于芳芳,柴思敏,谷 龍,鄭 煜,周 旭,徐士霞,任文華

(南京師范大學生命科學學院,江蘇 南京 210023)

睪丸是雄性哺乳動物生殖系統(tǒng)的核心器官,其發(fā)育常需伴隨自身的下降,這個下降過程是指睪丸從尿生殖嵴經(jīng)腹腔降至陰囊. 睪丸的下降過程分為兩個階段,分別是腹腔內(nèi)遷移階段和腹股溝陰囊階段. 臨床上把睪丸未下降到陰囊的現(xiàn)象稱為隱睪. 通常人在出生時就已經(jīng)完全下降到陰囊內(nèi),鼠類在出生后3周左右完成這一過程[1-4]. 然而,生理解剖學家們發(fā)現(xiàn)并不是所有的哺乳動物的睪丸都會下降到陰囊,如金毛鼴、象等動物的睪丸未下降,仍然保留在腹腔中;人、黑猩猩等靈長類動物的睪丸則下降至體腔外的陰囊中[5]. 隱睪的發(fā)生較為復雜,涉及遺傳、解剖、神經(jīng)內(nèi)分泌及環(huán)境等因素的相互作用[3].

AXIN1(axis formation inhibitor)是體軸發(fā)育抑制因子,在胚胎發(fā)育過程中控制著體軸的形成,以前被鑒定為小鼠Fused基因座的產(chǎn)物,定位于人染色體16p13.3,與小鼠蛋白具有87%的相似性. 目前已經(jīng)證實了AXIN1基因在線蟲、果蠅、斑馬魚、爪蟾、雞、小鼠、大鼠、人中都非常保守;普遍表達于不同的組織,包括腦、胸腺、心臟、肺、肝、脾和腎等[6].AXIN1的突變會導致神經(jīng)外胚層缺陷(不完全閉合、頭部皺褶的畸形或截斷)、心臟缺陷、胚軸重復和純合子的早期胚胎致死[7]. AXIN1的功能也與許多疾病和腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關. 此外,AXIN1與幾種不同的蛋白質(zhì)復合物結合,參與了Wnt、轉化生長因子(TGF-β)、應激激活蛋白激酶JNK1(JNK)和細胞腫瘤抗原p53信號通路[8-9]. 經(jīng)典Wnt信號通路不僅調(diào)節(jié)脊椎動物和無脊椎動物的細胞增殖、分化、形態(tài)和運動,它的激活也是某些隱睪癥的潛在病因[10]. AXIN1作為Wnt信號通路中破壞復合物的中心支架,它直接與Wnt/β-catenin信號傳導中的許多組分相互作用,如LRP、DVL、PP2A、APC、CK1、GSK3β和β-catenin,可能在隱睪癥的發(fā)展中起重要作用. 對113名隱睪患者與179名健康的志愿者進行SNP分析,研究發(fā)現(xiàn)隱睪癥患者和對照組之間AXIN1標簽SNP的等位基因和基因型頻率存在顯著差異,這意味著這些等位基因和基因型可能是導致隱睪癥發(fā)生的因素[11].

通過對基因座的分析發(fā)現(xiàn),人AXIN1具有兩種亞型,a亞型由11個外顯子組成,基因轉錄產(chǎn)物全長為3 675 bp,翻譯蛋白含862個氨基酸殘基;b亞型在3′編碼區(qū)缺少框內(nèi)第9個外顯子,序列長度為3 567 bp,翻譯826個氨基酸[12]. 經(jīng)過實驗室的前期序列分析發(fā)現(xiàn)(待發(fā)表數(shù)據(jù)),對睪丸完全未下降物種(金毛鼴、非洲象、鴨嘴獸等)和睪丸完全下降物種(人、黑猩猩、小鼠等)的AXIN1基因進行序列比對,在睪丸完全未下降的物種中AXIN1基因的第9個外顯子缺失. 本文分別選取睪丸完全未下降和睪丸完全下降中的代表物種非洲象和人進行生物信息學分析. 非洲象的AXIN1基因由10個外顯子組成,基因轉錄產(chǎn)物全長為 2 733 bp,由833個氨基酸組成. 與人的AXIN1a亞型基因序列比對發(fā)現(xiàn),非洲象缺失的部分為第9個外顯子,共108 bp,和人的b亞型相似. 因此本研究通過實驗鑒定非洲象的AXIN1基因序列是否存在缺失,并通過生物信息學方法對人和非洲象的AXIN1基因進行分析,為進一步研究AXIN1基因與睪丸位置的相關性提供基本材料和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

非洲象的肌肉樣本(來自死亡個體)為本實驗室保存. 組織裂解液(10 mmol/L Tris-cl,500 mmol/L EDTA,100 mmol/L NaCl,PH=7.5～8.0);蛋白酶k、Tris-飽和酚、苯酚、氯仿異戊醇(體積比24∶1)、醋酸鈉購自上海生工生物有限公司;普通Taq DNA polymerase購自TaKaRa;無水乙醇為國產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 基因鑒定

用酚氯仿抽提法提取非洲象基因組DNA. 取非洲象肌肉組織于1.5 mL Eppendorf管中,加入組織裂解液600 μL,蛋白酶K(20 mg/mL)10 μL,充分混勻,55 ℃消化過夜;去除已經(jīng)消化好的樣品,以5 000 rpm的速度于4 ℃離心10 min,除去雜質(zhì),取上清液至新的1.5 mL Ep管中;加入等體積Tris-飽和酚,將離心管置于旋轉皿上旋轉10 min～15 min,溫和混勻兩相,使管內(nèi)內(nèi)容物混成乳濁物;以 8 000 rpm的速度于4 ℃離心15 min,取上清液至新的1.5 mL Ep管中;加入等體積氯仿異戊醇,顛倒混勻10 min～15 min,再次以 8 000 rpm的速度于4 ℃離心15 min;將上層水相轉移至新的1.5 mL Ep管中,加入0.1倍體積醋酸鈉混勻,再加入2.5倍體積冷的無水乙醇,上下顛倒Ep管至溶液徹底混勻;-20 ℃冰箱沉淀DNA至少3 h(可過夜);取出后以12 000 rpm的速度于4 ℃離心10 min,去除上清液,留沉淀;向Ep管中加入1 mL 75%乙醇,以12 000 rpm的速度于4 ℃離心10 min;倒掉乙醇,向Ep管中加入1 mL 75%乙醇,再次離心,條件同上,做第二次洗脫;再次調(diào)轉Ep管在離心機里的方向,以12 000 rpm的速度于4 ℃離心10 min,用200 μL的槍小心吸走乙醇,然后開蓋晾干乙醇;加入50 μL雙蒸水沉解,4 ℃保存.

通過NCBI在線網(wǎng)頁(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)在外顯子序列上設計引物,引物由上海生工生物有限公司合成,引物序列如下:

Loxodonta Africana F:5′AAGAGGAGAAGCGAACCAGC3′,

Loxodonta Africana R:5′CCCGCCTTCTTCTGTGACTT 3′.

PCR體系:基因組DNA模板2 μL,正反向引物各1 μL,dNTP Mixture 15 μL,用雙蒸水補足至25 μL. PCR反應程序為:95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán). 反應結束后對擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測,然后由上海生工測序.

1.2.2 基因序列數(shù)據(jù)來源

本文所用數(shù)據(jù)均來源于NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),從中獲取人和非洲象AXIN1基因的基因序列以及對應的氨基酸序列進行數(shù)據(jù)分析.

1.2.3 生物信息學分析

運用以下在線網(wǎng)站分別預測AXIN1基因和AXIN1蛋白性質(zhì):Neural Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)預測基因潛在核心啟動子;NCBI數(shù)據(jù)庫中的ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對基因進行開放閱讀框的分析;Protparam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的分子量、分子式、等電點、脂肪系數(shù)、不穩(wěn)定系數(shù)、半衰期、平均親水系數(shù),以及氨基酸組成;ProtScale(http://web.expasy.org/protscale)進行蛋白質(zhì)疏水性分析;SingalP5.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析信號肽;TMHMM Sever.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質(zhì)的切割位點及跨膜區(qū)域;NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos)預測磷酸化位點;PSORT II Prediction(https://psort.hgc.jp/form2.html)分析蛋白的定位信息;SOPMA(https://npsa-pbil.ibcp.fr)分析蛋白質(zhì)的二級結構;I-TASSER(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)預測蛋白質(zhì)的三維結構;Pymol軟件對人和非洲象兩種蛋白質(zhì)的三維結構疊合比對;MEGA軟件對人和非洲象的AXIN1蛋白質(zhì)序列進行比對;STRING(http://string-db.org)推測有可能與人和非洲象AXIN1有直接或間接相互作用的蛋白質(zhì);NCBI的CDD(Conserved Domain Database)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測蛋白質(zhì)的保守結構域.

2 結果與討論

2.1 非洲象AXIN1基因缺失的實驗驗證

首先利用NCBI數(shù)據(jù)庫下載人和非洲象的AXIN1序列,分別選取最長的轉錄本,利用MEGA軟件比對. 與人相比,非洲象的AXIN1基因缺失第9個外顯子(108 bp)(圖1A). 通過構建基因組本地數(shù)據(jù)庫,以近親緣物種的基因序列作為“query”篩選基因組中非洲象的序列,將非洲象的每個外顯子前后延伸200 bp,最后確保能夠完整獲得第8和第10個外顯子之間的內(nèi)含子序列. 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站中的非洲象AXIN1序列設計引物,分別在第8個和第10個外顯子上設計上下游引物,以提取的非洲象全基因組DNA為模板進行PCR擴增,得到約200 bp的條帶(圖1B). 將測序結果與本地blast的結果進行比對,發(fā)現(xiàn)測序結果與下載的結果一致,即第8個和第10個外顯子之間全部為內(nèi)含子序列,沒有第9個外顯子的序列.

圖1 非洲象AXIN1基因缺失部分驗證Fig.1 Verification of the missing part of the Loxodonta africana AXIN1 gene

2.2 人和非洲象AXIN1基因的生物信息學分析

2.2.1 人和非洲象AXIN1基因的核心啟動子分析

本研究分別選取人和非洲象AXIN1基因的最長轉錄本進行分析,研究結果(表1)表明人AXIN1基因共有兩種核心啟動子,分為143 bp～193 bp、492 bp～542 bp,并且這兩種核心啟動子的得分值均為0.8及以上,因此推測這兩處是人AXIN1基因核心啟動子.

表1 人和非洲象AXIN1基因的核心啟動子Table 1 Core promoter of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 gene

非洲象AXIN1并沒有預測到核心啟動子.

2.2.2 人和非洲象AXIN1基因的開放閱讀框分析

本次研究的分析結果(圖2)表明,人和非洲象都在ORF1閱讀框有最長的開放閱讀框架. 人AXIN1基因的開放閱讀框架長度為2 589 bp,編碼862個氨基酸;非洲象AXIN1基因的開放閱讀框架長度為2 502 bp,編碼833個氨基酸.

圖2 人和非洲象AXIN1基因序列的ORF分析Fig.2 ORF analysis of AXIN1 gene sequence of Homo sapiens and Loxodonta africana

2.2.3 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

ProtParam 分析結果(表2)表明,人AXIN1蛋白質(zhì)的相對分子量為959 340.97,分子式為C4158H6544N1240O1300S29,消光系數(shù)是80 760;等電點(pI)是6.50,該蛋白為酸性蛋白;帶負電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為125個,帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為117個;不穩(wěn)定系數(shù)是54.62,該蛋白為不穩(wěn)定蛋白;在網(wǎng)織紅細胞中該蛋白的半衰期是30 h;脂肪系數(shù)為62.94;總平均親水系數(shù)為-0.794;該蛋白是親水性蛋白(負值為親水性蛋白,正值為疏水性蛋白).

表2 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析Table 2 Analysis of physicochemical properties of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 protein

非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的相對分子量92 414.41,分子式是C4030H6349N1183O1265S25,消光系數(shù)為79 020;理論等電點為6.48,該蛋白為酸性蛋白;帶負電荷的氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)為118個,帶正電荷的氨基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)為110個;其不穩(wěn)定系數(shù)為55.89,該蛋白為不穩(wěn)定蛋白質(zhì);在哺乳動物網(wǎng)織紅細胞內(nèi)該蛋白的半衰期為30 h;脂肪系數(shù)為63.84;總平均親水系數(shù)為-0.770,該蛋白是親水性蛋白.

用ProtScale 在線工具進行疏水性分析,同樣可得出這兩個蛋白為親水性蛋白.

2.2.4 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的信號肽、跨膜區(qū)域預測

信號肽(SP)是許多新合成蛋白質(zhì)的氨基末端的短氨基酸序列,能將蛋白質(zhì)靶向到膜中或跨膜[13]. 利用Singal P5.0 sever在線分析工具對人和非洲象的AXIN1信號肽進行預測,結果發(fā)現(xiàn),兩種蛋白質(zhì)均不含信號肽. 利用TMHMM Sever.2.0分析人和非洲象的AXIN1蛋白質(zhì)發(fā)現(xiàn)也不存在跨膜區(qū)域.

2.2.5 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的磷酸化位點預測

磷酸化修飾是一種重要且常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式,蛋白質(zhì)的可逆磷酸化與去磷酸化過程是真核細胞生命活動中最普遍的調(diào)控手段,廣泛參與到細胞周期、分化和發(fā)育、代謝和神經(jīng)活動、肌肉收縮和轉錄調(diào)節(jié)等生命過程中[14]. 利用NetPhos 3.1 Server在線網(wǎng)頁對蛋白質(zhì)進行分析發(fā)現(xiàn),人AXIN1蛋白質(zhì)的磷酸化位點中置信度達到90%以上的位點共有39個,非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的磷酸化位點共有33個(圖3).

橫坐標為序列位置,縱坐標為磷酸化的可能性. 閾值為 0.5(紅橫線)圖3 人和非洲象AXIN1的磷酸化位點預測Fig.3 Phosphorylation site prediction of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1

2.2.6 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的亞定位分析

通過在線網(wǎng)頁PSORT II Prediction預測蛋白質(zhì)的定位信息,發(fā)現(xiàn)人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)位于相同的細胞結構中,分別為細胞質(zhì)、線粒體和細胞核. 其中人的AXIN1蛋白質(zhì)存在于細胞質(zhì)、線粒體和細胞核的概率分別為73.9%、17.4%、8.7%;非洲象的AXIN1蛋白質(zhì)存在于細胞質(zhì)、線粒體和細胞核的概率為69.6%、17.4%、13.0%(表3).

表3 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的亞定位預測Table 3 Prediction of sublocalization of AXIN1 protein in Homo sapiens and Loxodonta africana

2.2.7 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)序列比對

通過MEGA軟件對人和非洲象AXIN1的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)(圖4),除了在第9個外顯子有插入缺失之外,在第1位、第57位、第513位、第617位、第675～679位也存在插入缺失,此外兩者的氨基酸位點存在多處不同.

“*”表示人和非洲象AXIN1的氨基酸位點相同,“.”表示人和非洲象AXIN1的氨基酸位點不同,“-”表示在人或者非洲象的AXIN1中存在缺失,紅框表示人和非洲象中插入缺失的序列圖4 人和非洲象AXIN1蛋白序列比對結果Fig.4 Alignment results of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 protein sequence

2.2.8 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的二級結構分析

利用在線分析軟件SOPMA預測分析人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)所形成的二級結構. 將蛋白質(zhì)序列提交至SOPMA,構象狀態(tài)選擇3,包括α螺旋(Hh)、β折疊片(Ee)和無規(guī)則卷曲(Cc),所得結果如圖所示(圖5). 人AXIN1蛋白中分別有233個α螺旋(27.03%),47個β折疊片(5.45%)和582個無規(guī)則卷曲(67.52%);非洲象AXIN1蛋白中分別有230個α螺旋(27.61%),50個β折疊片(6.00%)和553個無規(guī)則卷曲(66.39%). 人和非洲象AXIN1二級結構的α螺旋、β折疊片和無規(guī)則卷曲數(shù)量沒有顯著差別,但是它們的α螺旋、β折疊片和無規(guī)則卷曲位置存在差別.

圖中帶有顏色的小寫英文字母表示二級結構,橙色的 c 代表無規(guī)則卷曲,紅色的 e 代表β折疊片,藍色的 h 代表 α螺旋圖5 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的二級結構預測Fig.5 Prediction of the secondary structure of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 protein

2.2.9 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的三維結構預測

通過在線網(wǎng)站I-TASSER對人和非洲象AXIN1的氨基酸序列進行同源三維建模(圖6),兩種蛋白質(zhì)都由一條鏈構成,紅色代表蛋白質(zhì)的N端,深藍色代表蛋白質(zhì)的C端. 用Pymol軟件對兩種蛋白質(zhì)的三維結構進行比對,能夠獲得兩者相互重疊的一系列三維坐標. 二者重疊的結構能夠用來計算RMSD(root mean square deviation)值,RMSD值衡量的是兩個結構之間的區(qū)別程度. RMSD越小,相似度越高. 研究分析表明,RMSD=30.713,說明兩者的蛋白結構差異較大.

圖6 人和非洲象AXIN1蛋白三維結構預測Fig.6 Prediction of the three-dimensional structure of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 protein

2.2.10 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)互作關系預測

本研究通過STRING在線網(wǎng)站推測可能與人和非洲象AXIN1有直接或間接相互作用的蛋白質(zhì). 利用此網(wǎng)站獲得蛋白互作網(wǎng)絡圖(圖7),并將相互作用的的蛋白質(zhì)信息繪制成表格(表4、5). 與人AXIN1有相互作用的蛋白質(zhì)是GSK3β、APC、CTNNB1、SIAH1、LRP5、LRP6、DVL1、GSK3A、TNKS、AMER1;與非洲象AXIN1有相互作用的蛋白質(zhì)是GSK3β、APC、CTNNB1、DVL1、GSK3A、CSNK1A1、CSNK1E、DVL2、LRP5、SIAH1.

A和B中線條的粗細代表相互作用關系的強弱,圓圈代表相互作用的蛋白質(zhì)圖7 人和非洲象AXIN1與其他蛋白質(zhì)的互作關系預測Fig.7 Prediction of the interaction between Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 and other proteins

表4 人AXIN1與其他蛋白質(zhì)的互作關系信息表Table 4 Information table of interaction between Homo sapiens AXIN1 and other proteins

2.2.11 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的保守結構域預測

本研究通過NCBI的CCD數(shù)據(jù)庫推測人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的保守結構域,發(fā)現(xiàn)人和非洲象的AXIN1蛋白質(zhì)中都具有4個保守結構域,分別是RGS_Axin、DIX、Axin_TNKS_binding、Axin_b-cat_bind super family(圖8).

圖8 人和非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的保守結構域預測Fig.8 Prediction of the conserved domains of Homo sapiens and Loxodonta africana AXIN1 protein

3 結論

精子發(fā)生和精子儲存的溫度需要低于37 ℃,睪丸作為精子發(fā)生的重要場所,需要保持低溫環(huán)境[15]. 睪丸下降至陰囊的胎盤哺乳動物,通過睪丸自身的調(diào)節(jié)可以使睪丸保持低溫狀態(tài);而對于海豹、海牛、鯨類等睪丸下降而無陰囊的物種來說,可能不需要睪丸下降到體外實現(xiàn)降溫,如鯨類和海豹已經(jīng)進化出獨特血管結構來冷卻睪丸,鯨類用冷的淺表靜脈血降低睪丸動脈血的溫度,海豹中存在血管逆流換熱系統(tǒng)實現(xiàn)睪丸冷卻[16]. 而對于非洲象等睪丸未下降的物種來說,他們的體溫與許多陰囊型哺乳動物相似,體內(nèi)也沒有類似的冷卻系統(tǒng). Sharma等的進化研究結果表明睪丸下降是胎盤哺乳動物的祖先狀態(tài),隨后在非洲獸總目的進化過程中轉變?yōu)槲聪陆挡G丸,但是關于非洲象等物種睪丸未下降的原因需要解剖學和實驗進一步研究[15].

AXIN1是一種重要的抑癌基因,其蛋白含有多個重要的功能結構域,可以與多種蛋白質(zhì)相互作用來行使生物學功能,參與多種信號通路的傳導[8]. 人AXIN1具有兩種亞型,a亞型由11個外顯子組成,b亞型由10個外顯子組成,b亞型中缺失的第9個外顯子能夠與Wnt信號通路中的PP2A蛋白質(zhì)結合[12]. PP2A是四種主要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶之一,是一種異源三聚體酶,其核心二聚體是由36 kDa催化亞基C和65 kDa調(diào)節(jié)亞基A組成,B亞基的大小范圍為24 kDa～130 kDa. PP2A廣泛表達并在細胞周期調(diào)控、細胞轉化、細胞分裂等過程中起作用[17]. Hsu等[17]推測缺乏PP2A結合結構域的AXIN1蛋白可以刺激GSK-3β/β-catenin相互作用而不會被PP2A調(diào)節(jié),會使下游的β-catenin繼續(xù)被磷酸化,進而導致β-catenin在細胞質(zhì)中被降解. Kaftanovskaya等[18]的研究表明肌源性轉錄物的產(chǎn)生依賴于β-catenin到達細胞核與TCF/LEF結合形成復合物,β-catenin的條件性敲除會導致提睪肌無法形成,進而導致腹腔內(nèi)隱睪. 最近的研究結果也表明,INSL3信號通過Notch和Wnt/β-catenin通路刺激引帶細胞發(fā)育[18]. 本研究依托實驗室前期研究結果,對人和非洲象的AXIN1基因進行鑒定發(fā)現(xiàn),與人AXIN1基因的a亞型相比,非洲象的基因缺失第9個外顯子,與人的b亞型相似. 非洲象AXIN1基因第9個外顯子的缺失可能導致其蛋白結構缺失與蛋白PP2A結合的結構域,導致Wnt信號通路中的β-catenin在細胞質(zhì)中被降解,提睪肌無法形成;同時INSL3的信號無法傳導,引帶細胞的發(fā)育受到限制,進而導致隱睪癥的發(fā)生. 因此認為非洲象AXIN1第9個外顯子的缺失可能是導致非洲象睪丸未下降的因素.

對于核心啟動子的預測分析發(fā)現(xiàn),人有兩種核心啟動子,說明人有兩種轉錄本,這與文獻中結果相符合. 對于非洲象的核心啟動子預測并沒有發(fā)現(xiàn)核心啟動子,關于其原因需要實驗進一步研究. AXIN1能夠與多種蛋白質(zhì)相互作用,但是人和非洲象的相互作用蛋白存在差別. LRP5和LRP6是低密度脂蛋白家族的成員,在Wnt信號通路中,作為一種跨膜受體,能夠與Wnt分泌性糖蛋白結合,從而啟動信號通路[19]. AMER1(APC membrane recruitment 1)是在脊椎動物中保守的1135個氨基酸的質(zhì)膜相關蛋白,通過充當β-catenin破壞復合體的支架蛋白并促進質(zhì)膜上AXIN1的穩(wěn)定,在Wnt信號傳導中發(fā)揮其負調(diào)控作用[20]. CSNK1A1基因編碼酪蛋白激酶1α(CK1α),是Wnt信號通路的關鍵調(diào)節(jié)因子,它的缺失誘導Wnt信號和p53信號激活[21]. CSNK1E編碼的酪蛋白激酶1ε是絲氨酸/蘇氨酸選擇性激酶家族的成員,該激酶具有多種分子底物和生物學功能,包括對Wnt信號通路的調(diào)控以及在調(diào)控晝夜節(jié)律等方面發(fā)揮作用[22]. 細胞質(zhì)DVL蛋白家族通過AXIN1和GSK3β的連接,充當Wnt信號通路的正調(diào)節(jié)劑,調(diào)節(jié)細胞增殖、極性和細胞命運. 目前研究表明DVL1和DVL2與乳腺癌、前列腺癌等癌癥相關[23]. TNKS是包含18個成員的聚合酶(PARP)蛋白質(zhì)超家族,具有通過減少AXIN1升高WNT的表達來增加β-catenin的能力[24]. 與人相比較發(fā)現(xiàn),非洲象的AXIN1蛋白能夠與CK1α結合抑制Wnt信號的啟動,可能會導致 β-catenin 在細胞質(zhì)中被泛素化而降解,從而無法啟動細胞核中WNT靶基因的轉錄激活. 人的AXIN1蛋白能夠與TNKS結合導致細胞中的β-catenin升高,非洲象的AXIN1蛋白不能與TNKS結合,可能導致細胞中的β-catenin降低,從而對睪丸下降產(chǎn)生影響. 因此,和人相比較,蛋白互作能力的差異可能也導致非洲象睪丸未下降的一個原因. 人AXIN1的第57位氨基酸位于TNK蛋白質(zhì)結合區(qū)域,表5中的數(shù)據(jù)表明,非洲象AXIN1不能與TNKS結合,所以非洲象中第57位氨基酸的插入可能是導致AXIN1無法與TNKS結合. AXIN1的第507～712位氨基酸能夠與AXAM(axin associating molecule)結合,AXAM能通過下調(diào) β-catenin 的水平來抑制Wnt信號通路[6]. 非洲象AXIN1蛋白質(zhì)的第513位、第617位、第675～679位在這段區(qū)域內(nèi)存在插入和缺失,可能影響AXAM與AXIN1結合,對β-catenin的水平產(chǎn)生影響,進而導致睪丸下降的表型出現(xiàn)異常,但是關于插入缺失對睪丸下降的影響需要實驗進一步研究. 除了插入和缺失之外,在人和非洲象的AXIN1蛋白質(zhì)序列中還有氨基酸位點存在差異,因為人和非洲象的親緣關系相距甚遠,且實驗室前期在睪丸完全未下降和睪丸完全下降的物種中沒有發(fā)現(xiàn)特異性的氨基酸位點,因此,氨基酸位點的差異是否會對睪丸下降產(chǎn)生影響還需要實驗進一步研究.

表5 非洲象AXIN1與其他蛋白質(zhì)的互作關系信息表Table 5 Information table of interaction between Loxodonta africana AXIN1 and other proteins

生物信息學的分析是對基因功能以及結構等的預測,關于人和非洲象AXIN1基因在睪丸下降中的功能有待于進一步探討和研究. 接下來將利用分子生物學和細胞生物學相關實驗技術研究第9個外顯子缺失氨基酸插入缺失,重要的氨基酸位點的差異對睪丸下降中信號通路的影響. 此外,還將利用基因編輯技術在小鼠體內(nèi)探究AXIN1基因第9個外顯子缺失對睪丸下降這一表型的影響.