SV40T基因?qū)d羊子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞體外增殖的影響

汪林麗，艾 越，王夢瑤，張效生，連正興，韓紅兵*

（1.禽畜遺傳改良北京市重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，北京 100193；2.動物育種國家工程實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，北京 100193；3.農(nóng)業(yè)與農(nóng)村部動物遺傳育種與繁育重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，北京 100193；4.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300112）

子宮是胚胎附植、生長、發(fā)育的搖籃。在行使這些功能的過程中，子宮內(nèi)膜扮演著重要的角色。胚胎附植是成功妊娠的關(guān)鍵步驟，人成功建立妊娠的概率大約只有30%[1]，其中植入異常約占75%[2]，是妊娠失敗的主要原因[3]。對于經(jīng)濟動物來說，要減少胚胎丟失，提高繁殖力，必須要了解子宮內(nèi)膜生長分化、激素分泌及胚胎附植期間的母胎對話等過程的分子機制。然而在綿羊中，原代的EECs 和ESCs 只能傳數(shù)代便衰老[4]，無法進行大規(guī)模實驗以及基因編輯等操作，給研究帶來了阻礙，因此亟需建立體外可連續(xù)傳代的細胞株以用于后續(xù)相關(guān)實驗。

細胞衰老是指細胞被阻滯在某一細胞周期中，同時伴有細胞形態(tài)、代謝、基因表達的改變。細胞周期的阻滯主要受2 個相互關(guān)聯(lián)的途徑控制：p53/p21 和p16/Rb途徑[5-6]。p53/p21 和p16/Rb 途徑的激活導致Rb 激活，從而使細胞周期阻滯，并最終導致細胞衰老[7-8]。因此可以通過靶向這些途徑的關(guān)鍵基因減緩細胞衰老，甚至達到永生化。

猿猴病毒SV40 于1960 年發(fā)現(xiàn)，屬真核細胞病毒，在該病毒中，較大的非編碼區(qū)控制著基因組早期和晚期轉(zhuǎn)錄區(qū)的表達，在交替剪接后形成大的T 抗原蛋白和小的T 抗原蛋白[9]。SV40T 蛋白可以與p53、pRb 結(jié)合來抑制p53/p21 和p16/Rb 途徑的激活以延長細胞周期并促進細胞永生。迄今為止，已經(jīng)通過病毒感染、電穿孔、脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染方法介導SV40T基因產(chǎn)生了一系列永生化細胞系[10-12]。本研究旨在通過SV40T基因建立可供進行胚胎附植、子宮發(fā)育等研究的綿羊EECs 細胞株和ESCs 細胞株。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 取綿羊子宮，用PBS 洗2 遍，用70%的酒精浸泡2 min 后，浸泡在PBS（含200 IU/mL 青霉素和200 μg/mL 鏈霉素）中，并放入冰盒中冷藏保存，盡快進行細胞分離。

1.2 主要試劑 膠原酶III 購自Worthington 公司；胰酶、中性蛋白酶II、DNase I購自Sigma公司；pGMLVSV40T 慢病毒載體購自吉滿生物科技有限公司；RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司；基因組提取試劑盒購自美基生物科技有限公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國NEB 公司；SYBR Green 核酸染料購自Qiagen 公司；DMEM/F12、磷酸緩沖液（PBS）、胎牛血清（FBS）、雙抗、0.25% 胰酶（含EDTA）均購自Gibco 公司；pan Cytokeratin 抗體和SV40TAg 抗體均購自Santa Cruz 公司；Vimentin 抗體購自Abcam公司；熒光二抗購自Invitrogen 公司；引物均在上海生物工程有限公司合成。

1.3 綿羊EECs 和ESCs 的分離與鑒定 D-PBS 沖洗子宮組織3 遍，剪開子宮，露出子宮腔，將其修剪成合適大小，放入6 cm 培養(yǎng)皿，隨即加入5 mL 含有胰酶（2.5 mg/mL）和中性蛋白酶 II（4.8 mg/mL）的PBS，37℃下消化1 h。去酶，加入適量PBS，室溫下孵育15 min。用蓋玻片輕刮子宮腔面，直至上皮層明顯變少。將液體離心（500 g，10 min）回收EECs 并將其重懸于完全培養(yǎng)基（DMEM/F12，pH 7.4，含10%FBS 和1% 雙抗）。將剩余的組織剪碎，放入10 mL 含Dnase I（200 U/mL）和膠原酶III（1 mg/mL）的PBS，37℃消化1 h，期間顛倒混勻。將消化液用70 μm 的篩網(wǎng)過濾，濾液離心（500 g，10 min）回收ESCs 并將其重懸于完全培養(yǎng)基（DMEM/F12，pH 7.4，含10%FBS 和1%雙抗）。

將細胞鋪至8 孔載玻片上，待細胞匯合至70% 左右，棄培養(yǎng)基，每孔加入500 μL PBS，漂洗3 次，加入500 μL 4%多聚甲醛，室溫下固定20 min，加入500 μL PBS，漂洗3 次。每孔加入500 μL 0.5% Triton X-100，室溫孵育20 min，加入500 μL PBS，漂洗3 次。加入500 μL 封閉液，室溫下封閉1 h，加入500 μL 稀釋一抗（EECs 加Cytokeratin 抗 體，ESCs 加Vimentin 抗體，均1:300 稀釋），4℃過夜。次日取出8 孔載玻片，每孔加入500 μL PBS，漂洗3 次，加入500 μL 稀釋熒光二抗（1:300 稀釋），室溫孵育1 h。吸出熒光二抗，加入500 μL PBS，漂洗3 次。加入DAPI 染色液，室溫孵育20 min，吸出DAPI 染色液，漂洗3 次，加入10～20 μL 封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.4SV40T慢病毒載體的感染及單克隆細胞株篩選 細胞鋪板，待細胞貼壁后，取出慢病毒冰浴融化，用完全培養(yǎng)基將其稀釋成所需濃度（MOI 1:10 或MOI 1:50），將慢病毒載體加入培養(yǎng)液中。48 h 后，棄含慢病毒的培養(yǎng)基，消化細胞并將細胞以極低濃度鋪板到大皿中以篩選單克隆細胞株。將篩選的單克隆細胞株通過免疫熒光檢測SV40T 蛋白的表達，將SV40T 陽性的單克隆細胞株（記為SV40T-EECs 或SV40T-ESCs）用于后續(xù)實驗。

1.5 RNA 提取和RT-PCR 通過RNA 提取試劑盒提取4種細胞（SV40T-EECs、EECs、SV40T-ESCs 和ESCs）的RNA，通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA。設(shè)計SV40T和GAPDH 引物（表1）用于后續(xù)RT-PCR。RT-PCR 體系為cDNA 模板1 μL（約50 ng），10 μmol/L 上下游引物 各1 μL，ddH2O 22 μL，EasyTaq Mix 25 μL。PCR 反 應(yīng)條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，34 個循環(huán)；72℃ 7 min。然后配制20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 SV40T 引物及GAPDH 引物

1.6 血清依賴性檢測 胰酶消化并收集SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代），調(diào)整細胞密度為5×104個/mL 接種96 孔板，每孔200 μL。培養(yǎng)24 h 后，將原培養(yǎng)液更換為FBS 為20%、10%、5%、0%的培養(yǎng)基，每種濃度設(shè)置4 個重復。繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，去上清，加入90 μL 新鮮培養(yǎng)液和10 μL MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄上清液，加入110 μL DMSO 溶液，再放置搖床避光低速震蕩10 min。酶標儀測定490 nm 處的吸光值。

1.7 細胞生長曲線制作 通過細胞計數(shù)將SV40T-EECs和SV40T-ESCs 以每孔104個細胞的密度均勻鋪到24孔板中，培養(yǎng)12 h 后開始計數(shù)，每種細胞每天計3 孔，每孔計3 次，共計7 d。SPSS 軟件擬合生長曲線：細胞增殖是二分裂生長，因此選用y=a·2b·t模型（a、b 為常數(shù)，t 為細胞培養(yǎng)天數(shù)），但SPSS 軟件曲線擬合功能選項中無此模型，只有y=a·eb·t模型，因此變換y=a·2b·t=a·eln2·b·t=a·eb·k（k=ln2·t）。輸入培養(yǎng)天數(shù)和細胞數(shù)量，擬合得到常數(shù)a、b 值，最終得到細胞生長曲線公式。細胞倍增時間的計算：Td=Δ t·24h·lg2/（lgNt-lgN0）=24h/b（Td為倍增時間，Δ t 為計數(shù)間隔天數(shù)，Nt為對數(shù)生長期任一點的理論觀察值，N0為對數(shù)生長期理論初始值）[13]。

1.8 標準品制備、基因組提取以及拷貝數(shù)檢測 擴增出SV40T基因部分片段，回收后連接到pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，并提取質(zhì)粒。用Qubit 4 熒光定量儀測量其濃度，制作標準曲線。標準曲線模板添加量計算方法：質(zhì)粒為pMD19-T 載體，長度為2 692 bp，SV40TPCR 產(chǎn)物長度為328 bp。MW（平均分子量）=（2 692+328）bp×660 daltons/bp=1.99×106daltons，即1 mol=1.99×106g。1 mol=6.02×1023copies，計算得1 copy=3.31×10-9ng。按照該換算公式得到拷貝數(shù)為102、103、104、105、106、107、108時對應(yīng)的標準曲線模板添加量（表2）。提取SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 條件下各3 個細胞克隆基因組，并通過Qubit 4 熒光定量儀測量其濃度后進行qPCR。qPCR 體系為：模板8 ng，上下游引物（10 μmol/L）各1.4 μL，SYBR Mix（Qiagen）10 μL，ddH2O 補 齊 至20 μL。qPCR 反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s。

表2 標準曲線模板添加量

1.9 統(tǒng)計分析 本研究通過SPSS 21.0 軟件對血清依賴性檢測采用單因素方差分析，對拷貝數(shù)檢測采用獨立t檢驗。P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，P＞0.05 為差異不顯著；生長曲線、血清依賴性檢測結(jié)果、標準曲線均用GraphPad 7.0 軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 原代綿羊EECs 和ESCs 的分離與鑒定 通過酶促分離獲得的綿羊EECs 和ESCs，在光學顯微鏡下，EECs 呈鋪路石狀，簇狀生長；ESCs 呈梭形，分散生長，符合哺乳類動物子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞的形態(tài)特征（圖1）。

圖1 綿羊EECs 和EECs 的分離（100×）

為了進一步對這2 種細胞進行鑒定，進行了特異性標記蛋白（EECs-Cytokeratin，ESCs-Vimentin）免疫熒光染色，結(jié)果顯示這2 種細胞均表達其標記蛋白（圖2），這些結(jié)果證明成功分離了綿羊的原代EECs 和ESCs。

圖2 綿羊ESCs 和EECs 的特異性標記蛋白免疫熒光鑒定（100×）

2.2 SV40T 慢病毒載體感染原代綿羊EECs 和ESCs為了進一步得到可連續(xù)傳代的EECs 和ESCs，通過慢病毒pGMLV-SV40T 以MOI 1:10 和MOI 1:50 感染原代EECs 和ESCs 并進行單克隆細胞株篩選。得到的單克隆細胞株進行SV40T 免疫熒光染色，結(jié)果顯示SV40T 蛋白正常表達并定位在核內(nèi)，未感染的細胞呈陰性，并且無論是MOI 1:10 還是MOI 1:50，SV40T慢病毒載體感染效率幾乎達100%（圖3 和圖4）。

圖3 綿羊EECs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 下的SV40T 免疫熒光結(jié)果（100×）

圖4 綿羊ESCs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 下的SV40T 免疫熒光結(jié)果（100×）

2.3 長期增殖的SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 細胞特性將SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 分別連續(xù)傳代到約50代和約30 代后，在光學顯微鏡下，形態(tài)均與原代細胞相似，即EECs 呈鋪路石狀，簇狀生長，ESCs 呈梭形，分散生長（圖5）。

圖5 SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 光學圖片（100×）

對這2 種細胞SV40T基因的mRNA 表達進行檢測，結(jié)果顯示，SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代）均表達SV40TmRNA（圖6）。

圖6 SV40T-EECs（P50）和SV40T-ESCs（P30）SV40T 的RT-PCR

為了確定經(jīng)過長期培養(yǎng)的SV40T-EECs 和SV40TESCs 是否保持上皮細胞特性和基質(zhì)細胞特性，通過對SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 的特異性標記蛋白（EECs-Cytokeratin，ESCs-Vimentin）免疫熒光染色，結(jié)果顯示，SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代）仍表達細胞角蛋白和基質(zhì)蛋白（圖7），說明經(jīng)過長時間的傳代，SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 仍保留了其上皮特性和基質(zhì)細胞特性。

圖7 綿羊SV40T-ESCs 和SV40T-EECs 的特異性標記蛋白免疫熒光結(jié)果

為了確定SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代）是否具有癌細胞的特性，對這2 種細胞進行了血清依賴性檢測，結(jié)果顯示，5%FBS、10%FBS 和20%FBS 與0%FBS 相比，均可明顯提高SV40T-EECs和SV40T-ESCs 的 分 裂 增 生；10%FBS 與5%FBS 相比，促進SV40T-ESCs 分裂增生的效果差異顯著，促進SV40T-EECs 分裂增生的效果差異不顯著；20%FBS 與10%FBS 相比，促進2 種細胞增殖效果差異顯著，與5%FBS 相比，促進細胞增殖效果差異極顯著（圖8）。這提示對于SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代），血清是促進其生長的重要因素，即SV40TEECs 和SV40T-ESCs 具有血清依賴性。

圖8 SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 血清依賴性檢測

2.4 生長曲線和拷貝數(shù)檢測 接下來進一步對SV40TEECs 和SV40T-ESCs 進行細胞生長曲線的繪制（圖9）。取其中的對數(shù)生長期（3 d、4 d、5 d）通過SPSS 軟件進行生長曲線擬合，計算得到SV40T-EECs 和SV40TESCs 生 長 曲 線 公 式 為y=0.286×20.847x（R2=0.909）和y=0.462×20.886x（R2=0.954），由此計算得到倍增時間分別為28.3 h 和27.1 h。

圖9 SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 的細胞生長曲線

接下來進一步進行了SV40T基因的拷貝數(shù)檢測，通過標準曲線，獲得回歸方程式為：回歸方程式y(tǒng)=-0.2957x+11.641，軟件分析得出直線回歸相關(guān)系數(shù)R2=0.995 4，所有標準品的Ct 值基本在一條直線上，沒有任何一個標準品出現(xiàn)大的偏差，表明標準品制備成功（圖10）。通過標準曲線計算得到SV40T-EECs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 條件下的拷貝數(shù)為5.12、1.20、3.14和3.07、3.69、12.08（表3），通過t檢驗，SV40T-EECs在MOI 1:10 和MOI 1:50 的拷貝數(shù)差異不顯著（P=0.373）；SV40T-ESCs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 條件下的拷貝數(shù)為3.80、2.31、5.37 和3.95、10.68、3.22，通過t檢驗，SV40T-ESCs 在MOI 1:10 和MOI 1:50 的拷貝數(shù)差異不顯著（P=0.449）（表4）。

表3 綿羊SV40T-EECs（8 ng）SV40T 拷貝數(shù)

表4 綿羊SV40T-ESCs（8 ng）SV40T 拷貝數(shù)

圖10 實時定量 PCR 標準曲線

3 討 論

Narayanan 等[14]用SV40 基因建立了牛子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系；Samalecos 等[15]用端粒酶基因建立了人的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系；Bai 等[16]通過HPV E6 和E7基因和hTERT 基因建立了牛的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞系，但對于綿羊在國內(nèi)還沒有子宮相關(guān)的細胞系，因此本研究建立的這2 種細胞株對于研究綿羊及其他反芻動物的子宮內(nèi)膜功能有重要意義。本實驗中首先分離出了綿羊EECs 和ESCs，并且原代EECs 呈鋪路石狀，呈簇狀生長；原代ESCs 呈梭形，分散生長，符合哺乳類子宮內(nèi)膜上皮細胞和基質(zhì)細胞的特征。后來通過細胞角蛋白和波形蛋白免疫熒光染色鑒定證明了分離的EECs 和ESCs 都表達其標記蛋白，表明了分離的細胞的正確性。在得到這2 種原代細胞后，為了能獲得連續(xù)傳代的細胞株，本研究進行了慢病毒pGMLV-SV40T 的感染。實驗結(jié)果表明無論是MOI 1:10 還是MOI 1:50，SV40T基因的整合率接近100%，說明慢病毒對EECs 和ESCs 具有較高的感染率和基因整合能力。

在感染了慢病毒pGMLV-SV40T 后，SV40T-EECs能夠傳代50 代以上，SV40T-ESCs 能夠傳代30 代以上，由于原代EECs 只能傳到3 代左右即退化凋亡、空泡化嚴重[17]，ESCs 也只能傳到8～10 代[4]，證明SV40T基因確實有效地延長了細胞傳代次數(shù)。另外檢測了SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 在經(jīng)歷長期傳代后的形態(tài)學特征、SV40T 的RNA 表達、特異性標記蛋白染色、血清依賴性檢測、生長曲線。SV40T-EECs（約50 代）和SV40T-ESCs（約30 代）從形態(tài)上看與原代細胞相似，并且在RNA 水平上仍表達SV40T，另外對這種細胞進行特異性蛋白染色均為陽性，證明連續(xù)傳代后SV40TEECs 和SV40T-ESCs 仍保留其上皮細胞特性和基質(zhì)細胞特性。由于在感染了SV40T 慢病毒載體后，細胞快速增長，因此進行了血清依賴性檢測，以確定這2 種細胞是否有癌化的可能，結(jié)果顯示這2 種細胞均具有較強的血清依賴性，與惡性增殖的癌細胞不同。這些結(jié)果證明成功地建立了EECs 和ESCs 細胞株。

從生長曲線可以看出，SV40T-ESCs 總體而言比SV40T-EECs 細胞增長得更快，這也符合成纖維細胞類型的細胞比上皮類細胞生長得更快的一個普遍特點。進一步檢測了SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 這2 種細胞的拷貝數(shù)，在MOI 1:10 和MOI 1:50 下，SV40T拷貝數(shù)差異不顯著，說明在MOI 1:10 和MOI 1:50 下，SV40T基因在這2 種細胞中的整合并沒有顯著性差異。

在本研究中通過SV40T 慢病毒載體感染綿羊EECs和ESCs，能夠讓原代EECs 和ESCs 傳到50 代和30 代以上，SV40T-EECs 傳了8 個月以上，SV40T-ESCs 傳了3 個月以上，成功地延長了綿羊EECs 和ESCs 的體外增殖次數(shù)，給綿羊及反芻動物子宮方面的相關(guān)研究提供了材料，解決了因細胞傳代次數(shù)不夠而導致不能進行規(guī)?；毎麑嶒炓约盎蚓庉嫷炔僮鞯膯栴}，能夠推動綿羊及反芻類經(jīng)濟動物胚胎附植以及子宮等方面相關(guān)研究進展。

4 結(jié) 論

本實驗成功分離了原代的綿羊EECs 和ESCs，通過SV40T 慢病毒載體感染原代綿羊EECs 和ESCs，SV40T-EECs 和SV40T-ESCs 能夠分別傳到50 代和30代以上，成功地延長了綿羊EECs 和ESCs 的體外增殖次數(shù)，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。