高云航，張紅偉，馬紅霞，么乃全，徐鳳宇

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.動(dòng)物生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)是人和動(dòng)物的共生菌，部分菌株致肺炎、敗血癥、子宮內(nèi)膜炎等疾??；高毒力肺炎克雷伯菌(HypervirulentK.pneumoniae，hvKp)除引起社區(qū)獲得性肺炎(Community-acquired pneumonia，CAP)外[1]，也引起伴有轉(zhuǎn)移膿毒性病變和其他化膿性膿腫和肝膿腫[2]，其所致醫(yī)院獲得性肺炎(Hospital-acquired pneumonia，HAP)的28 d病死率達(dá)39.6%[1]。莢膜多糖是肺炎克雷伯菌的重要毒力因子，K1、K2、K5、K20、K54和K57等莢膜型與社區(qū)化膿性感染相關(guān)[3]。隨著抗生素使用量的增長(zhǎng)，肺炎克雷伯菌呈現(xiàn)明顯耐藥現(xiàn)象[4]，加劇了控制該菌感染的難度。為緩解細(xì)菌耐藥性蔓延，開(kāi)發(fā)補(bǔ)充或替代抗生素的抗菌劑用于防治細(xì)菌感染已成當(dāng)務(wù)之急。

毒性噬菌體除復(fù)制后具有特異殺菌作用外[5]，其產(chǎn)生的解聚酶可清除莢膜、生物被膜、減弱細(xì)菌的毒力[6-7]。Wang等表達(dá)并純化了vB_KpnP_IME321株噬菌體的莢膜解聚酶Dp4，用其預(yù)處理實(shí)驗(yàn)小鼠，在致死量宿主菌Kp409株K.pneumoniae感染后，實(shí)驗(yàn)小鼠全部存活，感染宿主菌后口服該酶，實(shí)驗(yàn)小鼠存活率顯著提高[6]。噬菌體或脂質(zhì)體攜帶的雞尾酒噬菌體可保護(hù)所有肺炎克雷伯菌感染的BALB/c小鼠[8]。更可喜的是，肺炎克雷伯菌K7株噬菌體GH-K3的抗性突變株K7RR毒力遠(yuǎn)低于K7株[9]?？梢?jiàn)噬菌體及其相關(guān)有效成分非常有希望成為潛在的新型抗菌劑。本研究以分離自豬子宮內(nèi)膜炎的肺炎克雷伯菌為宿主，分離毒性噬菌體，在鑒定基礎(chǔ)上檢測(cè)了其主要生物學(xué)特性，為更深入研究和應(yīng)用肺炎克雷伯菌噬菌體提供資料。

1 材料與方法

1.1 菌株 豬源肺炎克雷伯菌KL1株、KL2株、KL3株、KL4株、KL5株、KL6株、KM1株和KM2株分離自肺炎患豬，414株、KE1株、KE2株、KE3株、KE4株和KE5株分離自子宮內(nèi)膜炎患豬，共14株，均由本實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存。

1.2 主要試劑與儀器 上層LB半固體培養(yǎng)基、下層LB固體培養(yǎng)基、2×LB培養(yǎng)液、SM液等依標(biāo)準(zhǔn)方法配制。CP100MX超速離心機(jī)為日本日立公司產(chǎn)品；TEM-100CX透射電鏡為日本TEOLLTD公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 宿主菌篩選 復(fù)蘇分離自子宮內(nèi)膜炎患豬的6株肺炎克雷伯菌，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，分別取150 μL涂于LB平板，靜置后將頭孢噻肟等12種藥敏紙片貼于平板上，大腸桿菌ATCC25922株作質(zhì)控菌株，培養(yǎng)16 h后觀察，根據(jù)動(dòng)物源及人醫(yī)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)細(xì)菌藥敏試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)[10-11]評(píng)估。

1.3.2 噬菌體分離、純化 以篩選的多重耐藥肺炎克雷伯菌為宿主，將采自長(zhǎng)春市某豬場(chǎng)、牛場(chǎng)健康豬、牛的新鮮糞便的新用生理鹽水懸浮，靜置后取上清8 000 r/min離心20 min，取0.22 μm濾器過(guò)濾后濾液10 mL加10 mL 2×LB液體培養(yǎng)基中，加入新培養(yǎng)的宿主菌、CaCl2溶液(終濃度1 mmol/L)，100 r/min培養(yǎng)8 h。

噬菌體富集：離心培養(yǎng)液取上清過(guò)濾，如前述方法富集4次后再離心，過(guò)濾得噬菌體原液。

點(diǎn)滴法驗(yàn)證原液：將80 μL新培養(yǎng)宿主菌涂于LB平板，靜置20 min，滴5 μL噬菌體原液，培養(yǎng)12 h觀察結(jié)果。

純化噬菌體：取100 μL稀釋噬菌體原液，與100 μL新培養(yǎng)的宿主菌液、CaCl2濃縮液混勻，室溫靜置15 min，加入5 mL 50 ℃上層LB培養(yǎng)基，混勻后速傾于下層LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h。用滅菌牙簽挑取相對(duì)大而透明的單斑于1 mL SM液中，4 ℃ 冰箱中靜置12 h，離心、稀釋再鋪雙層平板，重復(fù)多次，純化噬菌體。

1.3.3 噬菌體裂解譜測(cè)定 以宿主菌外的13株肺炎克雷伯菌為受試菌，參考1.3.2中點(diǎn)滴法操作。

1.3.4 透射電鏡觀察 取稀釋的純化噬菌體，培養(yǎng)成噬菌斑網(wǎng)，加入3 mL SM液，4 ℃冰箱中過(guò)夜，吸出噬菌體，12 000 r/min離心20 min，取上清滴于銅網(wǎng)上，靜置1 min，2%磷鎢酸負(fù)染90 s，透射電鏡觀察。

1.3.5 氯仿、乙醚敏感性試驗(yàn) (1)氯仿敏感性試驗(yàn)：將950 μL噬菌體與50 μL氯仿混勻，設(shè)對(duì)照組，4 ℃冰箱過(guò)夜，測(cè)效價(jià)。(2)乙醚敏感性試驗(yàn)：將800 μL噬菌體與200 μL乙醚混勻，設(shè)對(duì)照組，冰浴振蕩2 h，3 000 r/min離心15 min，取水相測(cè)效價(jià)。

1.3.6 熱及酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn) 設(shè)7個(gè)水浴溫度(40～ 70 ℃，間隔5 ℃)，分別放入盛1 mL噬菌體的EP管，作用20、40 min和60 min后分別取300 μL，冷卻測(cè)效價(jià)。

分裝900 μL pH 3～13的液體LB，37 ℃預(yù)熱，分別加入100 μL噬菌體，混勻，37 ℃培養(yǎng)3 h，測(cè)效價(jià)。

1.3.7 最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定 將活菌計(jì)數(shù)的宿主菌與已知效價(jià)的噬菌體按表1稀釋并等量混勻，于37 ℃搖床中培養(yǎng)5 h，4 ℃、12 000 r/min離心30 min，取上清過(guò)濾測(cè)感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)。

1.3.8 一步生長(zhǎng)曲線繪制 按最佳MOI混勻噬菌體與宿主菌，37 ℃水浴中靜置15 min，4 ℃、12 000 r/min 離心1 min，棄上清，用液體LB懸浮、洗滌沉淀2次，加37 ℃預(yù)熱液體LB，37 ℃ 50 r/min培養(yǎng)，每10 min取500 μL，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，取上清測(cè)效價(jià)，以效價(jià)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)繪生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 宿主菌篩選 由藥敏試驗(yàn)知肺炎克雷伯菌414株僅對(duì)頭孢唑啉、頭孢噻肟、新霉素和阿奇霉素敏感，對(duì)諾氟沙星、阿米卡星、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素等耐藥，為6株試驗(yàn)菌中抗菌譜最寬者，選為宿主菌。

2.2 噬菌體分離純化 經(jīng)多次分離，從新鮮健康豬糞、牛糞中各得到1株噬菌體，分別經(jīng)4次挑單斑純化，得邊緣整齊、透亮的均一噬菌斑(封底彩版圖1)，命名為KP1、KP2。

圖1 噬菌體KP1、KP2純化后噬菌斑Fig.1 The plaques of phage KP1,KP2 after purification

2.3 噬菌體裂解譜測(cè)定 檢測(cè)表明，KP1不裂解13株受試菌，KP2可裂解KL6株，裂解率分別為7%、14%，說(shuō)明2株噬菌體特異性較強(qiáng)。

2.4 噬菌體電鏡觀察 透射電鏡觀察到KP1、KP2均呈蝌蚪狀復(fù)合對(duì)稱，有正二十面體頭部、可收縮尾，可見(jiàn)尾板，屬肌尾噬菌體科；KP1頭長(zhǎng)寬(78±1.5)nm，尾長(zhǎng)(109±2)nm；KP2頭長(zhǎng)寬(72.92±3.81)nm，尾長(zhǎng)(96.68±5.22)nm(封底彩版圖2)。

圖2 噬菌體KP1、KP2電鏡圖(40.0 k×)Fig.2 Electron micrograph of phage KP1,KP2 (40.0 k×)

2.5 氯仿、乙醚敏感性試驗(yàn) KP1、KP2經(jīng)氯仿作用后，效價(jià)分別為6×108PFU/mL、1.06×109PFU/mL，經(jīng)乙醚作用后效價(jià)分別為1.69×108PFU/mL、1.56×108PFU/mL，與對(duì)照組效價(jià)(KP1為9.2×108PFU/mL、KP2為5×108PFU/mL)差異不顯著。說(shuō)明噬菌體KP1、KP2對(duì)乙醚和氯仿不敏感，推測(cè)其無(wú)囊膜。

2.6 熱及酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn) 熱穩(wěn)定性結(jié)果見(jiàn)封底彩版圖3，KP1、KP2在40～60 ℃時(shí)，效價(jià)變化不明顯，70 ℃作用20 min以上時(shí)，二者被滅活。

圖3 噬菌體KP1、KP2的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of phage KP1,KP2A：KP1；B：KP2

KP1在pH 5～11條件下效價(jià)變化不明顯，對(duì)pH 4和12的環(huán)境也有一定耐受性，在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境中(pH≤3或≥13時(shí))被滅活；KP2在pH 4～10的環(huán)境下效價(jià)基本穩(wěn)定，對(duì)pH 3和11的環(huán)境有較好耐受性，在強(qiáng)酸或堿環(huán)境下(pH≤2或≥12時(shí))被滅活(圖4)。

圖4 噬菌體KP1、KP2的pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of phage KP1,KP2A：KP1；B：KP2

2.7 噬菌體的最佳MOI測(cè)定 當(dāng)MOI為0.1時(shí)，噬菌體KP1效價(jià)為1.6×109PFU/mL；MOI為0.01時(shí)，KP2效價(jià)為1.05×109PFU/mL，分別為7個(gè)MOI中最高值，為最佳MOI(表1)。

2.8 噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線 繪制噬菌體KP1、KP2的一步生長(zhǎng)曲線(圖5)，發(fā)現(xiàn)其繁殖規(guī)律圖像分別基本符合四次函數(shù)y=0.000 4x4-0.016x3+0.212 9x2-0.606 5x+4.770 8和三次函數(shù)y=-0.003 8x3+0.100 1x2-0.400 8x+4.731 1。KP1、KP2的潛伏期分別為20 min、30 min，爆發(fā)期分別約60 min、80 min，爆發(fā)量分別約為15 PFU/cell、11 PFU/cell。

圖5 噬菌體KP1、KP2的一步生長(zhǎng)曲線Fig.5 One-step growth curve of phage KP1,KP2A：KP1；B：KP2

3 討論

近年來(lái)，隨著對(duì)肺炎克雷伯菌耐藥現(xiàn)象的關(guān)注，能裂解該菌的噬菌體也被廣泛關(guān)注和研究。Gao等[12]從北京某醫(yī)院廢水中分離到KN2莢膜型肺炎克雷伯菌的毒性、短尾噬菌體vB_KpnP_IME337，潛伏期為10 min，基因組為44 266 bp；Morozova等[13]報(bào)道了多重耐藥肺炎克雷伯菌短尾噬菌體KP8基因組為73 679 bp；Tan等[14]從上海某醫(yī)院分離了ST11型產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)的短尾噬菌體117和31；Shi等[15]分離CRKP的毒性、短尾噬菌體kpssk3，潛伏期也為10 min，可裂解受試27株CRKP臨床分離株，在溫度和pH改變時(shí)穩(wěn)定性較好，基因組為40 539 bp；短尾噬菌體vB_KpnP_KL106-ULIP47 和vB_KpnP_KL106-ULIP54由Thiry等[16]分離；Cai等[17]從醫(yī)院污水分離的長(zhǎng)尾噬菌體vB_KpnS_GH-K3(簡(jiǎn)稱GH-K3)的爆發(fā)量為291 PFU/cell，在pH 6～10和50 ℃以下穩(wěn)定，基因組為49 427 bp；長(zhǎng)尾噬菌體TSK1有狹窄宿主譜，在pH 7和37 ℃下穩(wěn)定，基因組為49 836 bp[18]；ZCKP1是從埃及Giza市的淡水中分離的肌尾噬菌體，基因組為150.9 kb[19]；噬菌體vB_Kpn_F48也屬于肌尾噬菌體科，對(duì)溫度和pH變化高度穩(wěn)定，基因組為171 kb[20]。本試驗(yàn)從健康豬、牛糞中各分離到1株 毒性、無(wú)囊膜肌尾噬菌體，裂解譜較窄，在40～60 ℃、pH 4～11的條件下穩(wěn)定性較好，與kpssk3、TSK1、vB_Kpn_F48、GH-K3穩(wěn)定性相近，KP1、KP2最佳MOI分別為0.1、0.01，潛伏期分別為20 min、30 min，爆發(fā)期分別約60 min、80 min，較前述報(bào)道的噬菌體潛伏期略長(zhǎng)，爆發(fā)量約分別為15 PFU/cell、11 PFU/cell，約為GH-K3的1/20、1/30。

對(duì)肺炎克雷伯菌噬菌體功能研究也有相關(guān)報(bào)道，Domingo等[21]分析了所分離的4株感染K22莢膜型的肺炎克雷伯菌短尾噬菌體序列，表明其有假定的編碼解聚酶基因；ZCKP1在25 ℃時(shí)可使宿主菌K.pneumoniaeKP/01的濃度降低超過(guò)2log10CFU/mL，50 PFU/cell的ZCKP1可使宿主菌生物被膜量降低50%[19]；TSK1在感染之初的14 h也可減慢肺炎克雷伯菌繁殖，用TSK1處理后可使培養(yǎng)的肺炎克雷伯菌生物被膜量減少85%～100%，而用TSK1前處理在培養(yǎng)的最初24 h使宿主菌減少比例大于99%[18]；117株噬菌體治療Kp36所致尿路感染模型初始也表現(xiàn)出很強(qiáng)裂解能力[14]；Thiry等[16]以梅隆線蟲(chóng)幼蟲(chóng)為模型，發(fā)現(xiàn)用噬菌體vB_KpnP_KL106-ULIP47 和vB_KpnP_KL106-ULIP54治療肺炎克雷伯菌ST258株感染，用vB_KpnP_K1-ULIP33治療ST23株感染，可使死亡率從70%降至20%。kpssk3、vB_Kpn_F48無(wú)抗生素抗性基因、毒力因子基因及整合酶基因[15，20]。本試驗(yàn)結(jié)果雖為噬菌體用于防控耐藥性肺炎克雷伯菌感染提供了資料，但2株噬菌體是否攜帶抗生素抗性、毒力、整合酶基因及對(duì)可裂解菌所致疾病的防治效果均有待深入探究。