三種殺蟲劑對(duì)昆蟲病原線蟲侵染臭椿溝眶象幼蟲能力的影響

鄭惠中，楊開朗，覃艷妮，郭文娟，溫俊寶

(北京林業(yè)大學(xué)林木有害生物防治北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083)

臭椿溝眶象Eucryptorrhynchusbrandti(Harold)屬鞘翅目Coleoptera象甲科Curculionidae溝眶象屬Eucryptorrhynchus，是危害臭椿Ailanthusaltissima(Mill.)Swingle及其變種千頭椿的主要鉆蛀性害蟲(趙養(yǎng)昌, 1980; Borovec, 2013)，常與其近緣種溝眶象E.scrobiculatus(Motschulsky)混合危害，近年來在寧夏發(fā)生尤其嚴(yán)重，已成為危害寧夏林業(yè)的主要害蟲。臭椿溝眶象幼蟲孵化后蛀入韌皮部，隨著蟲體發(fā)育向內(nèi)鉆蛀取食，形成不規(guī)則坑道，嚴(yán)重破壞臭椿樹的輸導(dǎo)組織(葛騰, 2000)。臭椿受臭椿溝眶象和溝眶象的單獨(dú)或混合危害，造成大量死亡或樹勢衰弱。

近年來生產(chǎn)上利用昆蟲捕獲網(wǎng)對(duì)溝眶象的阻隔及捕獲效果顯著(Yangetal., 2018; Yangetal., 2019)，但因溝眶象和臭椿溝眶象的體型區(qū)別，臭椿溝眶象蟲體小肩部窄，行動(dòng)更靈便，易穿過裙擺式捕蟲網(wǎng)的洞口，因此無法用捕蟲網(wǎng)有效防控臭椿溝眶象。目前對(duì)臭椿溝眶象等鉆蛀性害蟲仍以化學(xué)防治為主。王旭(2019)對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的殺蟲劑室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示氯氰菊酯>吡蟲啉>啶蟲脒；楊鵬(2015)通過樹干注藥測試殺蟲劑對(duì)溝眶象的防治效果，其中5%吡蟲啉對(duì)溝眶象的致死率為38.79%，為效果較優(yōu)的藥劑；楊開朗(2015)在兩種象甲危害初期，在樹干捆綁塑料裙基礎(chǔ)上使用氯氰菊酯常規(guī)噴霧，在危害初期防治效果較好。由于臭椿溝眶象幼蟲在樹干內(nèi)隱蔽活動(dòng)、越冬，林間注藥、噴霧得使用高藥量、頻用藥才可以起到防治效果，對(duì)環(huán)境危害大、農(nóng)田土壤污染重，且害蟲易產(chǎn)生抗藥性。為降低農(nóng)藥使用量，本研究尋找新的針對(duì)臭椿溝眶象幼蟲高效、環(huán)境友好的防治技術(shù)(楊忠岐等, 2018)。

昆蟲病原線蟲(Entomopathogenic nematodes, EPN)能主動(dòng)搜尋寄主昆蟲、專性寄生，適應(yīng)臭椿溝眶象幼蟲的鉆蛀特性。EPN對(duì)人畜、植物及有益生物安全，在大多數(shù)歐美國家和政府可以豁免注冊、生產(chǎn)及施放(叢斌等, 1999; 董國偉等, 2001)。全球已有多種昆蟲病原線蟲商品化生產(chǎn)并田間大面積應(yīng)用。我國有使用斯氏線蟲防治臭椿溝眶象、溝眶象的初步探索(佟振亮等, 1993; 秦緒兵等, 1999)，對(duì)象甲類害蟲進(jìn)行生物防治時(shí)常選用斯氏線蟲。如SteinernemacarpocapsaeA24對(duì)香蕉扁黑象甲幼蟲和成蟲都有較高的毒力(徐潔蓮, 1991)；Dembilio等(2009)利用斯氏線蟲S.carpocapsae在田間控制紅棕象甲R(shí)hynchophorusferrugineus的防治效果為83.8%～99.7%；Shamseldean等(2004)分別從3個(gè)不同的區(qū)域收集了3種有效的Steinernema線蟲，經(jīng)過室內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)紅棕象甲的致死率均能達(dá)到100%；Llácer等(2009)使用手動(dòng)背負(fù)式噴霧器對(duì)棕櫚樹干和基部進(jìn)行噴灑，對(duì)紅棕象甲的防治效果可達(dá)到80%和98%。因此本試驗(yàn)選用了對(duì)臭椿溝眶象幼蟲防效較好的兩個(gè)商品化斯氏線蟲品系。

將昆蟲病原線蟲與其他殺蟲制劑結(jié)合使用，是對(duì)許多害蟲常規(guī)化學(xué)防治的有效替代。與普通化學(xué)殺蟲劑相比，EPN的使用成本仍然過高，將EPN與殺蟲劑聯(lián)合使用，可有效抑制害蟲危害(Koppenhofer and Grewal, 2005)，減緩抗藥性的發(fā)展，也可以降低EPN的施用量從而降低防治成本(Yanetal., 2012)。EPN和蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis、白僵菌Beauveriabassiana(Balsamo)Vuillemin、吡蟲啉等混用比各自單獨(dú)使用會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用(Koppenh?feretal., 1997; Koppenh?feretal., 1998; Koppenh?feretal., 2000; Polararevpnetal., 2007; Koppenh?feretal., 2008)。王果紅等(2007)利用小卷蛾斯氏線蟲All品系與毒死蜱、吡蟲啉混用防治褐紋甘蔗象Rhabdosceluslineaticollis(Heller)，防效明顯優(yōu)于單獨(dú)使用化學(xué)藥劑毒死蜱、吡蟲啉或小卷蛾斯氏線蟲。王玉東等(2012)將低濃度的吡蟲啉與S.longicaudumX-7線蟲混用后處理暗黑金龜Holotrichiaparallela2齡幼蟲，殺蟲效果明顯提高。Williams等(2013)將S.carpocapsaeWeiser線蟲、白僵菌、綠僵菌配置懸浮液混合在樹樁周圍施用，防治蛀干害蟲松樹皮象Hylobiusabietis，對(duì)松樹皮象的致死率可達(dá)60%等。

本文測定了3種化學(xué)殺蟲劑與不同品系商品化斯氏線蟲混合使用的效果，通過確定高效應(yīng)用組合，為臭椿溝眶象幼蟲的綜合治理和未來昆蟲病原線蟲的田間應(yīng)用提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx及線蟲

供試?yán)ハx：臭椿溝眶象3齡幼蟲，采自寧夏石嘴山市平羅縣小興墩、大興墩、通伏鄉(xiāng)等地，由室內(nèi)人工飼料配比喂養(yǎng)(具體方法見表1)。

表1 臭椿溝眶象幼蟲人工飼料配置比例

供試線蟲：采用市面上現(xiàn)有的商品化線蟲，小卷蛾斯氏線蟲S.carpocapsaeAll、長尾斯氏線蟲S.longicaudumX-7，均購自浙江綠神天敵生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)用不同批次的線蟲重復(fù)兩次。

1.2 供試化學(xué)藥劑

供試化學(xué)藥劑商品信息見表2。在王旭(2019)研究基礎(chǔ)上，將上述3種殺蟲劑對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的LC50設(shè)為基礎(chǔ)濃度，在此基礎(chǔ)濃度上再分別用蒸餾水稀釋5倍、10倍、20倍(簡稱為1/5 LC50、1/10 LC50、1/20 LC50)；即吡蟲啉為153.3、30.66、15.33和7.67 μg/mL，氯氰菊酯為88.97、17.79、8.89和4.45 μg/mL，啶蟲脒為307.89、61.58、30.79、15.39 μg/mL。

表2 殺蟲劑及來源

1.3 藥劑對(duì)線蟲存活和侵染率的影響

用蒸餾水將供試線蟲稀釋為100 IJs/mL搖勻，將各藥劑稀釋成所需濃度梯度LC50、1/5 LC50、1/10 LC50和1/20 LC50。取5 mL上述混勻液體移入培養(yǎng)皿(直徑9 cm)在25℃±1℃的黑暗條件下放置24 h，顯微鏡下每個(gè)處理隨機(jī)檢查1 mL混合液中線蟲的存活數(shù)量，計(jì)算存活率。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，以清水線蟲懸浮液作對(duì)照。若藥劑對(duì)線蟲的致死作用或者亞致死作用沒有超過10%，則繼續(xù)測定該藥劑對(duì)線蟲侵染率的影響。

參照魏洪義等(1991)判定昆蟲病原線蟲對(duì)藥劑的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)：(1)死亡：身體僵直或卷曲，不活動(dòng)，對(duì)針刺無反應(yīng)；(2)亞致死：身體卷曲，由于藥劑麻痹作用引起痙攣性或抽搐性活動(dòng)，對(duì)針刺無反應(yīng)或反應(yīng)非常遲緩；(3)不受藥劑影響：與對(duì)照線蟲一樣，身體活動(dòng)舒展或靜止不動(dòng)，不動(dòng)的線蟲經(jīng)探針觸碰后反應(yīng)迅速。

1.4 線蟲與藥劑混用對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的作用效果

將單頭臭椿溝眶象3齡幼蟲放入裝有30 g人工配制飼料的飼養(yǎng)杯中(直徑5 cm、高4.5 cm)。設(shè)藥劑單獨(dú)處理、線蟲(200 IJs/蟲)單獨(dú)處理、線蟲(200 IJs/蟲)與藥劑混合處理和清水對(duì)照。將參試藥劑配成所需濃度備用，將線蟲懸浮液加入?yún)⒃囁巹?，按設(shè)定濃度配成系列試劑，搖勻，取1 mL均勻噴施藥劑、線蟲及兩者混合液，使藥劑或線蟲滲入飼料中，以便觸及試驗(yàn)對(duì)象，將蓋子輕蓋，置于25℃±1℃下培養(yǎng)。每個(gè)處理10頭幼蟲，3次重復(fù)。處理72 h，每24 h檢查幼蟲存活情況。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析全部在EXCEL、SPSS軟件中進(jìn)行，處理間經(jīng)方差分析差異顯著后，用Duncan多重比較方法進(jìn)行顯著性分析。昆蟲病原線蟲對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的致病力均用死亡率(%)和校正死亡率(%)表示：

由χ2獨(dú)立性檢驗(yàn)判斷線蟲與化學(xué)藥劑對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的聯(lián)合作用類型(張中潤等, 2006; 王玉東等, 2012)。

M=[MN+MI(1-MN)]

ME=M×N

χ2=(MNI-ME)2/ME

其中，M、ME分別表示線蟲與各藥劑混用對(duì)供試?yán)ハx的期望致死率及致死數(shù)；MN和MI分別為線蟲和各藥劑單獨(dú)處理供試?yán)ハx的校正死亡率；MNI為線蟲與各藥劑混用對(duì)供試?yán)ハx的實(shí)際校正死亡率；N為供試?yán)ハx總數(shù)。

線蟲與各藥劑混用后聯(lián)合作用類型的判斷依據(jù)為：當(dāng)χ2< 3.84(df=1和P=0.05)時(shí)，顯示兩種殺蟲因子混用表現(xiàn)為相加作用(Additivity)，即兩種殺蟲因子混用后的毒力和各因子毒力的總和相似；當(dāng)χ2≥ 3.84(df=1和P=0.05)及MNIME時(shí)，顯示兩種殺蟲因子混用表現(xiàn)為增效作用(Synergism)即兩種殺蟲因子混用后的毒力明顯超過各因子毒力的總和(張中潤等, 2006; 王玉東等, 2012)。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺蟲劑對(duì)昆蟲病原線蟲存活的影響

分別用吡蟲啉、啶蟲脒和高效氯氰菊酯藥液連續(xù)浸泡2個(gè)品系供試線蟲，24 h檢查發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)濃度內(nèi)3種殺蟲劑對(duì)供試線蟲均無亞致死作用，只有不同程度的死亡現(xiàn)象，但死亡率均未超過10%，且死亡率并隨各藥劑濃度降低而降低。與對(duì)照相比，啶蟲脒對(duì)線蟲致死率最高，為4.2%，氯氰菊酯次之，吡蟲啉最安全。2個(gè)品系線蟲對(duì)不同藥劑的耐藥性存在差異(P<0.05)，X-7品系對(duì)氯氰菊酯的耐藥性更強(qiáng)一些。3種藥劑低濃度處理線蟲死亡率差異不大，但啶蟲脒引起的死亡率較其它稍高。

表3 不同濃度的化學(xué)殺蟲劑對(duì)線蟲死亡率的影響

2.2 線蟲與藥劑對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的交互作用

2.2.1不同濃度的氯氰菊酯與2個(gè)品系線蟲混用對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的致死效果

參試藥劑氯氰菊酯單獨(dú)處理臭椿溝眶象幼蟲表現(xiàn)出較低的致死效果，只有在LC50(88.97 μg/mL)表現(xiàn)出30%左右的致死作用。參試線蟲分別與氯氰菊酯LC50(88.97 μg/mL)混用的致死效果顯著高于低劑量混用效果。氯氰菊酯各濃度與線蟲混用的殺蟲效果(DNI)比氯氰菊酯單用(DI)、線蟲單用(DN)均明顯提高。其中X-7與1/10 LC50(8.89 μg/mL)混用對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的致死效果為增效作用，比氯氰菊酯單用直接增加了33.34%的死亡率，比線蟲單用直接增加35%的死亡率，而其它劑量與線蟲混用的致死效果則為相加作用(表4)。

表4 2個(gè)品系線蟲與氯氰菊酯混用對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的交互作用

2.2.2不同濃度的吡蟲啉與2個(gè)品系線蟲混用對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的致死效果

結(jié)果顯示吡蟲啉單獨(dú)處理臭椿溝眶象幼蟲，幼蟲的死亡率與藥劑濃度成正相關(guān)。低濃度混用致死效果要好于高濃度混用的效果。吡蟲啉和X-7、All混用比單用的致死效果高，死亡率均在50%以上，表現(xiàn)出相加或增效作用；其中1/20 LC50(7.67 μg/mL)與X-7混用表現(xiàn)出增效作用，作用效果為54.17%，效果增加224.96%，高于與All混用的防效(表5)。

表5 2個(gè)品系線蟲與吡蟲啉混用對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的交互作用

2.2.3不同濃度的啶蟲脒與2個(gè)品系線蟲混用對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的致死效果

啶蟲脒單獨(dú)處理臭椿溝眶象幼蟲，幼蟲的死亡率與藥劑濃度成正相關(guān)。啶蟲脒的不同濃度梯度與2種線蟲X-7、All混用時(shí)，比相同濃度藥劑單用或線蟲單用的致死效果提高，均表現(xiàn)為相加作用。其中X-7與啶蟲脒LC50(307.89 μg/mL)混用比藥劑單用對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的致死率增加32.36%(表6)。

表6 2個(gè)品系線蟲與啶蟲脒混用對(duì)臭椿溝眶象幼蟲的交互作用

3 結(jié)論與討論

將昆蟲病原線蟲與化學(xué)殺蟲劑混用，既可以提高臭椿溝眶象幼蟲的防治效果，又可以降低化學(xué)藥劑的污染及延緩害蟲抗藥性的產(chǎn)生，是臭椿溝眶象幼蟲綜合治理的有效手段。昆蟲病原線蟲可以與許多農(nóng)藥兼容并混合使用，但也有多種農(nóng)藥對(duì)線蟲的生存會(huì)有影響，任何新的線蟲種-農(nóng)藥組合都需要評(píng)估相容性(Koppenh?fer and Grewal, 2005)。因此線蟲與殺蟲劑混用并非簡單地將兩者混配，而必須通過對(duì)線蟲安全性和適合度的相關(guān)試驗(yàn)來驗(yàn)證。昆蟲病原線蟲對(duì)不同化學(xué)藥劑的耐受能力不同，選擇對(duì)線蟲安全的化學(xué)藥劑也是混用成功的關(guān)鍵(王玉東等, 2012)。

本研究發(fā)現(xiàn)測試的3種化學(xué)藥劑對(duì)供試線蟲均無亞致死作用。2種昆蟲病原線蟲對(duì)不同殺蟲劑的耐藥性存在差異，其中吡蟲啉造成的線蟲致死率較低，是對(duì)線蟲較為安全的混配農(nóng)藥，低濃度氯氰菊酯次之，而啶蟲脒和高濃度氯氰菊酯對(duì)2種線蟲的致死率與對(duì)照相比顯著提高。Yan等(2012)將環(huán)境友好型殺蟲劑與昆蟲病原線蟲結(jié)合使用，結(jié)果顯示其中使用的氯氰菊酯和吡蟲啉等對(duì)線蟲的存活和傳染性無不良影響，與本試驗(yàn)結(jié)果一致，證實(shí)吡蟲啉、氯氰菊酯可與線蟲混用。

Koppenh?fer(2005)和Grewal(2005)等研究說明兩種因子對(duì)某一害蟲的聯(lián)合使用，可對(duì)害蟲的殺滅速度和死亡率產(chǎn)生拮抗、疊加或增效作用。疊加效應(yīng)表示兩種藥劑相互獨(dú)立行動(dòng)，沒有相互作用；增效作用是指兩種藥劑的聯(lián)合(或補(bǔ)充)作用，其效果比單獨(dú)作用藥劑的效果之和更大。在本試驗(yàn)中，2種線蟲與3種供試藥劑混用后對(duì)臭椿溝眶象3齡幼蟲的防治效果存在明顯差異，混用后的殺蟲效果比兩者單用的效果提高。其中線蟲與化學(xué)藥劑 LC50、1/5 LC50劑量混用后均表現(xiàn)疊加作用，1/20 LC50的吡蟲啉、1/10 LC50的氯氰菊酯與S.longicaudumX-7品系混用可產(chǎn)生明顯的增效作用。本研究結(jié)果表明，氯氰菊酯和吡蟲啉可與昆蟲病原線蟲混用，共同防治臭椿溝眶象。

殺蟲劑和昆蟲病原線蟲之間的增效效果，主要是兩種機(jī)制：殺蟲劑影響線蟲的行為，或者殺蟲劑影響目標(biāo)害蟲的行為，這種更常見(Koppenh?fer, 2005; Grewal, 2005)。Koppenh?fer 等(2000 b)研究發(fā)現(xiàn)，線蟲與吡蟲啉混用后，吡蟲啉減少蠐螬的防御行為，從而增加線蟲對(duì)蠐螬的附著和滲透，即通過藥劑降低目標(biāo)害蟲對(duì)線蟲的防御能力，從而利于線蟲的侵染；另外藥劑可能刺激線蟲的感受神經(jīng)，使線蟲興奮活性提高，導(dǎo)致線蟲的搜索和攻擊能力增強(qiáng)(Koppenhetal.1998; 武海斌等, 2014)。出于成本考慮本文主要對(duì)低劑量濃度進(jìn)行了研究，并根據(jù)結(jié)果推測低劑量的化學(xué)殺蟲劑可能更有助于昆蟲病原線蟲侵害臭椿溝眶象幼蟲。Koppenh?fer(2000)、Triggiani(1976)等研究發(fā)現(xiàn)，低劑量藥劑能引起目標(biāo)昆蟲代謝活動(dòng)的變化，使其釋放物如CO2、分泌物等增多，而線蟲對(duì)這些物質(zhì)敏感。而高濃度藥劑因?yàn)閷?duì)線蟲的存活有明顯影響，可能抑制了線蟲的活力。本研究未設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行協(xié)同作用出現(xiàn)原因及低劑量效果較好原因的具體驗(yàn)證，未來需進(jìn)一步研究。

在2種供試線蟲中，X-7品系與3種藥劑混用對(duì)臭椿溝眶象幼蟲致死效果提升要均高于All品系與藥劑的混用效果，因此 X-7品系可作為優(yōu)選品系，進(jìn)一步研究其與藥劑混用對(duì)林間臭椿溝眶象幼蟲的防治效果。近年來關(guān)于EPN防控鉆蛀性害蟲應(yīng)用技術(shù)的研究逐漸增多，陸永躍(2012)對(duì)應(yīng)用昆蟲病原線蟲防治香蕉假頸象甲的施用方法進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，將線蟲液注入蛀道的注射法最優(yōu)。目前國內(nèi)林地野外應(yīng)用昆蟲病原線蟲的技術(shù)還不成熟，仍處初步探索階段。臭椿溝眶象幼蟲鉆蛀危害，隱蔽生活，如何采用合適的施用方法讓線蟲制劑接觸到蟲體是林間應(yīng)用的難點(diǎn)。此外，面對(duì)寧夏干燥、紫外線強(qiáng)等環(huán)境特點(diǎn)，避免或改善對(duì)線蟲不利的環(huán)境因子也是未來要重點(diǎn)考慮的方面。納米技術(shù)、滲透處理等新方法或許可以為昆蟲病原線蟲抵抗惡劣環(huán)境提供新途徑，同時(shí)針對(duì)臭椿溝眶象幼蟲線蟲和殺蟲劑組合使用的經(jīng)濟(jì)可行性還需進(jìn)一步研究。