羅香怡，李 云，曹 東，魏 樂(lè)，宗 淵，劉寶龍

(1.青海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，西寧 810008；2.青海省作物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810001)

枸杞(Lyciumbarbarum)是枸杞屬茄科植物，在中國(guó)廣泛種植，主要分布于西北、河北、東北等地[1]。枸杞中富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，如枸杞多糖、甜菜堿、氨基酸、總糖、枸杞色素等，具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)等豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[2-4]。根據(jù)其所含花青素含量差異可分為紅枸杞、黑枸杞、黃枸杞等[5]。其中黑枸杞是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的多年生抗旱耐鹽性的野生枸杞，是已發(fā)現(xiàn)的花青素含量最高的枸杞品種，其藥用、保健價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通紅枸杞[6]。本試驗(yàn)研究中的LrAN2基因僅存于黑枸杞。近年來(lái)黑枸杞相關(guān)研究較為豐富，2014年張玲艷等[7]研究黑枸杞花青素的提取工業(yè)及其抗氧化能力，闡明黑枸杞花青素提取最佳工業(yè)條件，發(fā)現(xiàn)隨著黑枸杞花青素濃度的增加，其清除能力逐漸增強(qiáng)。朱雪冰[8]對(duì)黑枸杞和紅枸杞的果實(shí)進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，解析了黑枸杞與紅枸杞中與花青素代謝相關(guān)基因的表達(dá)和結(jié)構(gòu)差異，為黑枸杞新品種選育提供良好的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Li等[9]對(duì)黑枸杞在鹽脅迫和干旱脅迫下光合特性進(jìn)行了研究，評(píng)估了枸杞的耐鹽性和耐旱性。

花青素(Anthocyanin)是一種糖基化的多酚類化合物，能夠賦予植物花、種子、果實(shí)和營(yíng)養(yǎng)組織紅、紫、藍(lán)等各種不同的顏色，同時(shí)具有抗氧化作用[10]，是目前最有效的抗氧化劑，花青素能夠保護(hù)植物免受各種生物和非生物脅迫，如紫外線[11]、干旱[12]、低溫[13]及病蟲(chóng)害[14]等?；ㄇ嗨厣锖铣赏緩轿镏械拇蠖鄶?shù)結(jié)構(gòu)基因已從矮牽牛屬、擬南芥、玉米和其他物種中鑒定出來(lái)[15-16]。這些結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄直接由MYB-bHLH-WD40復(fù)合物(MBW)調(diào)控，該復(fù)合物由R2R3-MYB、bHLH和WD40蛋白組成[17]。MYB轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活通常會(huì)導(dǎo)致植物葉片或果實(shí)中花青素的積累[18]。如LhMYB6和LhMYB12可激活花青素生物合成結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，引起矮牽牛色素積累[19]。

近年來(lái)，研究人員已從番茄MBW復(fù)合物中發(fā)現(xiàn)了花青素合成調(diào)節(jié)因子，包括兩個(gè)編碼R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的旁系同源基因花青素1(SlANT1)和花青素2(SlAN2)。SlANT1和SlAN2與矮牽牛花雜交中的PhAN2高度同源[20-21]，這兩個(gè)基因的特異表達(dá)能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因番茄各器官花青素的合成，并且SlAN2還能夠誘導(dǎo)植物在強(qiáng)光和寒冷條件下花青素的生物合成[22]。LrAN2是一個(gè)功能性MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，可以調(diào)節(jié)花色苷的合成。它包含完整的HTH_MYB，在調(diào)節(jié)MYB轉(zhuǎn)錄因子中起重要作用。它僅在黑枸杞黑色果實(shí)中表達(dá)，LrAN2的等位基因變異與黑色果實(shí)性狀密切相關(guān)[23]。MYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中LrAN2與NtAN2和AtPAP1同源[24-25]，煙草中LrAN2的過(guò)表達(dá)激活了與花青素生物合成相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子AN1b以及與原花青素生物合成相關(guān)的MYB轉(zhuǎn)錄因子MYB3[26]。這表明LrAN2是NtAN2的功能類似物，編碼MYB轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)植物細(xì)胞花青素的合成。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示LrAN2與茄科作物屬相鄰，與SmAN2、S1AN2、StMTF2、S1ANT1、StNA1等高度同源[23]。過(guò)表達(dá)SlAN2和SlANT1的番茄品系，都顯示出花青素的合成增強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)器官、花和果實(shí)色素的沉著[22]。LrAN2與SlAN2在發(fā)育樹(shù)分析中聚類相近，同源性較高，但是LrAN2在枸杞中的調(diào)控作用還不是很明確。由于枸杞轉(zhuǎn)基因組織培養(yǎng)技術(shù)的局限性，本研究選擇與枸杞同屬茄科作物番茄進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能分析，并在番茄中過(guò)表達(dá)LrAN2，以分析LrAN2基因的功能及其調(diào)控，為L(zhǎng)rAN2的功能研究提供良好的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和生長(zhǎng)條件

試驗(yàn)中番茄(SolanumlycopersicumL.)品種 Marker作為野生型材料。將番茄種子進(jìn)行室內(nèi)培育，在30 000 lx的光照度下光照16 h，溫度25 ℃，土壤濕度為60%～80%。待植株長(zhǎng)到4葉期時(shí)進(jìn)行組培試驗(yàn)。種子資源保于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所劉寶龍課題組。

1.2 cDNA制備

取黑枸杞成熟期黑色果實(shí)，用RNAprep Pure Plant Plus試劑盒(TIANGEN，DP441)提取RNA。根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用TIANScript II RT試劑盒(TIANGEN，KR107-01)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.3 植物表達(dá)載體構(gòu)建

利用Vector NTI軟件設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)上述提取的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：20 μL反應(yīng)系統(tǒng)包括10 μL 4倍HQ緩沖液(Thermo Fisher Science，北京，中國(guó))，1.6 μL 10 mmol/L dNTP，0.2 μL 20 mmol/L引物和0.2 μL cDNA模板，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。循環(huán)條件如下：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min；72 ℃ 10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物T鏈接測(cè)序，提取陽(yáng)性菌落質(zhì)粒后進(jìn)行Gateway克隆，最終將目的片段構(gòu)建于含有CaMV35S啟動(dòng)子的表達(dá)載體PJAM1502中。Gateway克隆體系如下：(1)BP反應(yīng)：100～200 ng PCR回收產(chǎn)物；100 ng pDONR207載體；1 μL BP ClonaseⅡ；加水至5 μL；25 ℃水浴3 h。然后向反應(yīng)體系中加入1 μ L Proteinase K(2 μg/μL)，37 ℃水浴10 min，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。用質(zhì)粒提取試劑盒提取入門載體pDONR207-LrAN2。(2)LR反應(yīng)：100 ng pDONR207-LrAN2重組質(zhì)粒；100 ng PJAM1502瞬時(shí)表達(dá)載體；1 μL LR ClonaseⅡ；加水至5 μL；25 ℃水浴3 h。然后向反應(yīng)體系中加入1 μL Proteinase K(2 μg/μL)，37 ℃水浴10 min，得到重組質(zhì)粒PJAM1502：LrAN2。通過(guò)冷凍法將PJAM1502：LrAN2轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中。剪取先前培養(yǎng)番茄植株4葉期幼嫩的莖段組織，75%酒精滅菌1 min，2%次氯酸鈉滅菌12 min后進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染，農(nóng)桿菌OD值為0.6。培養(yǎng)基配置體系如下：預(yù)培養(yǎng)：MS + 1 mg/L ZT + 0.2 mg/L IAA；共培養(yǎng)：MS + 1 mg/L ZT + 0.2 mg/L IAA + 1 mL AS；篩選培養(yǎng)：MS + 1 mg/L ZT + 0.2 mg/L IAA + 300 mg/L 特美汀+ 10 mg/L 潮霉素(70 mg/L 卡那霉素)；生根培養(yǎng)：1/2 MS + 150 mg/L 特美汀+5 mg/L 潮霉素(50 mg/L 卡那霉素)。相關(guān)載體構(gòu)建、農(nóng)桿菌檢測(cè)以及陽(yáng)性植物挑選的引物見(jiàn)表1。最終利用attb1和attb2引物檢測(cè)陽(yáng)性植株。

1.4 qPCR定量分析

分別選取番茄的根、莖、葉、花和果實(shí)，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。內(nèi)參基因Slactin轉(zhuǎn)錄本的擴(kuò)增可用于標(biāo)準(zhǔn)化PCR前各種逆轉(zhuǎn)錄混合物的cDNA含量，并在PCR過(guò)程中監(jiān)控?zé)釘U(kuò)增動(dòng)力學(xué)。至少使用3個(gè)獨(dú)立的測(cè)試來(lái)檢測(cè)qPCR揭示的轉(zhuǎn)錄模式的可重復(fù)性。表1包括本研究用到的引物。

表1 本研究所用引物

1.5 轉(zhuǎn)基因植株表型觀察分析

用iPhone11 pro max拍攝轉(zhuǎn)基因番茄和對(duì)照番茄中不同組織的照片。用OLYMPUS-BX53顯微鏡拍攝對(duì)應(yīng)于不同組織的表皮細(xì)胞的放大圖片，并使用CellSens Standard軟件進(jìn)行圖片 處理。

1.6 花青素含量測(cè)定

分別取開(kāi)花后轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄的根、莖、葉、花和果實(shí)，使用(Q=(A530-0.25×A657)/0.1)的方法測(cè)量計(jì)算花青素含量，并設(shè)立3個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)。使用SPSS軟件分析數(shù)據(jù)。

1.7 花青素種類定性分析

稱取對(duì)照番茄葉、轉(zhuǎn)基因番茄葉和黑枸杞果實(shí)各1 g，用0.1%鹽酸溶解，然后在32 ℃水浴中放置12 h后超聲30 min。經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜后，將提取的花青素轉(zhuǎn)移到液體分析瓶中，使用高效液相色譜法在520 nm光譜條件下掃描花青素提取物，以檢測(cè)各種花青素的相應(yīng)吸收峰。液相條件：0～10 min 10%～20%乙腈，10～15 min 20%～30%乙腈，15～20 min 30%～80%乙腈，20～25 min 80%～8%乙腈；柱溫：25 ℃，進(jìn)樣量：90 μL；運(yùn)行時(shí)間：25 min。

稱取5 g葉子，凍干，備用。通過(guò)ABSciexQTRAP LC-MS/MS檢測(cè)平臺(tái)，收集樣品代謝物光譜信息，并將質(zhì)譜信息與花青素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，以鑒定樣品中花青素代謝物的類型。使用三重四極桿質(zhì)譜的多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)獲得樣品中代謝物的峰面積數(shù)據(jù)，并獲取不同樣品中代謝物的相對(duì)含量。基于獲得的花青素代謝物的定性和定量數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)模型的質(zhì)量控制及花青素鑒定和花青素的相對(duì)定性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞 LrAN2基因轉(zhuǎn)化番茄植株

將LrAN2基因構(gòu)建到PJAM1502載體中，并在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染后獲得過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。PCR檢測(cè)10棵組培苗，其中陽(yáng)性植株5棵，陽(yáng)性植物DNA樣品中目標(biāo)基因LrAN2的開(kāi)放閱讀框(ORF)為774 bp，陰性對(duì)照中無(wú)法獲得有效片段。培養(yǎng)20 d后，轉(zhuǎn)基因植物和非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照植株外觀上并無(wú)明顯差異。LrAN2基因表達(dá)載體構(gòu)建如圖1，PCR檢測(cè)圖片如圖2，野生型番茄植株和轉(zhuǎn)基因番茄植株對(duì)比如圖3。

2.2 轉(zhuǎn)基因植株不同組織部位表型觀察

通過(guò)顯微鏡觀察番茄各個(gè)組織細(xì)胞，果實(shí)表皮無(wú)差異，表皮細(xì)胞清晰可見(jiàn)，沒(méi)有色素沉著。在轉(zhuǎn)基因番茄的花中，花藥呈紫黑色，在顯微鏡下更為明顯。轉(zhuǎn)基因葉片細(xì)胞含有大量色素沉著，而野生型葉片則含有大量葉綠素。莖段中細(xì)胞色素沒(méi)有明顯差別。轉(zhuǎn)基因根在外觀和細(xì)胞觀察中顯示出明顯的紫色。各組織部位根、莖、葉、花、果實(shí)表型和表皮細(xì)胞對(duì)比如圖4。

2.3 LrAN2對(duì)花青素合成代謝通路的調(diào)控分析

花青素含量測(cè)定顯示，轉(zhuǎn)基因番茄的花，葉，莖和根存在花青素的積累，但果實(shí)中花青素積累的不多。葉中的相對(duì)含量最高，然后是花和根。兩種不同類型番茄花青素含量對(duì)比如圖5。

qPCR分析表明，轉(zhuǎn)基因植株中LrAN2基因在葉中表達(dá)量最高，其次是根?；ㄇ嗨睾铣纱x通路中所有結(jié)構(gòu)基因表達(dá)譜分析顯示，DFR基因的轉(zhuǎn)錄水平最高，其次是F3′5′H基因。LrAN2基因在各組織部位的相對(duì)表達(dá)量如圖6，結(jié)構(gòu)基因表達(dá)量比對(duì)如圖7。

2.4 LrAN2對(duì)其他基因和化合物表達(dá)的影響

對(duì)番茄葉片和黑枸杞果實(shí)進(jìn)行色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖8。野生型對(duì)照樣本中未能提取出花青素，而轉(zhuǎn)基因葉片中能提取出粉紅色花色苷提取物，黑枸杞中提取出紫黑色花色苷提取物。分別對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄中的飛燕草素、矢車菊素、天竺葵素、芍藥素、錦葵色素等花色苷提取物進(jìn)行定性分析，結(jié)果顯示，其中飛燕草素-3-O-蕓香糖苷在轉(zhuǎn)基因番茄中有效峰面積最大。飛燕草素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-葡萄糖苷在轉(zhuǎn)基因番茄中存在有效峰面積，而在野生番茄中檢測(cè)不到。芍藥素、錦葵色素在轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄中均不存在。具體檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 定性結(jié)果

3 討 論

本研究構(gòu)建了一種35S：LrAN2的植物表達(dá)載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌侵染技術(shù)在番茄中進(jìn)行過(guò)量表達(dá)，從而了解LrAN2基因在茄科作物中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。Zeng等[27]推測(cè)LrAN2是調(diào)節(jié)黑枸杞生物合成的關(guān)鍵基因，并利用qPCR和酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行論證。Zong等[23]對(duì)黑枸杞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選了關(guān)鍵候選基因LrAN2，通過(guò)生物信息學(xué)、表達(dá)譜分析、過(guò)表達(dá)驗(yàn)證，在54種群體材料中進(jìn)行等位變異掃描，證明LrAN2基因是參與并調(diào)控黑枸杞表達(dá)的主效基因。由于枸杞中過(guò)量表達(dá)基因的組織培養(yǎng)技術(shù)一直沒(méi)有突破性進(jìn)展，無(wú)法驗(yàn)證LrAN2在枸杞中的過(guò)量表達(dá)調(diào)控機(jī)制，因此本研究使用茄科作物番茄作為L(zhǎng)rAN2功能分析的模式植物。

LrAN2在煙草(Samsun)中過(guò)表達(dá)后，整個(gè)煙草植株呈紫色表型，葉和莖中花青素含量最高[23]。而在轉(zhuǎn)基因番茄中，花青素主要沉積在莖、葉和根部。煙草中LrAN2的過(guò)表達(dá)激活了紫色煙草146個(gè)基因的上調(diào)，ANS的表達(dá)上調(diào)了400倍以上，其次是DFR和CHI[28]。在轉(zhuǎn)基因煙草中類黃酮代謝通路被激活[29]，同時(shí)其他調(diào)控花色苷的轉(zhuǎn)錄因子ANb1和MYB3都同時(shí)上調(diào)，然而LrAN2在番茄中的過(guò)表達(dá)不能使果實(shí)產(chǎn)生花青素，10X物鏡觀察番茄表皮細(xì)胞未出現(xiàn)色素沉著。在以前的研究中，Muir等[30]將矮牽牛的CHI基因轉(zhuǎn)到番茄中，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因番茄的果皮中黃酮醇含量增加了78倍，但是果實(shí)也沒(méi)變成紫色。Schijlen等[31]將不同植物的花青素合成結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)入番茄中，果實(shí)也都沒(méi)有變色。這些研究表明[32]僅有結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)是不夠的，轉(zhuǎn)入特定的轉(zhuǎn)錄因子才有可能增加花青素的合成。對(duì)于本研究出現(xiàn)果實(shí)沒(méi)有呈現(xiàn)紫色的現(xiàn)象很有可能是需要番茄果實(shí)特異表達(dá)E8啟動(dòng)子調(diào)控目的基因[33]，最終才能在果實(shí)中實(shí)現(xiàn)LrAN2的大量轉(zhuǎn)錄，35S啟動(dòng)子無(wú)法在番茄果實(shí)中激活LrAN2所導(dǎo)致。本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄和野生型番茄進(jìn)行代謝組對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)花青素相關(guān)的化合物在轉(zhuǎn)基因番茄中大量積累，說(shuō)明LrAN2基因能夠調(diào)控花青素的合成。

4 結(jié) 論

在本研究中，LrAN2基因在番茄中過(guò)表達(dá)，并被啟動(dòng)子CaMV35S調(diào)控和激活。結(jié)果表明，雖然LrAN2參與了黑枸杞果實(shí)花青素生物合成的調(diào)控，但還需要黑枸杞啟動(dòng)子的調(diào)控。飛燕草色素、矢車菊色素在黑色果實(shí)中的大量積累受到LrAN2基因的決定性調(diào)控。