FXR信號通路介導何首烏導致脂質(zhì)沉積的作用及機理研究

韓宗萍 卓飛霞 李芳 夏瑾瑜 黃明星

【摘要】目的 探索何首烏對肝細胞脂質(zhì)沉積的影響及其機制。方法 利用永生化肝細胞系LO2，采用1 mmol/L游離脂肪酸（FFA）處理，建立脂肪肝沉積細胞模型。同時加入不同濃度的何首烏提取物處理（0、2.5、5、10 μg/mL），采用油紅O染色以觀察何首烏對LO2細胞脂肪沉積的作用;采用實時熒光定量PCR進行實驗組LO2細胞內(nèi)法尼酯X受體（Fxr）基因及其下游通路膽鹽輸出泵（Bsep）、小分子異源二聚體伴侶（Shp）、膽固醇7α-羥化酶1（Cyp7a1）關鍵基因的檢測;并采用蛋白免疫印跡法檢測FXR及其下游通路關鍵蛋白的表達水平。結果 何首烏處理后的LO2細胞中，油紅O的染色量會隨著藥物濃度增加而增加;Fxr的mRNA表達下降，而FXR蛋白誘導促進的下游基因Bsep、Shp的表達相應下降，而其下游抑制基因Cyp7a1的表達則上升（P均<0.05）。何首烏處理的LO2肝細胞中，F(xiàn)XR的蛋白水平明顯降低，蛋白激酶C （PKC）蛋白磷酸化水平明顯降低，而PKC總蛋白表達水平無明顯改變，SHP的蛋白水平也明顯下降。結論 何首烏可通過抑制FXR-PKC/SHP信號轉(zhuǎn)導通路，從而促進LO2肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。為何首烏導致膽汁淤積所引起的肝損傷的治療提供新的理論依據(jù)。

【關鍵詞】何首烏;藥物性肝損傷;脂質(zhì)沉積;法尼酯X受體信號通路

The effect and mechanism of FXR signaling pathway on lipid accumulation induced by Polygonum multiflorum thumb Han Zongping， Zhuo Feixia， Li Fang， Xia Jinyu， Huang Mingxing. Department of Clinical Nutrition， the Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Zhuhai 519000， China

Corresponding author，Huang Mingxing， E-mail： huangmx5@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To investigate the effect and mechanism of Polygonum multiflorum thumb （PMT） on lipid accumulation in hepatic cells. Methods Immortalized hepatocyte LO2 cell line was treated with? non free fatty acids （FFA） to establish the lipid accumulation cell model. Following treatment with 0， 2.5， 5 and 10 μg/mL PMT for 24 h， the LO2 cells were assessed for lipid accumulation by Oil red O staining. The expression levels of Fxr， Bsep， Shp and Cyp7a1 were quantitatively measured by real-time quantitative fluorescence PCR. The expression levels of FXR and key proteins in the downstream signaling pathway were detected by Western blot. Results In LO2 cells treated with PMT， the intensity of Oil red O staining was increased with the increasing concentration of PMT. The expression level of Fxr mRNA was significantly down-regulated， those of Bsep and Shp mRNA in the downstream signaling pathway were down-regulated accordingly， whereas that of Cyp7a1 mRNA in LO2 cells was significantly up-regulated （all P < 0.05）. In PMT-treated LO2 cells， the expression level of FXR protein was significantly down-regulated， the phosphorylated level of PKC was considerably decreased， the expression level of total PKC was not significantly changed and that of SHP protein was significantly down-regulated. Conclusions PMT may aggravate lipid accumulation via suppressing the FXR-PKC/SHP signaling pathway. These findings provide novel theoretical evidence for the treatment of liver injury caused by PMT induced-intrahepatic cholestasis.

【Key words】Polygonum multiflorum thumb; Drug-induced liver injury; Lipid accumulation;

FXR signaling pathway

近年來，藥物性肝損傷的發(fā)生率隨著人均藥物處方的增加而大幅升高，引起國內(nèi)外的廣泛關注，特別是保健食品添加劑和中草藥導致的肝損傷占藥物性肝損傷中的比例高達16.1%[1-3]。何首烏是國內(nèi)中醫(yī)常用的藥物，為蓼科植物何首烏的干燥塊根[4-7]。目前常用于補肝腎中藥類保健品和護發(fā)制劑，以及大眾日常餐飲、食療保健等。但英國藥品與健康產(chǎn)品管理局曾于2006年通報過何首烏制劑的肝損傷案例，其后國內(nèi)陸續(xù)出現(xiàn)了大量關于何首烏導致肝損傷報道，甚至致死或肝移植案例[4-7]。歐洲和美國等藥品監(jiān)管部門均出臺了對何首烏及含何首烏的制劑進行監(jiān)管的相關政策[3]。目前認為何首烏引起的肝損傷中36.0%為膽汁淤積的表現(xiàn)和癥狀[4-7]。

然而，目前何首烏導致的肝內(nèi)膽汁淤積的確切機制尚不清楚。目前藥物性肝內(nèi)膽汁淤積的主要機制是膽汁合成和轉(zhuǎn)運受損，這個過程受膜受體、核受體及其轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄等一系列調(diào)控，其中法尼酯X受體（FXR）是常見的膽汁酸合成的生物感受器和受體[8-10]。FXR調(diào)節(jié)膽汁酸代謝的膽鹽輸出泵（Bsep）基因介導肝內(nèi)一價膽汁酸向膽管內(nèi)轉(zhuǎn)運，F(xiàn)XR也調(diào)控肝臟Mrp2、Ntcp等膽汁相關基因表達，調(diào)控肝細胞和膽小管的膽汁酸鹽及其有機陰離子的攝取和排泄。我們推測，F(xiàn)XR信號通路的抑制和功能下調(diào)導致膽汁淤積的發(fā)生[8-10]。

本研究通過LO2肝細胞脂質(zhì)沉積模型，初步發(fā)現(xiàn)了何首烏可通過調(diào)節(jié)FXR介導的信號通路而引發(fā)脂質(zhì)沉積。從而為明確何首烏藥物性膽汁淤積肝病的發(fā)病機制提供了重要的研究基礎，為治療何首烏導致藥物膽汁淤積的作用靶點提供重要的理論參考價值。

材料與方法

一、細胞系及實驗試劑

人永生化肝細胞系LO2購自中國醫(yī)學科學院細胞庫，凍存于實驗室液氮罐。何首烏水提取物粉末購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司。試驗開展前將何首烏粉末均勻混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na）溶液。胎牛血清（FBS）、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自Gibco公司;油紅O及游離脂肪酸（FFA）購自Sigma公司;抗FXR抗體、抗PKC抗體、抗磷酸化PKC抗體、抗小分子異源二聚體伴侶（SHP）抗體、Actin抗體購自Cell Signaling Technology公司，抗SHP抗體購自Abcam公司?？俁NA提取試劑TRIzol Reagent購自Life公司。

二、實時熒光定量PCR（RT-PCR）

采用TRIzol法提取各組細胞總RNA，使用HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ（Vazyme）逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。按實時熒光定量TapMan 探針法試劑盒LightCycler 480 Probe Master （Roche， Indianapolis， IN）說明書，依次加入試劑：Probe Master，cDNA，Primer Forward/Reverse，Probe，ddH2O，混勻。95℃反應10 min，95℃反應15 s，60℃反應60 s，40個循環(huán)，PCR儀器自動收集熒光信息，獲取相關基因的Ct值，計算得出目的基因的相對含量。

三、蛋白免疫印跡法

根據(jù)何首烏不同濃度的處理設為實驗組，未加何首烏處理為對照組。收集各實驗組及對照組細胞，采用裂解液消化細胞獲得總蛋白裂解液樣品，各組蛋白BCA法定量后，進行SDS-PAGE;電泳完成后，將3張3M濾紙和1張PVDF膜，浸泡在甲醇去離子水中5 min后，與專用濾紙和纖維墊浸泡于1×轉(zhuǎn)膜緩沖液中;剝下凝膠，去掉濃縮膠部分，并把濾紙和PVDF膜裁成凝膠大小;按照三明治夾心法進行轉(zhuǎn)膜，300 mA轉(zhuǎn)膜2 h;立刻取出PVDF膜，然后用蛋白封閉液封閉1 h;采用待測蛋白的一抗室溫孵育PVDF膜3 h后，TBST洗膜3次，每次15 min;采用相對應的二抗孵育PVDF膜1 h后，TBST洗膜3次，每次15 min;于暗房，避光采用ECL顯色液顯色底片，并采用X線片壓片發(fā)光顯影定影而獲得數(shù)據(jù)片。

四、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 25.0進行統(tǒng)計學分析，正態(tài)分布計量資料以? 表示，比較采用成組t檢驗（雙側檢驗），P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、何首烏對LO2肝細胞脂肪沉積的促進作用

利用永生化肝細胞系LO2，采用FFA（1 mmol/L）處理24 h，建立脂肪肝沉積細胞模型，同時加入不同濃度的何首烏提取物進行處理（0、2.5、5、10 μg/mL），24 h后用油紅O染色以觀察何首烏對LO2細胞脂肪沉積的作用。結果顯示，與對照組相比，何首烏處理后的LO2細胞中，油紅O的染色量會隨著藥物濃度增加而增加（圖1），提示何首烏可促進LO2細胞中脂肪的沉積。

二、何首烏導致脂肪肝沉積細胞模型中Fxr及Fxr下游基因的mRNA表達情況

研究中收集2組何首烏提取物（0、5 μg/ml）

處理過的脂肪肝沉積LO2細胞模型（1 mmol/L FFA處理24 h）進行了mRNA芯片檢測，發(fā)現(xiàn)FXR通路的相關基因變化比較明顯，進而采用RT-PCR進行Fxr及其下游基因的驗證檢測。結果顯示，F(xiàn)xr的mRNA表達明顯下降，而FXR蛋白誘導促進的下游基因Bsep、Shp的表達相應下降，而其下游抑制基因膽固醇7α-羥化酶1（Cyp7a1）的表達則上升（圖2）。由此可見LO2細胞中何首烏誘導的脂質(zhì)積累，可能是通過抑制FXR信號通路相關基因的表達所致。

三、何首烏通過FXR通路的介導促進了LO2肝細胞的脂肪沉積

為了探索FXR通路在何首烏介導的LO2肝細胞的脂肪沉積作用，使用不同濃度何首烏提取物（2.5、5、10 μg/ml）與FFA共同處理LO2細胞24 h后，采用蛋白免疫印跡法檢測FXR及其下游通路相關蛋白的表達水平。結果顯示，經(jīng)何首烏處理后，F(xiàn)XR的蛋白水平明顯降低，蛋白激酶C（PKC）蛋白磷酸化水平明顯降低，而PKC的總蛋白表達水平無明顯改變，同時SHP的蛋白水平也明顯降低（圖3）。此結果提示何首烏能通過抑制FXR-PKC/SHP信號轉(zhuǎn)導通路，促進LO2肝細胞內(nèi)脂肪的沉積。

討論

近年來關于何首烏肝毒性報道頻出，給臨床安全性和合理用藥帶來挑戰(zhàn)。國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）不良反應監(jiān)測中心報告提示何首烏及其相關制劑的不良反應報告超過2萬份，主要為肝損害的不良反應。SFDA不良反應監(jiān)測中心監(jiān)測到的數(shù)據(jù)只反映了中藥肝毒性的一部分，在中醫(yī)處方、老百姓自行服用的情況下發(fā)生肝損傷更嚴重[11-15]。國外非常重視何首烏引起肝毒性，2012年9月美國國家醫(yī)學圖書館發(fā)布的LiverTox（Clinical and Research Information on Drug-induced Liver Injury）數(shù)據(jù)庫中收錄約600種具有肝損傷的西藥和中草藥，其中何首烏作為一個專題被收錄，數(shù)據(jù)庫專門收錄了何首烏及其制劑肝損傷的報道，其中何首烏導致肝內(nèi)膽汁淤積的病例數(shù)據(jù)最多見，其治療效果欠佳，是目前臨床上亟需解決的問題之一[11-14]。

FXR是核受體超家族成員[16-18]。FXR通過調(diào)控一系列膽汁酸相關基因的表達，在膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運和代謝中發(fā)揮了重要作用。FXR主要通過2條通路激活，其中第一條即在肝細胞內(nèi)激活，第二條通路在小腸上皮細胞激活[16-18]。膽汁酸本身可激活腸上皮細胞的FXR，F(xiàn)XR是成纖維細胞生長因子（FGF）19（在小鼠為FGF15）的上游轉(zhuǎn)錄因子，可啟動腸上皮細胞大量表達FGF19。腸腔內(nèi)FGF19釋放到循環(huán)血液中，通過門脈循環(huán)到達肝臟后，F(xiàn)GF19結合和激活肝FGF受體4并與b-Klotho組成受體復合物后進一步激活c-jun氨基末端激酶與PKC/SHP等信號轉(zhuǎn)導通路，來抑制CYP7A1等因子的合成，從而抑制膽汁酸合成，由此也構成了膽汁酸的負反饋調(diào)節(jié)通路[16-18]。

本研究團隊長期致力于FGF15/19信號軸介導藥物性肝損傷的臨床和基礎研究，發(fā)現(xiàn)FGF15具有促進小鼠肝細胞再生的作用，但其作用不依賴于膽汁酸。此外，本團隊也通過研究揭示了酒精性肝損傷的主要原因是腸道Fgf15缺失，并證明了Fgf15缺失后腸道的通透性增加，從而加重肝損傷[19-21]。

本研究從體外細胞試驗發(fā)現(xiàn)何首烏對LO2肝細胞脂肪沉積的促進作用，LO2細胞中何首烏誘導的脂質(zhì)積累，其機制可能通過抑制FXR信號通路相關基因的表達所致。何首烏能通過抑制FXR-PKC/SHP信號轉(zhuǎn)導通路，促進LO2肝細胞內(nèi)脂肪的沉積。因此，本研究提示何首烏可導致肝細胞內(nèi)FXR基因表達下調(diào)，F(xiàn)XR基因膽汁轉(zhuǎn)運信號通路受到抑制，進一步介導何首烏抑制膽汁轉(zhuǎn)運信號通路，促進肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。由此，揭示了何首烏導致藥物性膽汁淤積致病分子機制，為臨床上治療膽汁淤積所導致的肝損傷提供新的理論依據(jù)。

參 考 文 獻

[1] Navarro V J， Khan I， Bj?rnsson E， Seeff L B， Serrano J， Hoofnagle J H. Liver injury from herbal and dietary supplements. Hepatology，2017，65（1）：363-373.

[2] Kantor E D， Rehm C D， Haas J S， Chan A T， Giovannucci E L. Trends in prescription drug use among adults in the United States from 1999-2012. JAMA，2015，314（17）：1818-1831.

[3] Danan G， Teschke R. RUCAM in drug and herb induced liver injury： the update. Int J Mol Sci，2015，17（1）：14.

[4] Teka T， Wang L， Gao J， Mou J， Pan G， Yu H， Gao X， Han L. Polygonum multiflorum： recent updates on newly isolated compounds， potential hepatotoxic compounds and their mechanisms. J Ethnopharmacol，2021，271：113864.

[5] Liu Y， Wang W， Sun M， Ma B， Pang L， Du Y， Dong X， Yin X， Ni J. Polygonum multiflorum-induced liver injury： clinical characteristics， risk factors， material basis， action mechanism and current challenges. Front Pharmacol，2019，10：1467.

[6] Xue X， Quan Y， Gong L， Gong X， Li Y. A review of the processed Polygonum multiflorum （Thunb.） for hepatoprotection： clinical use， pharmacology and toxicology. J Ethnopharmacol，2020，261：113121.

[7] Dong Q， Li N， Li Q， Zhang C E， Feng W W， Li G Q， Li R Y， Tu C， Han X， Bai Z F， Zhang Y M， Niu M， Ma Z J， Xiao X H，

Wang J B. Screening for biomarkers of liver injury induced by Polygonum multiflorum： a targeted metabolomic study. Front Pharmacol，2015，6：217.

[8] Kumari A， Pal Pathak D， Asthana S. Bile acids mediated potential functional interaction between FXR and FATP5 in the regulation of lipid metabolism. Int J Biol Sci，2020，16（13）：2308-2322.

[9] Venetsanaki V， Karabouta Z， Polyzos S A. Farnesoid X nuclear receptor agonists for the treatment of nonalcoholic steatohepatitis. Eur J Pharmacol，2019，863：172661.

[10] Shin D J， Wang L. Bile acid-activated receptors： a review on FXR and other nuclear receptors. Handb Exp Pharmacol，2019，256：51-72.

[11] Zhang Y， Wang N， Zhang M， Diao T， Tang J， Dai M， Chen S， Lin G. Metabonomics study on Polygonum multiflorum induced liver toxicity in rats by GC-MS. Int J Clin Exp Med，2015，8（7）：10986-10992.

[12] Bounda G A， Feng Y U. Review of clinical studies of Polygonum multiflorum Thunb. and its isolated bioactive compounds. Pharmacognosy Res，2015，7（3）：225-236.

[13] Dong H， Slain D， Cheng J， Ma W， Liang W. Eighteen cases of liver injury following ingestion of Polygonum multiflorum. Complement Ther Med，2014，22（1）：70-74.

[14] Lei X， Chen J， Ren J， Li Y， Zhai J， Mu W， Zhang L， Zheng W， Tian G， Shang H. Liver damage associated with Polygonum multiflorum thunb.： a systematic review of case reports and case series. Evid Based Complement Alternat Med，2015，2015：459749.

[15] 盧俊竹，陳廣成，陳慧，劉思齊，詹俊. 藥物性肝損傷與慢性肝病急性加重相關性的臨床研究——附301例分析. 新醫(yī)學， 2020， 51（2）： 138-142.

[16] Zhu Y， Liu H， Zhang M， Guo G L. Fatty liver diseases， bile acids， and FXR. Acta Pharm Sin B，2016，6（5）：409-412.

[17] Miao J， Xiao Z， Kanamaluru D， Min G， Yau P M， Veenstra T D，

Ellis E， Strom S， Suino-Powell K， Xu H E， Kemper J K. Bile acid signaling pathways increase stability of Small Heterodimer Partner （SHP） by inhibiting ubiquitin-proteasomal degradation. Genes Dev，2009，23（8）：986-996.

[18] Li T， Chiang J Y. Bile acid signaling in metabolic disease and drug therapy. Pharmacol Rev，2014，66（4）：948-983.

[19] Zhang M， Kong B， Huang M X， Wan R X， Armstrong L E， Schumacher J D， Rizzolo D， Chow M D， Lee Y H， Guo G L.

FXR deletion in hepatocytes does not affect the severity of alcoholic liver disease in mice. Dig Liver Dis，2018，50（10）：1068-1075.

[20] Kong B， Zhang M， Huang M， Rizzolo D， Armstrong L E， Schumacher J D， Chow M D， Lee Y H， Guo G L. FXR deficiency alters bile acid pool composition and exacerbates chronic alcohol induced liver injury. Dig Liver Dis，2019，51（4）：570-576.

[21] Kong B， Sun R， Huang M， Chow M D， Zhong X B， Xie W， Lee Y H， Guo G L. Fibroblast growth factor 15-dependent and bile acid-independent promotion of liver regeneration in mice. Hepatology，2018，68（5）：1961-1976.

（收稿日期：2021-06-06）

（本文編輯：楊江瑜）