孫建平，劉雅輝，馬 佳，趙子婧，陸 垚，何宗均，呂晶晶

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 濱海農(nóng)業(yè)研究所，河北唐山 063299；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，石家莊 050051；3.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300000)

水稻秸稈含有大量有機(jī)質(zhì)及植物生長(zhǎng)所必須的氮、磷、鉀及其他微量元素，是農(nóng)田養(yǎng)分循環(huán)利用的基礎(chǔ)[1-2]。冀東濱海地區(qū)水稻種植面積約為6.67萬hm2，秸稈產(chǎn)生量約為65萬～70萬t，由于缺乏秸稈高效利用技術(shù)，大多數(shù)被直接焚燒，不僅造成大量生物質(zhì)資源的浪費(fèi)和大氣污染，而且對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的破壞[3]。近年來，當(dāng)?shù)卣罅μ岢斩捴苯舆€田，但由于北方秋冬季節(jié)氣溫偏低且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，秸稈粉碎后在田間自然狀態(tài)下腐熟慢，不利于田間耕作和農(nóng)藝操作[4-6]，特別是自然狀態(tài)下腐熟時(shí)恰逢水稻緩秧分蘗期，土壤中大量CH4、N2O、CO2和有機(jī)酸產(chǎn)生，嚴(yán)重影響水稻秧苗根系的生長(zhǎng)[7]，秸稈降解慢、不充分是制約該區(qū)域秸稈還田的關(guān)鍵因素，限制了北方水稻秸稈還田的大面積推廣應(yīng)用。

目前，添加腐熟劑是解決秸稈快速腐解的主要措施[8-9]。研究表明腐熟劑促進(jìn)秸稈分解[10]，減少溫室氣體排放[11]，有利于改良土壤理化性狀[12]和微生物群落活性與多樣性的提高[13-14]，增加產(chǎn)量[12]，并且還可以固定鉻[15]。但秸稈還田條件下腐熟劑與土壤質(zhì)地間響應(yīng)不同[16]，水稻田干濕交替，需要厭氧和好氧微生物群落的交替作用,市面上的大多數(shù)產(chǎn)品以好氧微生物居多，加上低溫環(huán)境下微生物難以生長(zhǎng)，活性降低，田間效果不理想，因此，亟需尋求在低溫條件下可以啟動(dòng)的微生物產(chǎn)品，用于北方水稻秸稈直接還田。

低溫復(fù)合菌系因其可以實(shí)現(xiàn)腐解的快速啟動(dòng)，并產(chǎn)生大量有益微生物，引起了各類學(xué)者的廣泛關(guān)注，目前較多應(yīng)用于玉米秸稈及牛羊雞豬糞等多種廢棄資源的堆肥中[17-19]，而在北方水稻秸稈直接還田應(yīng)用中研究很少。農(nóng)田秸稈綜合利用課題組前期從冀東濱海稻區(qū)水稻秸稈還田土壤中通過低溫脅迫、富集篩選、拮抗試驗(yàn)、組合構(gòu)建了由白蟻菌、長(zhǎng)柄木霉、芬萊氏鏈霉菌、葡萄球菌等組成的低溫復(fù)合菌系HT20，并初步應(yīng)用于冀東稻區(qū)水稻秸稈還田，實(shí)現(xiàn)了低溫環(huán)境下秸稈的快速腐解。為了更好地發(fā)揮其作用，本研究以低溫復(fù)合菌系HT20為研究對(duì)象，采用響應(yīng)曲面法(response surface method，RSM)，通過室內(nèi)培養(yǎng)和大田微區(qū)試驗(yàn)，研究HT20添加量、尿素添加量、溫度和含水率及其互作對(duì)秸稈腐解率的影響，預(yù)測(cè)HT20作用下秸稈的最佳腐解條件，并與市面常用的4種秸稈腐熟劑進(jìn)行比較，分析其對(duì)秸桿的腐解程度和土壤的肥力影響，闡釋其對(duì)水稻秸稈的腐解效果和適應(yīng)性，為低溫復(fù)合菌系HT20應(yīng)用水稻秸稈還田提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與概況

研究區(qū)域位于河北省唐山市曹妃甸區(qū)濱海現(xiàn)代農(nóng)業(yè)綜合試驗(yàn)站(39°16′31″N，118°27′5.14″E)，距渤海約4.5 km，海拔2.5～4.3 m，該地區(qū)屬于東部季風(fēng)區(qū)暖溫帶半濕潤(rùn)季節(jié)型近海大陸性氣候，具有光照充足，降水集中，雨熱同期，四季寒暖干濕分明等氣候特征[20]。2010—2019年月平均氣溫12.3 ℃，蒸發(fā)量平均為1 969 mm，冬季盛行偏西北風(fēng)，春、夏季盛行偏南和東南風(fēng)，秋季多偏西南風(fēng)。年降水量為635.9 mm，主要集中在7—8月份。

1.2 試驗(yàn)材料

盆栽試驗(yàn)的土壤來源于長(zhǎng)期種植水稻的土壤，土壤類型為鹽漬型濱海粘壤土，0～20 cm耕層土壤理化性質(zhì)：電導(dǎo)率為602 μS·cm-3，pH為8.16，有機(jī)質(zhì)5.45 g·kg-1，速效磷24.35 mg·kg-1，速效鉀102.71 mg·kg-1，速效氮為30.56 mg·kg-1，體積質(zhì)量為1.45 g·cm-3。還田秸稈選用前茬水稻所產(chǎn)生的秸稈，水稻秸稈的養(yǎng)分含量：C/N 67，全氮為0.68%，全磷為 0.13%，全鉀為1.34%，選用河北省農(nóng)林科學(xué)院濱海農(nóng)業(yè)研究所自研水稻品種‘墾育979’。供試腐熟劑分別為低溫復(fù)合菌系HT20(自研)；農(nóng)富康(農(nóng)富康生物科技有限公司)；還田寶(北京百豐天下生物科技有限公司)；春雨(蘇州農(nóng)旺生物科技有限公司)；啟明(湖北啟明生物工程有限 公司)。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

1.3.1 低溫復(fù)合菌系HT20高效腐解條件優(yōu)化 以溫度、含水量、HT20添加量、尿素添加量為試驗(yàn)因素，各因素設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)水平，采用Design-expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken方法進(jìn)行設(shè)計(jì)(表1)，其中有5個(gè)重復(fù)中心點(diǎn)，共29個(gè)處理，各處理均設(shè)置5個(gè)重復(fù)。在已滅菌的250 mL錐形瓶中加入秸稈5.000 g，然后按照設(shè)計(jì)加入相應(yīng)量的HT20和尿素，采用無菌水調(diào)節(jié)含水率，封口膜封口，置于相應(yīng)溫度的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。30 d后，取出錐形瓶測(cè)定秸稈腐解率。

表1 試驗(yàn)因素與試驗(yàn)水平

1.3.2 不同腐熟劑對(duì)水稻秸稈還田土壤和秸稈腐解效果 設(shè)置未施用腐熟劑秸稈直接還田為對(duì)照(CK)，施用低溫復(fù)合菌系HT20秸稈還田(低溫復(fù)合菌系)、施用農(nóng)富康秸稈直接還田(農(nóng)富康)、施用還田寶秸稈直接還田(還田寶)、施用春雨秸稈直接還田(春雨)、施用啟明秸稈直接還田(啟明)，共6個(gè)試驗(yàn)處理。建立大田微區(qū)，每個(gè)微區(qū)規(guī)格為600 cm×200 cm×60 cm，其中擺滿塑料桶(規(guī)格56 cm×58 cm)，桶四周及底部扎孔增加土壤的透氣與水分的流出，桶與桶之間的縫隙用土填滿，每個(gè)處理安排在一個(gè)微區(qū)中，3個(gè)微區(qū)為3次重復(fù)，防止微區(qū)之間相互污染，降低試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)采用尼龍網(wǎng)袋填埋法，尼龍網(wǎng)袋規(guī)格為長(zhǎng)×寬=50 cm×45 cm，孔徑為0.178 mm，以隔離土壤。供試稻草剪切至約5 cm放入尼龍網(wǎng)袋中，用尼龍線綁好袋口，水稻秸稈還田量按10 500 kg·hm-2算，每袋裝稻草262 g，于2019年11月23日施用腐熟劑處理每袋加入1 g與秸稈進(jìn)行混勻后埋入塑料桶中土下15～20 cm處，未施用腐熟劑直接埋入。于2020年5月中旬移栽水稻秧苗，插秧密度按照30 cm×16 cm，每穴5株。各處理全生育期田間管理與常規(guī)田間管理措施。

各處理于秧苗移栽后30 d、90 d和150 d時(shí)取5袋樣品，清理干凈尼龍網(wǎng)袋上的土粒，烘干，測(cè)定秸稈的殘留量，計(jì)算秸稈腐解率。土壤樣品在拔去水稻根后，自主根系位置自上而下(從表面至塑料桶底，約20～25 cm深)，用土鉆(鉆頭直徑為3.8 cm)，取下約500 g土壤樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室，200 g新鮮的土樣用于測(cè)定微生物，300 g土樣在通風(fēng)處自然風(fēng)干，去根系雜質(zhì)，過篩，用于測(cè)定土壤的化學(xué)性質(zhì)。

1.4 測(cè)定方法

土壤微生物采用經(jīng)典的稀釋平板法[21]，其中細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；真菌采用PDA培養(yǎng)基；放線菌采用改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基、有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定；速效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定；速效鉀采用原子吸收分光光度計(jì)法測(cè)定[22]。

秸稈腐解速率=(原始秸稈質(zhì)量-剩余秸稈質(zhì)量)/t

秸稈殘余率=剩余秸稈干質(zhì)量/原始秸稈干質(zhì)量×100%

為進(jìn)一步比較不同處理秸稈腐解動(dòng)態(tài)，本研究用修正后的Olson指數(shù)衰減模型來擬合[23]，其形式為：y=x/x0=e-kt

公式中，y為秸稈腐解殘余率(%)；x0、x分別為腐解開始時(shí)和腐解后t時(shí)的秸稈量(kg)；k為腐解速率常數(shù)，k越大，分解速度越快。

根據(jù)公式y(tǒng)=x/x0=e-kt中的k來計(jì)算秸稈分解50%(T50)和95%(T95)所需的時(shí)間(d)，計(jì)算公式為：T50=ln0.5/(-k)，T95=ln0.05/(-k)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及回歸方程方差分析，采用 Excel 2017進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的整理與作圖；采用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)比較不同處理間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸模型的建立

對(duì)影響秸稈腐解率的4個(gè)關(guān)鍵因素進(jìn)行試驗(yàn)，利用Design-Expert軟件中Box-Behnken 設(shè)計(jì)了29組試驗(yàn)(表2)，其中有5個(gè)重復(fù)中心點(diǎn)，結(jié)果顯示腐解率為7.69%～62.27%。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合獲得腐解率的二次多項(xiàng)式回歸模擬方程為：R=-25.872 35+0.479 81A+ 0.863 86B+16.344C-63.606 67D+ 0.015 573AB-0.085 333AC+17.766 67AD+0.06BC+1.422BD+5.5CD+0.000 752 593A2-0.006 432 27B2-17.000 67C2-1 696.066 67D2。式中，R為秸稈腐解率(%)，A為溫度(℃)，B為含水率(%)，C為尿素添加量(mg)，D為HT20添加量(g)。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)的不同試驗(yàn)處理及其響應(yīng)值

對(duì)秸稈腐解率的模擬方程求極值得知，當(dāng)溫度為5 ℃，含水率為80.76%，HT20添加量為 0.04 g，尿素添加量為0.6 mg時(shí)，秸稈的腐解率可達(dá)到22.6%；當(dāng)溫度為10.86 ℃，含水率為90%，HT20添加量為0.080 g，尿素添加量為 0.600 mg時(shí)，秸稈的腐解率可達(dá)到36.7%；當(dāng)溫度 20 ℃，含水率為88.59%，HT20添加量為 0.080 g，尿素添加量為0.300 mg時(shí)，秸稈的腐解率可達(dá)到64.09%。表明低溫復(fù)合菌系HT20在 5～20 ℃可以腐解秸稈。

2.2 回歸模型的方差分析和方程回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)腐解率的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析(表3)，模型的P值小于 0.000 1，模型極顯著。模型方程失擬項(xiàng)P值為 0.286 3，差異不顯著。說明秸稈腐解率與溫度、含水率、尿素添加量、HT20添加量之間具有高度的相關(guān)性(R2=0.955 1)，校正相關(guān)系數(shù)AdjR2為 0.910 1，說明腐解率的模擬模型與實(shí)際情況高度吻合。

從回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)(表3)可以看出，4因素的顯著性概率為溫度≈含水率

表3 回歸模型的方差分析和回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)

2.3 響應(yīng)曲面結(jié)果分析

由溫度、含水率、HT20添加量和尿素添加量4因素交互作用對(duì)秸稈腐解率影響的三維空間響應(yīng)曲面圖(圖1)可以形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。從溫度和含水率交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-A)，當(dāng)HT20添加量為0.050 g，尿素添加量為0.500 mg，若含水率固定時(shí)，腐解率隨溫度升高而增加，若溫度固定時(shí)，腐解率隨含水率增加而增加，變化幅度大。通過顏色可以看出溫度與含水率交互作用對(duì)秸稈腐解率影響顯著。

溫度和HT20添加量交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-B)，當(dāng)含水率65%，尿素添加量0.500 mg時(shí)，若HT20添加量固定時(shí)，腐解率隨溫度升高呈增大的趨勢(shì)，且變化幅度明顯；若溫度固定時(shí)，腐解率隨HT20添加量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，并出現(xiàn)了拐點(diǎn)。通過顏色可以看出溫度與HT20添加量交互作用對(duì)秸稈腐解率影響顯著。

HT20添加量和尿素添加量交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-C)，當(dāng)溫度 12.5 ℃，含水率65%，若HT20添加量固定時(shí)，腐解率隨尿素添加量呈先增加后降低的趨勢(shì)，變化比較緩慢，若尿素添加量固定時(shí)，腐解率隨HT20添加量呈先增加后降低的趨勢(shì)，變化比較緩慢，并出現(xiàn)了拐點(diǎn)。HT20添加量和尿素添加量交互作用對(duì)秸稈腐解率影響不顯著。

HT20添加量和含水率交互作用影響秸稈腐解率的曲面圖可知(圖1-D)，當(dāng)溫度12.5 ℃，尿素添加量為0.500 mg，若含水率固定時(shí)，腐解率隨HT20添加量呈先增加后降低的趨勢(shì)，并出現(xiàn)了拐點(diǎn)；若HT20添加量固定時(shí)，腐解率隨含水率的增加而增加，變化幅度較明顯。HT20添加量與含水率交互作用對(duì)秸稈腐解率影響不顯著。

2.4 HT20對(duì)冀東稻區(qū)還田秸稈腐解效果的影響

由圖2-A可知，秸稈腐解速率隨時(shí)間的變化呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，在秧苗移栽30 d，低溫復(fù)合菌系HT20增加秸稈的腐解速率28.31%～81.46%；在秧苗移栽90 d，低溫復(fù)合菌系HT20增加秸稈的腐解速率20.10%～35.11%；在秧苗移栽150 d，低溫復(fù)合菌系HT20增加秸稈的腐解速率31.68%～53.61%。由圖2-B可知，與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，秸稈分解50%所需時(shí)間提前17.62～42.44 d，秸稈分解95%所需時(shí)間提前50.12～183.41 d，表明HT 20可以加快冀東稻區(qū)還田秸稈的腐解速度。

2.5 HT20對(duì)水稻秸稈還田土壤的影響

通過對(duì)秧苗移栽30 d和150 d的土壤進(jìn)行速效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)、細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量的測(cè)定(圖3)，采用雷達(dá)圖對(duì)多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行數(shù)值分析，面積越大的處理，就表示指標(biāo)值越好。結(jié)果顯示，低溫復(fù)合菌系HT20在5種腐熟劑中效果是較好的。與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，低溫復(fù)合菌系HT20增加了速效磷5.44%～71.49%、速效鉀19.62%～56.23%、有機(jī)質(zhì) 6.86%～57.27%、細(xì)菌21.29%～76.14%、真菌 1.57%～64.49%、放線菌15.15%～76.14%，表明冀東稻區(qū)水稻秸稈還田配施低溫復(fù)合菌系HT20可以增加土壤的養(yǎng)分含量和微生物數(shù)量。

3 討論與結(jié)論

秸稈還田是當(dāng)今世界上普遍重視的一項(xiàng)培肥地力的增產(chǎn)措施，在杜絕秸稈焚燒所造成的大氣污染的同時(shí)還有增肥增產(chǎn)作用[24-26]。秸稈還田的效果和秸稈的腐爛速度有直接關(guān)系。秸稈腐爛越快對(duì)土地的效果越好，而秸稈腐爛的速度除了與自身?xiàng)l件有關(guān)以外，還與土壤質(zhì)地[27]、水熱條件[28]和外源氮[29]有很大關(guān)系。本研究通過響應(yīng)曲面法RSM分析得出溫度、含水率和低溫復(fù)合菌系HT20添加量是影響秸稈腐解率的關(guān)鍵因素，原因可能為溫度和含水率通過影響土壤中一些微生物群落的生長(zhǎng)繁殖和生理機(jī)能，低溫復(fù)合菌系HT20通過直接增加微生物的種類和數(shù)量，影響秸稈分解速率。低溫復(fù)合菌系HT20添加量與溫度、含水率的交互作用對(duì)秸稈腐解率影響顯著，這與以往單一因素對(duì)秸稈腐解的研究不同，本研究可同時(shí)考慮影響因素單獨(dú)作用及交互作用對(duì)秸稈腐解率影響的顯著性。從響應(yīng)曲面圖(圖1)中，低溫復(fù)合菌系HT20添加量與溫度、含水率的交互作用對(duì)秸稈腐解率的影響過程中，隨著HT20添加量的增加，秸稈腐解率出現(xiàn)了拐點(diǎn)，說明HT20添加量與秸稈的腐解效果不是完全成正比，拐點(diǎn)即為最佳添加量。此外，HT20添加量與尿素添加量交互作用對(duì)秸稈腐解率影響不顯著。因此，在施用HT20時(shí)不需額外施用尿素，施用方法簡(jiǎn)單，這與大多數(shù)腐熟劑不同。在我國(guó)的北方地區(qū)，冬季非常寒冷，微生物活性較低，秸稈2 a不能實(shí)現(xiàn)完全腐化，對(duì)于下年種植水稻十分不利。本研究從本地水稻秸稈還田土壤中篩選出可在5 ℃生長(zhǎng)的纖維素分解菌株，通過低溫脅迫、富集篩選、拮抗試驗(yàn)、組合構(gòu)建了主要由白蟻菌、長(zhǎng)柄木霉、芬萊氏鏈霉菌、葡萄球菌等組成的低溫復(fù)合菌系HT20，并應(yīng)用水稻秸稈還田研究中，與不添加腐熟劑(CK)和常用腐熟劑相比，低溫復(fù)合菌系HT20不僅提高秸稈的腐解速率，縮短腐解時(shí)間，同時(shí)還增加土壤的養(yǎng)分和微生物數(shù)量。利用Design-Expert軟件對(duì)秸稈腐解率的數(shù)學(xué)模型求極值得知HT20在5～10 ℃時(shí)候的腐解率可達(dá)22.6%～36.7%，說明低溫復(fù)合菌系HT20可以在低溫條件下氧化外源物質(zhì)，降低微生物的啟動(dòng)溫度，在水稻秧苗移栽前即可完成秸稈部分分解，釋放養(yǎng)分，減少對(duì)水稻根系生長(zhǎng)的影響。依據(jù)該地區(qū)氣候條件可知，冀東稻區(qū)在11月左右水稻收獲后施用低溫復(fù)合菌系HT20直接還田，并進(jìn)行適量灌水處理，可以滿足秸稈腐解需要的溫度、水分和微生物，還可以消滅越冬害蟲，為解決冀東稻區(qū)冬季秸稈原位還田腐解困難問題提供技術(shù)支撐。