高穎慧, 包 穎

(曲阜師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,273165,山東省曲阜市)

0 引 言

棉花(Gossypiumspp.)隸屬錦葵科(Malvaceae)、棉屬(GossypiumL.),是集多功能為一體的重要經(jīng)濟(jì)作物.栽培棉花通常包括4個(gè)種：亞洲棉(G.arboretumL.)、草棉(G.herbaceumL.)、陸地棉(G.hirsutumL.)和海島棉(G.barbadenseL.).它們能夠提供天然纖維,在紡織業(yè)中占據(jù)舉足輕重的地位；其副產(chǎn)品經(jīng)加工后,還可以開發(fā)出滿足人類消費(fèi)需求的多種產(chǎn)品[1].然而,作為國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱,棉花產(chǎn)業(yè)一直受限于棉花欠佳的纖維品質(zhì)、欠高的單位產(chǎn)量以及欠強(qiáng)的病蟲害防御能力等而發(fā)展遲緩.利用轉(zhuǎn)基因技術(shù),快速培育高性能棉花品種,已經(jīng)成為今后的發(fā)展方向.遺傳轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織,是植物轉(zhuǎn)基因育種的主要途徑[2-3],但是,由于棉花的基因型多樣、植物木質(zhì)化程度高、外植體敏感度差異大以及代謝物的成分與含量高等多種因素的影響,棉花與其他作物相比,組織培養(yǎng)非常困難[4].本文回顧并探討了影響棉花組織培養(yǎng)與植株再生的主要因素,分析了棉花組織培養(yǎng)中的常見問題,并對(duì)未來棉花快速組織擴(kuò)繁的研究與發(fā)展予以展望.

1 影響棉花組織培養(yǎng)及植株再生的主要因素

棉花組織培養(yǎng)及植株再生受到一系列因素的影響,其中最重要的包括6個(gè)方面,即基因型、外植體類型、培養(yǎng)基組成、植物激素、光照和金屬離子等.

1.1 基因型

基因型是棉花組織培養(yǎng)工作中的重要限制因素,常涉及多個(gè)基因,遺傳調(diào)控過程復(fù)雜[4].在現(xiàn)已建立的棉花再生體系中,大多數(shù)品種含有珂字棉或岱字棉血統(tǒng)[5].珂字棉的胚胎發(fā)生能力非常強(qiáng),但其農(nóng)藝性狀并不適合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展,所以珂字棉常常被用作研究棉花遺傳特征、生理指標(biāo)、細(xì)胞學(xué)分析等工作的模式品種[6].

早期的研究表明,基因型的差異對(duì)棉花愈傷組織的誘導(dǎo)影響不大.例如,有研究顯示[7],利用不同培養(yǎng)基對(duì)62個(gè)棉花品種下胚軸進(jìn)行誘導(dǎo),30天后均能誘導(dǎo)出愈傷組織.然而,該研究也發(fā)現(xiàn),不同基因型在不同培養(yǎng)基上產(chǎn)出的愈傷、形態(tài)、顏色都出現(xiàn)了很大的差異.其中具有強(qiáng)胚胎發(fā)生能力的品種,會(huì)形成質(zhì)地均勻、疏松且呈現(xiàn)淡黃色或黃綠色的愈傷組織；而具有弱胚胎發(fā)生能力的品種,則會(huì)產(chǎn)生質(zhì)地緊密、堅(jiān)硬且呈現(xiàn)白或綠色的塊狀愈傷組織.

在體細(xì)胞胚胎發(fā)生能力方面,棉花不同基因型間存在著較大的差異.多位研究者對(duì)不同基因型棉花的胚胎發(fā)生能力進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn),無論是物種間還是物內(nèi)品種間,棉花體胚發(fā)生的能力均表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)(表1)[8-12].

表1 棉花胚胎再生能力的分類

吳家和等[13]發(fā)現(xiàn),不同基因型種子的再生能力是制約體胚再生率和轉(zhuǎn)化率的主要因素.目前對(duì)棉花進(jìn)行的分子育種與遺傳改良的工作,在很大程度上依賴于體細(xì)胞植株再生過程.所以,選育出再生能力強(qiáng)、農(nóng)藝性狀優(yōu)的基因型,將成為研究者們今后努力的方向.

1.2 外植體類型

體細(xì)胞培養(yǎng)是棉花組培中最常用的方式.建立該體系的關(guān)鍵因素之一便是外植體的選擇.不同的外植體,如胚珠、胚軸、葉片、葉柄、根、子葉、莖尖等,其出愈率、胚性愈傷轉(zhuǎn)化率都存在著較大的差別.關(guān)于誘導(dǎo)棉花愈傷組織的例子最早來自Baesley的報(bào)道[14].該學(xué)者發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)在MS培養(yǎng)基上的胚珠,可以從珠孔處形成愈傷組織.但遺憾的是,這些愈傷組織在繼代培養(yǎng)后生長(zhǎng)效果變差,沒有進(jìn)行下去.之后,有學(xué)者利用陸地棉Coker 310的子葉誘導(dǎo)愈傷組織并最終獲得了再生植株[15].接下來,隨著棉花組培工作的陸續(xù)開展[16-18],研究者們發(fā)現(xiàn),在諸多的外植體中,下胚軸的誘導(dǎo)能力最強(qiáng),子葉次之；但是當(dāng)適當(dāng)控制不同的激素使用和配合其他條件,其他外植體的誘導(dǎo)效率也會(huì)升高[16-18].例如：劉桂云通過對(duì)激素與溫光條件的調(diào)控,獲得了以戴維遜氏棉葉片為外植體的典型胚狀體[17].張朝軍等通過調(diào)配生長(zhǎng)激素,成功利用棉花(CCRI 24)葉柄進(jìn)行了初生愈傷組織的誘導(dǎo)[18].

1.3 培養(yǎng)基組成

長(zhǎng)期以來,瓊脂(Agar)一直是棉花組織培養(yǎng)研究中最常用的凝固劑.但是,Thomas等[19]研究表明,吉蘭糖膠(Gelrite)可以在一定程度上替代瓊脂,并產(chǎn)生更多的愈傷組織.鄭泗軍等發(fā)現(xiàn),當(dāng)使用吉蘭糖膠作凝固劑時(shí),棉花(河南79)胚性愈傷組織的比例大幅度增加[20].隨后的研究發(fā)現(xiàn)[21],植物凝膠具有含雜質(zhì)少、透氣性高、透明度好、凝固點(diǎn)低,以及不需要二價(jià)陽(yáng)離子等特性,因此較其他凝固劑更具優(yōu)勢(shì)；相對(duì)于瓊脂、吉蘭糖膠,在植物凝膠(Phytagel)作為固化劑的培養(yǎng)基上,陸地棉體胚萌發(fā)率與再生率、再生植株的正常出苗率均得到顯著提高[21].

除了凝固劑,組織基中還需要添加一些必要的營(yíng)養(yǎng)、激素、離子等物質(zhì).培養(yǎng)基組成在誘導(dǎo)的不同階段、不同基因型的相同階段,均存在較大差異(表2),因此是影響棉花組織培養(yǎng)的重要外部因素.通常情況下,在棉花組織培養(yǎng)中,MS培養(yǎng)基是基礎(chǔ)培養(yǎng)基,其他各類培養(yǎng)基多是在此培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改良或擴(kuò)展而來.

表2 不同品種棉花再生體系中的培養(yǎng)基組分

1.4 植物激素

在棉花組培與植株再生過程中,植物激素的種類與濃度是重要的調(diào)控因素,也是最復(fù)雜的因素,與植物的胚胎發(fā)生存在著密切的聯(lián)系.植物常見的內(nèi)源激素包括吲哚-3-乙酸(Indole-3-acetic Acid,IAA)、激動(dòng)素(Kinetin,KT)、脫落酸(Abscisic acid,ABA)、赤霉素(Gibberellin,GA)和乙烯(Ethylene,ETH)等.此外,人們?cè)谏a(chǎn)實(shí)踐中,還合成了諸多植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,如2,4-D-二氯苯氧乙酸鈉(2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid,2,4-D).這些激素在特定棉花品種的組織培養(yǎng)中,均能起到不同程度的促進(jìn)作用(表2).

2,4-D是人工合成的生長(zhǎng)素類似物,常被作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑,用于植物組織培養(yǎng)[26-30].不同生長(zhǎng)素類物質(zhì)對(duì)照使用試驗(yàn)表明,2,4-D對(duì)于促進(jìn)外植體形成愈傷組織的作用效果最為明顯[26].Price和Smith[26]也證明,2,4-D是外植體脫分化和提高出愈率的最有效的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑.同時(shí),在胚狀體發(fā)育和成熟階段,低濃度的2,4-D可以提升胚狀體的誘導(dǎo)率[27].但是有研究證明,較長(zhǎng)時(shí)間的2,4-D處理,會(huì)明顯抑制胚性愈傷組織中的體細(xì)胞胚發(fā)生受體激酶基因GhSERK2的轉(zhuǎn)錄水平,并通過影響內(nèi)源激素平衡,對(duì)胚性愈傷組織的生長(zhǎng)產(chǎn)生不利影響[28].在棉花組織培養(yǎng)中,2,4-D多與其他激素配合使用,很少單獨(dú)使用[29,30].

ABA,因能促進(jìn)葉脫落而得名.在棉花組織培養(yǎng)中,ABA能調(diào)控體胚的發(fā)生.有研究表明,ABA可以通過誘導(dǎo)LEC1(LEAFYCOTYLEDON1)、LEC2(LEAFYCOTYLEDON2)、FUS3(FUSARIUM3)和WUSCHEL等基因的表達(dá),調(diào)控ABA和GA的動(dòng)態(tài)平衡,促進(jìn)棉花(CCRI 24)體胚的產(chǎn)生及成熟[31].

反式-玉米素(trans-Zeatin,ZT)是一種從玉米中分離出來的天然激素,作用效果類似于KT,能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂.單獨(dú)使用ZT即可直接誘導(dǎo)獲得棉花(CCRI 12)胚狀體[32].在ZT與其他激素的互作方面[32],IAA的添加能夠削弱ZT的誘導(dǎo)效果；2,4-D的添加雖然有利于愈傷組織的形成,卻不利于直接誘導(dǎo)出胚性愈傷組織.

除以上這些研究較多的激素外,其他激素有時(shí)也被引入棉花的組織培養(yǎng)之中(表2).如蕓苔素內(nèi)酯(Brassinolide,BR),它是一種天然的甾體化合物,可以作為廣譜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑.有研究者發(fā)現(xiàn)僅使用0.01 ppm的BR,就能從陸地棉Coker 201和Coker 312兩個(gè)品種的外植體中獲得有效保持活力和胚性的愈傷組織[30].

由此可見,激素或添加物的種類與濃度、外植體的選擇等,均會(huì)對(duì)不同品種棉花的組織培養(yǎng)產(chǎn)生重要影響(表3).

表3 激素或添加物對(duì)棉花組培的作用效果

1.5 光照

光照是植物生長(zhǎng)過程中的主要能量來源,同時(shí)又是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境因素.在植物組織培養(yǎng)中,光照對(duì)培養(yǎng)材料的增殖與分化有著重要的影響.

光周期途徑,是植物生態(tài)學(xué)中研究的較為深入的植物開花調(diào)控途徑[35].在植物組織培養(yǎng)中,合適的光周期能夠使外植體材料保持良好的生理狀態(tài),從而影響愈傷組織的形成、胚性愈傷轉(zhuǎn)化等過程[36,37].

光質(zhì)是棉花組織培養(yǎng)中的重要物理因素,不同波長(zhǎng)的光能夠激活植物相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路,使植物通過光質(zhì)感受外界變化,進(jìn)而調(diào)節(jié)自身的生長(zhǎng)發(fā)育[38].單色光可調(diào)節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物的含量,從而提高植物的存活率[39].

在一般的棉花組培工作中,白光的應(yīng)用最普遍.而近期研究發(fā)現(xiàn)[40],紅光條件處理的外植體,分化時(shí)間更短,產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)量更高,表現(xiàn)為：黃褐色、體積適中,鮮重更高.究其原因,可能與棉花體胚基因AGL15、LEC2、WUS在紅光條件下表達(dá)量上調(diào)促進(jìn)愈傷組織產(chǎn)生胚性有關(guān)[41].另外,紅光可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)素的合成及其轉(zhuǎn)運(yùn),一定強(qiáng)度的紅光有益于內(nèi)源生長(zhǎng)素的合成,進(jìn)而有利于植物的生長(zhǎng)發(fā)育[41-43].研究者通過進(jìn)一步的嘗試與探究,發(fā)現(xiàn),在棉花(CCRI 12、CCRI 24)組培中,可以綜合使用白光和紅光,即先利用白光誘導(dǎo)初級(jí)體細(xì)胞胚,然后再利用紅光誘導(dǎo)胚性愈傷組織[44].

藍(lán)光可以影響植物的向光性、促進(jìn)下胚軸伸長(zhǎng)、調(diào)節(jié)氣孔開放、催化相關(guān)酶的合成與控制葉綠體運(yùn)動(dòng)等,是影響植物發(fā)育與生長(zhǎng)的另一重要光質(zhì)[45,46].然而單純地使用某種單色光并不能滿足植物生長(zhǎng)發(fā)育的要求[47].在棉花組培方面,以CCRI 12下胚軸為外植體,魏喜等通過探究不同紅藍(lán)配比的光質(zhì)對(duì)棉花組培的影響,最終發(fā)現(xiàn)藍(lán)∶紅=1∶3的光質(zhì)組合利于胚狀體的誘導(dǎo)[48].

1.6 金屬離子

在植物的組織培養(yǎng)中,除選擇適宜的植物激素外,合理地調(diào)配金屬離子的種類與濃度,也是促進(jìn)植物愈傷組織形成、減少褐變與促進(jìn)植株再生的重要方法.

在棉花(細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)系 G007)的組織培養(yǎng)中,適宜濃度的Zn2+、Ni2+和Ag+能提高出愈速度,對(duì)植株再生過程起到積極作用,而加入Co2+后,作用效果與此相反[49].然而,單獨(dú)使用某種金屬離子往往不能滿足植物快繁的需要.有研究者發(fā)現(xiàn)5 μmol/L的Zn2+和5 μmol/L的 Ni2+的組合不僅能抑制棉花外植體的褐變,而且能正向協(xié)調(diào)愈傷誘導(dǎo)和胚胎發(fā)生[49].

2 棉花組織培養(yǎng)中存在的問題及展望

2.1 存在的問題、可能的成因和解決方法

在棉花組織培養(yǎng)過程中,常見的問題主要為污染、畸形胚和褐變.污染在植物組織培養(yǎng)中屬于常規(guī)問題,一般情況下,只要做到外植體、培養(yǎng)基、操作環(huán)境與培養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格無菌,該問題不難解決.因此,相對(duì)而言,對(duì)于棉花再生體系的構(gòu)建,最棘手的是畸型胚的出現(xiàn)和褐變問題.

畸形胚出現(xiàn)的原因,一段時(shí)間內(nèi)是學(xué)者們探討的熱點(diǎn).有學(xué)者發(fā)現(xiàn),在胚性愈傷組織細(xì)胞中,存在著大量的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變異,因此認(rèn)為染色體變異是畸形胚的主要成因之一[50].還有研究證實(shí),隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),愈傷組織的變異頻率有上升趨勢(shì),變異類型也更加豐富[51].因此,過長(zhǎng)的繼代培養(yǎng)時(shí)間,也可能是造成畸形出現(xiàn)的重要原因.目前,通過調(diào)整外源激素或添加物的種類和濃度,如增加蔗糖(Sucrose)濃度、添加聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)以及選取適當(dāng)種類和濃度的凝固劑等措施,已經(jīng)能夠在一定程度上抑制畸形胚的發(fā)生[52].

棉花愈傷組織的褐變問題是制約其再生體系建立的另一難題.褐變現(xiàn)象往往受外界培養(yǎng)條件與植物本身遺傳特性的共同影響.師海榮等通過實(shí)驗(yàn)比較分析了3個(gè)陸地棉品種(713、百棉1號(hào)、百棉3號(hào))的褐變愈傷組織中多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase) 的活性和棉酚(Gossypol)含量,發(fā)現(xiàn)它們均高于正常的愈傷組織[53],這也印證了在植物生理學(xué)上,被大家熟知的有關(guān)多酚氧化酶與酚類物質(zhì)在有氧條件下被氧化為醌類物質(zhì),抑制了多種酶的活性,從而影響了愈傷組織的正常生長(zhǎng),甚至導(dǎo)致其死亡的觀點(diǎn)[54].有學(xué)者利用活性炭(Activated Carbon)的吸附性,吸收組培環(huán)境中對(duì)植物細(xì)胞不利的酚類化合物和過量添加物[55],達(dá)到了抑制褐變現(xiàn)象的效果.同時(shí),改變碳源也是應(yīng)對(duì)褐變現(xiàn)象的新思路.如Sunnichan 等[56]使用甘露糖(Aldohexos)作為培養(yǎng)基中的唯一碳源,在從Coker 310外植體誘導(dǎo)為愈傷組織到體胚發(fā)生的整個(gè)階段中,都沒有出現(xiàn)組織褐變現(xiàn)象.

2.2 展望

隨著越來越多作物全基因組測(cè)序的完成、諸多基因改造技術(shù)如Crispr等的不斷完善,作物分子育種和基因革新已經(jīng)成為新時(shí)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的必然趨勢(shì).在此背景下,如何合理地將植物組織培養(yǎng)和分子改良有機(jī)結(jié)合,將是今后檢測(cè)基因功能、評(píng)價(jià)作物性狀和構(gòu)建快繁體系的關(guān)鍵.但是,棉花的組織培養(yǎng)一直是公認(rèn)的技術(shù)難題,盡管陸續(xù)有不同的學(xué)者在特定的棉花品種上成功培育出了再生體系,但是這些再生體系往往缺少通用性和推廣性.此外,以往的研究在有效誘導(dǎo)胚性愈傷、控制畸形胚和褐化現(xiàn)象以及縮短組培周期等方面,還缺少明顯的突破,這種現(xiàn)狀嚴(yán)重限制了棉花遺傳育種的長(zhǎng)足發(fā)展.因此,進(jìn)一步闡明外界物理因素與棉花生理功能之間的關(guān)系,縮短繼代周期、快速提升體胚誘導(dǎo)和植株再生,同時(shí)有效控制畸形胚和褐變現(xiàn)象,兼顧不同品種棉花的遺傳差異,尋找更為高效、廣譜的棉花再生體系,將成為今后研究與發(fā)展棉花組織培養(yǎng)的主要方向.