吳蘇君，李 希，王 曦

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030032)

細(xì)胞體外增殖技術(shù)被稱(chēng)為細(xì)胞培養(yǎng)，廣泛應(yīng)用于科研、教學(xué)、臨床試驗(yàn)、制備生物制品等領(lǐng)域，其中污染控制是關(guān)鍵。能導(dǎo)致細(xì)胞污染的微生物很多，最為常見(jiàn)的是支原體[1]。由于缺乏細(xì)胞壁的支撐，支原體可變形通過(guò)0.22 μm濾膜，常用抗生素如青霉素和鏈霉素對(duì)其去除效果不佳[2]。世界范圍內(nèi)使用中的細(xì)胞系支原體污染發(fā)生率為30%～60%[3-5]，國(guó)內(nèi)來(lái)源的細(xì)胞株系支原體污染發(fā)生率高達(dá)60%[6]。支原體污染初期，細(xì)胞形態(tài)變化不甚明顯，支原體滴度隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，最高可達(dá)109個(gè)/mL。污染發(fā)生后期，支原體改變細(xì)胞DNA/RNA及蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致其變形、死亡[7]。因此，在污染初期盡快進(jìn)行支原體檢測(cè)、去除尤為重要。目前檢測(cè)及去除支原體污染的方法很多。呂梁黑山羊作為山西省地方優(yōu)良品種，具有珍貴的生物種用價(jià)值[8]。本試驗(yàn)采取呂梁黑山羊耳緣組織培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，結(jié)合運(yùn)用高倍顯微鏡直接觀察法和DNA熒光染色法，快速發(fā)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的支原體污染，利用支原體抗生素Plasmocin將其去除，檢測(cè)去除效果，進(jìn)而構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞培養(yǎng)體系，為后續(xù)探究呂梁黑山羊種質(zhì)資源的利用提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 呂梁黑山羊(0～3月齡)耳緣組織，采自山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所克隆基地試驗(yàn)羊場(chǎng)；胎牛血清FBS，購(gòu)自Hyclone公司；DMEM，購(gòu)自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、Hoechst 33342，均購(gòu)自Sigma公司；PlasmocinTMtreatment，購(gòu)自InvivoGen公司；細(xì)胞cDNA提取試劑盒、DL2 000 DNA Marker，均購(gòu)自TIANGEN公司；RT-PCR試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 呂梁黑山羊耳緣成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、凍存和復(fù)蘇 選擇0～3月齡的呂梁黑山羊，獲取耳尖皮膚組織(1 cm2)進(jìn)行原代培養(yǎng)。每隔2 d更換培養(yǎng)液，5～7 d后觀察組織塊周?chē)袩o(wú)細(xì)胞遷出，待原代培養(yǎng)的單層細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)或冷凍保存。細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)，觀察細(xì)胞活力狀態(tài)。

1.2.2 支原體污染檢測(cè) 高倍顯微鏡直接觀察：疑為支原體污染的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞在高倍顯微鏡下直接觀察，根據(jù)其形態(tài)學(xué)變化，對(duì)比判斷有無(wú)污染。DNA熒光染色法：疑為支原體污染的待測(cè)細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞在室溫下加入濃度為5 μg/mL的Hoechst 33342染色30 min，DPBS洗滌3次，熒光顯微鏡紫外光下觀察，判斷有無(wú)支原體污染。

1.2.3 支原體污染去除 疑為支原體污染的待測(cè)細(xì)胞更換添加25 μg/mL Plasmocin的細(xì)胞培養(yǎng)液，正常傳代培養(yǎng)，連續(xù)藥物處理14 d。

1.2.4 藥物處理后支原體污染檢測(cè) 用高倍顯微鏡直接觀察法和DNA熒光染色法分別對(duì)比藥物處理試驗(yàn)組、對(duì)照組，方法同上。PCR法檢測(cè)：根據(jù)16S rRNA支原體種屬特異性區(qū)域設(shè)計(jì)引物(上游引物：5′-CACAATGGGCGAAAGCCTGAT-3′；下游引物：5′-CATCGTTTACGGCGTGGACTACC-3′)，產(chǎn)物長(zhǎng)度為453 bp。使用cDNA提取試劑盒提取藥物處理試驗(yàn)組、對(duì)照組細(xì)胞的基因組cDNA。以其為模板進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系(總體積20 μL)：上下游引物各0.8 μL、ExTap酶10 μL、模板2 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL，加ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并觀察。

1.2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 Plasmocin連續(xù)處理14 d的試驗(yàn)組細(xì)胞匯合度達(dá)到80%時(shí)，消化重懸細(xì)胞，以1×104個(gè)/孔接種至24孔板中培養(yǎng)。每24 h計(jì)數(shù)細(xì)胞，每次計(jì)數(shù)重復(fù)3次，求平均值，連續(xù)計(jì)數(shù)7 d后，根據(jù)時(shí)間和細(xì)胞密度繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞原代、傳代培養(yǎng)及凍存、復(fù)蘇培養(yǎng) 通過(guò)組織塊貼壁培養(yǎng)法成功分離出呂梁黑山羊耳緣組織成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)10 d左右能分辨出組織塊周?chē)兴笮吻疫吘壛Ⅲw的成纖維細(xì)胞。形態(tài)學(xué)觀察可見(jiàn)細(xì)胞主要呈梭形、多角形或不規(guī)則形，細(xì)胞排列分散，見(jiàn)封三彩版圖1A；細(xì)胞傳代后生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形態(tài)正常，見(jiàn)封三彩版圖1B；細(xì)胞復(fù)蘇后活力達(dá)到80%，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形態(tài)正常，見(jiàn)封三彩版圖1C。

圖1 呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞培養(yǎng)Fig.1 Lyuliang black goat fibroblast cultureA：細(xì)胞原代培養(yǎng)(40×)；B：細(xì)胞傳代培養(yǎng)(200×)；C：細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)(200×)A:Cell primary culture(40×)；B:Cell passage culture(200×)；C:Cell resuscitation culture(200×)

2.2 高倍顯微鏡直接觀察 疑為支原體污染的待測(cè)細(xì)胞折光性差，扁平分散，培養(yǎng)皿底部有黑點(diǎn)，見(jiàn)圖2A；對(duì)照組細(xì)胞大多呈梭形，邊緣立體，培養(yǎng)皿底部未見(jiàn)明顯黑點(diǎn)，見(jiàn)圖2B。但肉眼觀察比較細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并不顯著。

圖2 顯微鏡下觀察呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞(200×)Fig.2 Observe the Lyuliang black goat fibroblast under the microscope(200×)A：疑被支原體污染的細(xì)胞；B：對(duì)照組A:Suspicious Mycoplasma contaminated cells；B:Control group

2.3 DNA熒光染色法 疑為支原體污染的待測(cè)細(xì)胞在細(xì)胞核外可見(jiàn)散在熒光，推測(cè)被支原體污染，見(jiàn)封三彩版圖3A；對(duì)照組細(xì)胞核區(qū)可見(jiàn)邊緣整齊清晰的熒光，核外無(wú)熒光，見(jiàn)封三彩版圖3B。

圖3 熒光顯微鏡下觀察呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞(200×)Fig.3 Observe the Lyuliang black goat fibroblast under the microscope(200×)A：疑被支原體污染的細(xì)胞，核外有散在熒光(箭頭)；B：對(duì)照組A:Suspicious Mycoplasma contaminated cells，had scattered fluorescence outside the nucleus(Arrow)；B:Control group

2.4 支原體污染藥物處理后檢測(cè) 使用Plasmocin藥物連續(xù)處理14 d后，高倍顯微鏡下肉眼觀察細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)立體，生長(zhǎng)均勻，培養(yǎng)皿底部黑點(diǎn)明顯減少，見(jiàn)封三彩版圖4A；對(duì)照組見(jiàn)封三彩版圖4B。熒光試劑Hoechst 33342染色觀察DNA，藥物處理試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞均只見(jiàn)胞核，核外未見(jiàn)散在熒光，見(jiàn)封三彩版圖4C、4D。PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，藥物處理試驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞條帶均呈陰性，見(jiàn)封三彩版圖4E。

圖4 藥物處理呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞后支原體檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Detection results of Mycoplasma after drug treatment with the Lyuliang black goat fibroblasA：顯微鏡下觀察藥物處理組細(xì)胞(200×)；B：顯微鏡下觀察對(duì)照組細(xì)胞(200×)；C：熒光顯微鏡下觀察藥物處理組細(xì)胞(200×)；D：熒光顯微鏡下觀察對(duì)照組細(xì)胞(200×)；E：支原體PCR檢測(cè)(M：DL2 000相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：藥物處理試驗(yàn)組；2：對(duì)照組)A:Observe the drug treatment experimental group under the microscope(200×)；B:Observe the control group under the microscope(200×)；C:Observe the drug treatment experimental group under the fluorescence microscope(200×)；D:Observe the control group under the fluorescence microscope(200×)；E:PCR detection of Mycoplasma(M:DL2 000 marker；1:Drug treatment experimental group；2:Control group)

2.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制 用Plasmocin處理細(xì)胞14 d，根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，以單位細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果如圖5所示，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S型分布，1～3 d細(xì)胞處于適應(yīng)期，生長(zhǎng)緩慢；3～6 d細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)旺盛；6～7 d細(xì)胞處于平臺(tái)期。

圖5 呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.5 The growth curve of the Lyuliang black goat fibroblast

3 討論

支原體污染在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生率很高，細(xì)胞被支原體污染后，其功能及代謝均受到影響。支原體可以吸附到細(xì)胞表面，破壞細(xì)胞膜的完整性，影響細(xì)胞信號(hào)傳遞；還可以進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，消耗細(xì)胞中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，造成細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢甚至停止；使pH降低，影響細(xì)胞代謝；引起細(xì)胞染色體畸變或數(shù)量變化[9-14]。此外，支原體代謝產(chǎn)物還能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生免疫抑制和免疫損傷[15]、引起胞膜相變運(yùn)動(dòng)等[16-17]。值得注意的是，支原體在與宿主細(xì)胞的長(zhǎng)期共存中形成了可逃避自噬的胞內(nèi)生存機(jī)制[18]，支原體的滴度將隨著污染時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高[19]。因此，在支原體污染早期就對(duì)支原體進(jìn)行去除對(duì)保護(hù)細(xì)胞尤為重要。

目前，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中支原體的方法有很多種，如顯微鏡觀察法、DNA熒光染色法、電鏡、ELISA法、支原體直接培養(yǎng)法、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及熒光定量PCR等[20-23]，但均存在一些缺點(diǎn)?，F(xiàn)從試驗(yàn)周期、優(yōu)缺點(diǎn)、價(jià)格、適用范圍等方面將常用的4種支原體污染檢測(cè)方法的進(jìn)行比較[20]，見(jiàn)表1。

表1 4種常用支原體污染檢測(cè)方法比較Table 1 Comparison of four common detection methods of Mycoplasma contamination

高倍顯微鏡直接觀察法：支原體污染早期，細(xì)胞生長(zhǎng)變慢，立體性差，細(xì)胞形態(tài)變化不甚顯著，細(xì)胞間有微小黑點(diǎn)，需在高倍顯微鏡下仔細(xì)觀察；隨著污染時(shí)間延長(zhǎng)，顯微鏡下可觀察到細(xì)胞生長(zhǎng)分散，大部分細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)空泡，呈現(xiàn)“流沙狀”脫落、崩解[14]，培養(yǎng)皿底部有明顯黑點(diǎn)[20]，該方法在懷疑污染時(shí)具有一定鑒別作用。有研究指出，支原體污染早期細(xì)胞形態(tài)變化不顯著，該方法假陽(yáng)性和假陰性率較高。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在懷疑污染發(fā)生的情況下篩查細(xì)胞，能觀察到細(xì)胞形態(tài)變化及細(xì)胞間的黑點(diǎn)。但該方法不能作為常規(guī)檢測(cè)方法，只能作為鑒別方法。DNA熒光染色法：熒光染料Hoechst 33342能選擇性結(jié)合DNA小溝，支原體DNA和細(xì)胞DNA均會(huì)被染色[1]。利用該方法能在熒光顯微鏡下直接觀察到支原體，即支原體除胞核有熒光外，核外還可看到許多分散的熒光小點(diǎn)[11]。但細(xì)胞碎片染色后容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，或支原體污染非常輕微時(shí)容易出現(xiàn)假陰性，一般需要無(wú)支原體污染的細(xì)胞作為對(duì)照[13]。PCR檢測(cè)方法可快速檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物和生物制品、血清等生物材料中的支原體污染[22]，具有較高的靈敏度，特異性較強(qiáng)；但由于支原體的多樣性，有種、屬間交叉反應(yīng)[18]，支原體與衣原體具有同源性[24]，檢測(cè)結(jié)果可能出現(xiàn)假陽(yáng)性，所以在選擇靶序列及引物方面必需謹(jǐn)慎。上述方法各有特點(diǎn)，僅用單一方法檢測(cè)存在局限性。鑒于高倍顯微鏡為細(xì)胞試驗(yàn)中必備儀器，Hoechst 33342為常備試劑，所以在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液在更換后短時(shí)間內(nèi)顏色變化(顏色呈橙色或黃色)，初步懷疑為支原體污染時(shí)，可使用高倍顯微鏡直接觀察法和DNA熒光染色法結(jié)合檢測(cè)，能在1 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)支原體污染，據(jù)此快速進(jìn)行支原體污染去除，將污染控制在數(shù)量及影響較少的早期，對(duì)細(xì)胞損傷較小，適合于珍貴的細(xì)胞。

細(xì)胞被支原體污染后，徹底清除非常困難。若污染細(xì)胞具有可替代性，應(yīng)丟棄；若污染細(xì)胞來(lái)源有限、難以替代，就需要采取措施去除支原體。常見(jiàn)去除方法有克隆法、裸鼠過(guò)繼法、加熱法和藥物處理法等[19]，實(shí)驗(yàn)室多采用支原體抗生素Plasmocin去除支原體污染[25]。支原體抗生素Plasmocin能在不影響細(xì)胞代謝的提前下可阻止復(fù)制叉形成，阻斷DNA復(fù)制；干預(yù)核糖體的翻譯，阻止蛋白合成，是目前最理想的去除支原體藥物[18-19]，但其價(jià)格昂貴，限制了它的廣泛應(yīng)用[26]。需要注意的是，細(xì)胞培養(yǎng)作為無(wú)菌技術(shù)，過(guò)程中不可濫用抗生素，應(yīng)僅在污染發(fā)生時(shí)短期使用，防止微生物混亂。應(yīng)加強(qiáng)預(yù)防和常規(guī)檢測(cè)力度，這與有些研究中提到使用低劑量抗生素預(yù)防支原體污染的理念不同。

本試驗(yàn)的不足之處是采用了準(zhǔn)確率較低的2種檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)支原體污染，存在假陽(yáng)性的可能。原因在于首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞疑似遭受支原體污染時(shí)，需盡快確定是否為支原體污染，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果使用支原體抗生素Plasmocin對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，以減少支原體對(duì)細(xì)胞的傷害。為了提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在Plasmocin處理期后，引入PCR法。綜合使用3種 方法對(duì)清除效果進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)Plasmocin處理后，細(xì)胞中支原體已被完全去除。邢龍彬等、張丹丹等研究發(fā)現(xiàn)，不同細(xì)胞對(duì)Plasmocin的敏感度和耐受性不同，細(xì)胞中支原體在被去除后很容易重復(fù)感染，需要繼續(xù)給藥[19,25]。本試驗(yàn)在細(xì)胞用Plasmocin處理14 d后，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖速度均恢復(fù)正常，未復(fù)污染。說(shuō)明呂梁黑山羊成纖維細(xì)胞僅需支原體抗生素Plasmocin處理14 d 即可去除支原體早期污染，未復(fù)感，不需另外給藥。推測(cè)在發(fā)現(xiàn)污染早期對(duì)支原體進(jìn)行去除可能效果更好，不易復(fù)感。本試驗(yàn)在細(xì)胞被支原體污染早期快速發(fā)現(xiàn)并及時(shí)對(duì)其進(jìn)行處理，建立了細(xì)胞污染處理快速反應(yīng)機(jī)制，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)際工作中具有很高操作性，實(shí)用性強(qiáng)，具有借鑒價(jià)值。

預(yù)防重于治理，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，要時(shí)刻警惕支原體及其他污染，制定嚴(yán)格規(guī)范的細(xì)胞培養(yǎng)間日常管理消毒制度，定期對(duì)細(xì)胞、試劑、耗材、儀器進(jìn)行污染檢測(cè)，規(guī)范試驗(yàn)操作和紀(jì)錄流程，把污染的可能性降到最低，提高試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。