)素S單元比G單元對(duì)纖維素酶水解有更顯著的抑制效果[24]。

圖4 木質(zhì)素對(duì)纖維素酶水解的影響Fig. 4 Effects of lignin on enzymatic hydrolysis of cellulose

2.4 木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附

木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附符合Langmuir吸附等溫線(決定系數(shù)R2>0.8)(圖5)。BM-lignin的最大吸附容量(Pads,m)為55.7 mg/g，而AA-AS-lignin的Pads,m則增大到了175.0 mg/g，表明兩步預(yù)處理后木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附位點(diǎn)增多。結(jié)合強(qiáng)度是由Pads,m乘以吸附平衡常數(shù)(Kp，BM-lignin為0.44，AA-AS-lignin為0.41)所得，它可以更加全面地反映木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附強(qiáng)度。兩步預(yù)處理后木質(zhì)素的結(jié)合強(qiáng)度從24.7 mL/g(BM-lignin)增大到72.1 mL/g。木質(zhì)素的疏水性被認(rèn)為是其吸附纖維素酶的主要推動(dòng)力[20]，而帶負(fù)電荷較多的木質(zhì)素與纖維素酶之間存在較強(qiáng)的靜電斥力[17,20]。

圖5 木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的吸附等溫線Fig. 5 Adsorption isotherm of cellulase on lignin

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雖然AA-AS-lignin有較低的疏水性，但是卻表現(xiàn)出較大的吸附纖維素酶的能力。另外，AA-AS-lignin和BM-lignin的Zeta電位很接近，但是二者卻表現(xiàn)出不同的纖維素酶吸附能力，說明乙酸-亞硫酸鹽預(yù)處理后木質(zhì)素的疏水性和Zeta電位不是影響其對(duì)纖維素酶吸附能力的主導(dǎo)因素。據(jù)報(bào)道，木質(zhì)素發(fā)生磺化后所帶的磺酸基與帶負(fù)電的纖維素酶之間可產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電斥力，進(jìn)而緩解其對(duì)纖維素酶的吸附[8]，然而，被磺化的AA-AS-lignin卻表現(xiàn)出較大的纖維素酶吸附能力。結(jié)合木質(zhì)素羥基官能團(tuán)的分析結(jié)果(表3)，推測(cè)導(dǎo)致AA-AS-lignin對(duì)纖維素酶吸附能力增強(qiáng)的原因很可能是兩步預(yù)處理后木質(zhì)素的酚羥基含量的增多(表2)，因?yàn)槟举|(zhì)素酚羥基的增加會(huì)使其對(duì)纖維素酶的吸附能力增強(qiáng)[13,22]。

2.5 木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的脫附

木質(zhì)素脫附纖維素酶的定量分析結(jié)果見表4。當(dāng)20.0 mg的木質(zhì)素與9.6 mg的纖維素酶在4 ℃下平衡60 min后，約有0.39和1.11 mg的纖維素酶分別被BM-lignin和AA-AS-lignin吸附。采用新鮮的緩沖液對(duì)木質(zhì)素吸附的纖維素酶進(jìn)行洗脫，纖維素酶的回收率分別達(dá)到61.1%和28.8%，說明兩步預(yù)處理后木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的脫附能力降低。吸附-脫附之后所得的木質(zhì)素-纖維素酶復(fù)合物中氮元素含量的高低可以間接地反映木質(zhì)素表面吸附的酶量多少[23]。由表4可知，AA-AS-lignin與纖維素酶復(fù)合物的氮元素含量較高，這進(jìn)一步證實(shí)了兩步預(yù)處理后木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的脫附能力降低。以木質(zhì)素-纖維素酶復(fù)合物作為酶源對(duì)Avicel進(jìn)行水解，并測(cè)定葡萄糖得率。結(jié)果表明，盡管AA-AS-lignin結(jié)合了較多的纖維素酶，但是采用AA-AS-lignin-纖維素酶復(fù)合物水解Avicel卻獲得較低的葡萄糖得率(3.0%)(表4)。木質(zhì)素-纖維素酶復(fù)合物的酶活損失可能是歸因于木質(zhì)素與纖維素酶之間較強(qiáng)的結(jié)合力，這會(huì)導(dǎo)致纖維素酶與纖維素有效接觸的機(jī)會(huì)減少[23]。因而AA-AS-lignin與纖維素酶較強(qiáng)的結(jié)合強(qiáng)度可能是導(dǎo)致AA-AS-lignin-纖維素酶復(fù)合物水解能力較低的原因。

表4 木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的脫附Table 4 Desorption of cellulase from lignin

3 結(jié) 論

采用亞硫酸鹽對(duì)乙酸預(yù)處理后的楊木殘?jiān)M(jìn)行二次預(yù)處理，重點(diǎn)探究了乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理對(duì)楊木化學(xué)組分、酶水解率、殘?jiān)心举|(zhì)素的結(jié)構(gòu)及其對(duì)纖維素酶的吸附和抑制的影響。主要的結(jié)論如下：

1)乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后楊木的木質(zhì)素含量減少，預(yù)處理后楊木的水解得率從32.4%提高到67.1%。兩步預(yù)處理使木質(zhì)素嚴(yán)重降解，預(yù)處理后木質(zhì)素發(fā)生磺化并且其S/G比值及酚羥基含量增加。兩步預(yù)處理后木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的結(jié)合強(qiáng)度從24.7 mL/g增大到72.1 mL/g，而其對(duì)纖維素酶的脫附能力降低，預(yù)處理后木質(zhì)素對(duì)纖維素酶水解的抑制率從1.0%增至16.5%。

2)乙酸-亞硫酸鹽兩步預(yù)處理后楊木中剩余木質(zhì)素對(duì)纖維素酶的非生產(chǎn)性吸附及空間阻礙都對(duì)后續(xù)的纖維素酶水解不利。相比草本原料，闊葉材楊木的纖維結(jié)構(gòu)更為致密堅(jiān)硬，致使其木質(zhì)素更難脫除。另外，在170 ℃的高溫乙酸預(yù)處理過程中會(huì)形成大量的木質(zhì)素縮合結(jié)構(gòu)。以上都可能是導(dǎo)致乙酸-亞硫酸鹽預(yù)處理后楊木木質(zhì)素脫除率低，進(jìn)而使預(yù)處理后楊木纖維素水解率低的主要原因。因而，為實(shí)現(xiàn)楊木的多組分高效轉(zhuǎn)化利用，第2步亞硫酸鹽預(yù)處理的條件(如乙酸及亞硫酸鹽兩步預(yù)處理的溫度和試劑濃度等)需要繼續(xù)優(yōu)化。