中生菌素對楊樹爛皮病的抑菌機制初報

矯麗曼

(遼寧省楊樹研究所,遼寧 蓋州 115213)

楊樹具有生長快、抗逆性強、輪伐期短、產(chǎn)量高、易于更新等特點，作為主要造林樹種在遼寧省內(nèi)廣泛栽培[1]。但一些地區(qū)不能做到合理造林、生態(tài)功能減退、病蟲害防治技術(shù)缺乏等原因致使楊樹病蟲害發(fā)生嚴重，給林業(yè)生產(chǎn)造成巨大損傷，威脅著楊樹產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-3]。

楊樹爛皮病又稱腐爛病，病原有性階段為污黑腐皮殼(ValsasordidaNit.)，無性階段為金黃殼囊孢菌(Cytosporachrysosperma(Pers.) Fr.)[3]。通常分為枝枯型和干腐型。枝枯型主要發(fā)生在苗木、幼樹及大樹的枝條，發(fā)病初期病斑呈暗灰色，后期散生許多黑色小點，分生孢子器[4-5]；干腐型主要發(fā)生于主干、大枝和分杈處，發(fā)病初期病斑呈暗褐色、水漬狀，后期在病斑上長出許多針狀黑色小突起，即分生孢子器。爛皮病是楊樹重要的枝干病害之一[6]，如發(fā)生日灼、凍害、干旱等不利于楊樹生長環(huán)境條件，就會引起楊樹干部創(chuàng)傷、樹勢衰弱、爛皮病大面積發(fā)生，導致被害樹木樹勢衰弱，甚至枯死，嚴重時造成楊樹大片死亡[7-8]。

楊樹爛皮病常采用化學農(nóng)藥防治，但化學農(nóng)藥的過度使用造成了很多負面影響，如破壞生態(tài)平衡、產(chǎn)生抗藥性等。如何安全有效地使用生物農(nóng)藥，一直是林業(yè)工作者研究的熱點問題。研究選用了一種新型生物發(fā)酵殺菌劑中生菌素，初探其對楊樹爛皮病病原菌的抑菌機制，為楊樹爛皮病病害科學防治提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 試驗材料

1.1 菌株

楊樹爛皮病(88513)，購自中國林業(yè)科學院林業(yè)菌種保存中心。

1.2 藥劑

有效成分含量3%中生菌素(江西正邦作物保護有限公司)，考馬斯亮藍G-250(國藥集團化學試劑有限公司)，牛血清白蛋白(BioFroxx)，丙二醛試劑盒(南京建成A003-2)。

2 試驗方法

2.1 中生菌素對楊樹爛皮病菌絲生長及生物量的影響

根據(jù)藥劑使用說明書用量配成多個梯度濃度的溶液，在無菌條件下，加入到未凝固的PDA固體培養(yǎng)基中，使藥劑在培養(yǎng)基中的最終稀釋400、600、800、1000倍液，倒入無菌平皿中。用直徑5 mm無菌打孔器在預先培養(yǎng)好的楊樹爛皮病病原菌菌絲平面上打孔，待培養(yǎng)基冷卻后用無菌鑷子夾取一片圓形菌絲片接種于培養(yǎng)基中央，用封口膜封好，放置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中，倒立暗培養(yǎng)，同時以加無菌水的培養(yǎng)基作對照，每處理5次重復。采用十字交叉法每隔12 h觀察并測定菌絲生長的直徑，取各處理的平均值[9-10]。

將PDA液體培養(yǎng)基等量分裝于大三角瓶中，滅菌待冷卻后在無菌條件下加入不同質(zhì)量的中生菌素藥劑，使藥劑在液體培養(yǎng)基中最終稀釋400、600、800、1000倍液，再接入直徑5 mm的菌絲片，放置于25 ℃搖床中培養(yǎng)。以不加藥劑為對照組，當對照組長滿整個培養(yǎng)基時，終止培養(yǎng)，取出菌絲用無菌蒸餾水沖洗干凈，用8層紗布過濾擰干，冷凍干燥后稱量干重[11-12]。

2.2 中生菌素對楊樹爛皮病菌絲內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

以牛血清白蛋白為蛋白標準品，采用考馬斯亮藍G-250染色法測定菌絲內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量[13]。取各處理干菌絲100 mg放于無菌研缽中，迅速加液氮研磨成粉末，然后用預冷生理鹽水稀釋至10 mL，取樣品液0.1 mL，加入去離子水0.9 mL，再加入考馬斯亮藍溶液5mL，混勻后放置2 min，以加等量無菌去離子水為對照，每個處理3次重復。以對照管調(diào)零，測量各樣品OD595nm,并通過蛋白標準曲線計算樣品蛋白含量[14-15]。

2.3 中生菌素對楊樹爛皮病菌菌絲體內(nèi)丙二醛(MDA)含量的影響

MDA含量測定采用TBA法。取各處理干菌絲100 mg，放于冷凍研缽中加液氮低溫研磨成粉末，用預冷生理鹽水溶液稀釋至10 mL,2500 r/min 4 ℃超低溫離心5 min，取上清液按照南京建成A003-1試劑盒說明書進行菌絲體內(nèi)丙二醛含量的測定[16-17]。

3 結(jié)果與分析

3.1 中生菌素對楊樹爛皮病菌菌絲生長及生物量的影響

楊樹爛皮病病原菌生長緩慢。當培養(yǎng)10 d時，對照菌絲已延伸至平皿邊緣，且菌絲為白色，未產(chǎn)生孢子；而在含中生菌素各培養(yǎng)基中菌絲向外延伸很小，且菌絲均為白色。各處理菌絲生長抑制率見表1。當中生菌素稀釋倍數(shù)小于800倍液時，抑菌率大于85%，且各處理菌絲生長直徑在P<0.05水平上存在顯著性差異，抑菌率也存在顯著性差異。可見隨著中生菌素藥劑稀釋倍數(shù)的減小，抑制率逐漸增大。

楊樹爛皮病菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 d時，對照組菌絲已長滿整個液體發(fā)酵培養(yǎng)基。結(jié)果如表1，對照組100 mL發(fā)酵液中菌絲干重為(74.78±1.24) mg，而處理組菌絲干重明顯低于對照組，800倍稀釋液處理組100 mL發(fā)酵液的菌絲干重為(7.99±0.98) mg，而400倍稀釋液的為(2.97±0.49) mg?？梢姴煌♂尡稊?shù)中生菌素對楊樹爛皮病菌絲生長及生物量都有影響，能顯著抑制菌絲的生長。

表1 中生菌素對楊樹爛皮病菌菌絲生長及生物量的抑制作用

3.2 中生菌素對楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

以牛血清白蛋白為標準樣品繪制蛋白質(zhì)標準曲線，結(jié)果見圖1，蛋白質(zhì)含量(Y)與吸光值(x)的回歸方程為：Y=0.0066x +0.0123，相關(guān)系數(shù)R2=0.9989。根據(jù)試驗測得的各處理吸光值(OD595)計算出相應的蛋白質(zhì)含量。如圖2，培養(yǎng)10 d后，對照菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量為(6.48±1.05) μg/mL，處理組的可溶性蛋白質(zhì)含量明顯低于對照組，800倍稀釋液的處理組菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量為(0.81±0.16) μg/mL，并隨著稀釋倍數(shù)減小菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)含量也隨之減少?？梢娭猩啬苊黠@抑制楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)合成，導致可溶性蛋白質(zhì)含量降低。

圖1 蛋白T質(zhì)標準曲線

各柱形圖上的小寫字母表示差異顯著性水平(P<0.05)

3.3 中生菌素對楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)丙二醛(MDA)含量的影響

結(jié)果如圖3，當培養(yǎng)10 d后，對照組菌絲體內(nèi)丙二醛含量為(1.18±0.18) mmol/g，800倍稀釋液的處理組菌絲體內(nèi)丙二醛含量為(2.03±0.23) mmol/g，而400倍稀釋液的處理組菌絲體內(nèi)丙二醛含量為(2.67±0.30) mmol/g，并在P<0.05水平上存在顯著性差異?？梢娭猩厮巹┨幚斫M菌絲體內(nèi)丙二醛的含量明顯高于對照組，表明菌絲細胞在受到藥劑脅迫時，細胞膜受到破壞，膜脂化加劇，產(chǎn)生大量的MDA。

各柱形圖上的小寫字母表示差異顯著性水平(P<0.05)

4 結(jié)論與討論

初步報道了中生菌素對楊樹爛皮病的抑菌機制，主要從對菌絲生長和生物量的影響及對菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)和丙二醛含量四個方面進行了研究。初步確定中生菌素對楊樹爛皮病菌絲生長及生物量有明顯的抑制作用；能顯著抑制楊樹爛皮病菌絲體內(nèi)可溶性蛋白質(zhì)合成，導致體內(nèi)蛋白質(zhì)含量降低；并對菌絲細胞有很大破壞作用，細胞膜脂質(zhì)過氧化程度增大，細胞受損嚴重，導致丙二醛含量增大。

中生菌素是一種新型農(nóng)用抗生素、較廣的保護型殺菌劑。本文僅從幾個方面進行了抑菌機制研究，在今后試驗中，還應該從抑制菌絲體內(nèi)各種合成和代謝酶活性等方面進行更深層次的研究，較詳細分析中生菌素的抑菌機理。通過試驗證實中生菌素對楊樹爛皮病有較好的抑制效果，可以應用于林業(yè)真菌性病害的防治，為林業(yè)病害科學防治提供一定的理論依據(jù)。