馬正寶 劉銘 杜澤光 祈樂(lè) 魏兵強(qiáng)

摘要：利用生物信息學(xué)分析方法對(duì)辣椒Exo-PG基因家族成員的數(shù)量、分子特征、亞細(xì)胞定位、基因結(jié)構(gòu)、順式作用元件及系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析，以明確辣椒Exo-PG基因家族成員。結(jié)果表明，辣椒Exo-PG基因家族有49個(gè)成員，不均勻分布于13條染色體上，并分為3個(gè)亞族;辣椒Exo-PG基因家族成員編碼的蛋白酸堿性各占一半，且均定位于細(xì)胞外;該家族成員在啟動(dòng)子序列中含有激素響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件等多種順式作用元件。

關(guān)鍵詞：辣椒;外切多聚半乳糖醛酸酶;基因家族;生物信息學(xué)

中圖分類(lèi)號(hào)：S641.3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? ? 文章編號(hào)：1001-1463（2021）10-0011-08

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2021.10.004

Bioinformatics Analysis of Exo-polygalacturonase Gene Family in Pepper

MA Zengbao， LIU Ming， DU Zeguang， QI Le， WEI Bingqiang

（College of Horticulture， Gansu Agriculture University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：In order to identify the Exo-PG gene family members in pepper， the number， molecular characteristics， subcellular localization， gene structure， cis acting elements and phylogeny of Exo-PG gene family members in pepper were analyzed by bioinformatics. The results showed that pepper contains 49 Exo- PG ?gene family members， which were distributed unevenly on 13 chromosomes and divided into three subgroups. The Exo- PG gene family members in pepper encode half of the proteins with acid-base properties， and all of them are located extracell. There are many cis-acting elements in the promoter sequence of the family members， such as hormone response element， low temperature response element， anaerobic induction element and so on.

Key words：Pepper; Exo-polygalacturonase; Gene family; Bioinformatics

辣椒（Capsicum annuum L.）原產(chǎn)中南美洲，約于16世紀(jì)后期傳入我國(guó)。它是重要的蔬菜及調(diào)味品，我國(guó)栽植面積在200萬(wàn)hm2以上，并且呈逐年增大的趨勢(shì)，對(duì)保障我國(guó)蔬菜周年供應(yīng)有著重要作用[1 ]。因此，保障辣椒的產(chǎn)量、品質(zhì)與周年供應(yīng)成為重大民生問(wèn)題。

果膠或果膠物質(zhì)普遍存在于初生細(xì)胞壁和幼小植物組織的中層[2 ]，是細(xì)胞維持一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的重要物質(zhì)。在花粉發(fā)育過(guò)程中，包被花粉母細(xì)胞、四分體的初生細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素、果膠和糖蛋白等組成?；ǚ蹆?nèi)壁是成熟花粉壁的組成部分，其主要成分與初生細(xì)胞壁相似。通常情況下，多糖代謝密切參與這些壁的形成和降解，從而參與花粉壁的正常發(fā)育[3 ]。在植物體內(nèi)，廣泛分布于果膠代謝相關(guān)的酶，根據(jù)其作用底物的不同，可以分為3 種類(lèi)型，即斷裂多聚半乳糖醛酸中α-1，4-糖苷鍵的解聚酶（PG）、對(duì)高甲酯化果膠發(fā)揮脫甲酯作用的果膠酯酶以及降解不溶性果膠類(lèi)物質(zhì)的原果膠酶[4 ]，目前應(yīng)用最為廣泛的PG是解聚酶的一種。已有研究表明，PG基因家族的多個(gè)成員特異地存在于花粉中，它們可能在花粉成熟和花粉管伸長(zhǎng)中發(fā)揮重要的作用[5 ]。 PG基因是一大基因家族，目前仍不明確在辣椒中有多少PG家族成員在花粉發(fā)育中起作用。根據(jù)對(duì)底物的酶促作用模式，多聚半乳糖醛酸酶分為兩類(lèi)，即隨機(jī)切割型（內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶）和末端切割型（外切多聚半乳糖醛酸酶），外切 PG 從多聚半乳糖醛酸鏈的非還原末端逐個(gè)水解， 內(nèi)切 PG 則可從分子中間隨機(jī)裂解多聚半乳糖醛酸[6 ]。我們?cè)诶苯啡蚪M范圍內(nèi)鑒定和篩選出辣椒外切多聚半乳糖醛酸酶（Exo-PG）基因家族成員，并利用生物信息學(xué)方法分析了基因結(jié)構(gòu)，以預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件，旨在為全面鑒定和認(rèn)識(shí)辣椒Exo-PG基因家族，為后續(xù)研究辣椒Exo-PG基因家族成員的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 ? 材料與方法

1.1 ? 數(shù)據(jù)來(lái)源

在擬南芥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR（https：//www. arabidopsis.org）上進(jìn)行搜索關(guān)鍵詞“exo-polygalacturonase”，獲取并下載擬南芥exo-poly-

galacturonase基因的蛋白序列。

1.2 ? 方法

1.2.1 ? 辣椒CaExo-PG基因家族鑒定 ? 以下載的擬南芥exo-polygalacturonase基因蛋白序列作為搜索序列，在茄科基因網(wǎng)站（https：//solgenomics.net /tools/blast）進(jìn)行blastp比對(duì)，獲取辣椒的exo-polygalacturonase基因家族蛋白候選序列[7 ]。將候選序列提交至Pfam（http：//pfam.xfam.org/）和SMART進(jìn)行結(jié)構(gòu)域驗(yàn)證[8 ]，最終確定CaExo-PG基因家族成員。利用在線軟件ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析CaExo-PG家族成員的蛋白質(zhì)序列長(zhǎng)度、分子量及等電點(diǎn)等理化性質(zhì)[9 ]。利用Euk- mPLoc 2.0（http：//www. csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析[10 ]。

1.2.2 ? 進(jìn)化樹(shù)、染色體定位和保守基序分析 ? 利用 MEGA-X構(gòu)建辣椒系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，構(gòu)建方法為最大法（Maximum Likelihood，ML）。將Bootstrap 的重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1 000，剩余設(shè)置選擇默認(rèn)選項(xiàng)[11 ]。染色體定位分析用MapChart軟件進(jìn)行。通過(guò)MEME網(wǎng)站對(duì)CaExo-PG蛋白的氨基酸序列中的保守基序進(jìn)行分析，參數(shù)設(shè)置為模體基序長(zhǎng)度最小為15 aa、最大為150 aa，保守序列數(shù)目最大為6，其他均采用默認(rèn)參數(shù)。

1.2.3 ? 基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子順式作用元件 ? 通過(guò)GSDS網(wǎng)站（http：//gsds.gao-lab.org/index.php）分析辣椒CaExo-PG基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)及數(shù)目[12 ]。利用TBtool工具提取CaExo-PG編碼序列（coding sequence，CDS）的起始密碼子上游2000 bp序列作為啟動(dòng)子序列，并通過(guò)PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析[13 - 14 ]。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ? 辣椒CaExo-PG基因家族的獲取和鑒定

利用生物信息學(xué)的方法，從辣椒‘zunla-1全基因組中共鑒定到 49個(gè) CaExo-PG家族成員（表1），根據(jù)在染色體的位置，將其名為CaExo-PG1～CaExo-PG49。該基因家族所有成員編碼的蛋白質(zhì)均含有一個(gè)“Glyco hydro 28”結(jié)構(gòu)域，氨基酸數(shù)的變化范圍在106～598個(gè)，分子量變化范圍在11 415.82～63 472.85，其中CaExo-PG31基因編碼的蛋白質(zhì)分子量最大，CaExo-PG2最小。等電點(diǎn)介于4.73～9.80，其中有24個(gè)成員蛋白質(zhì)呈堿性，25個(gè)成員蛋白質(zhì)呈酸性。通過(guò)亞細(xì)胞定位分析，發(fā)現(xiàn)該基因家族成員編碼的蛋白質(zhì)均定位于細(xì)胞外。

2.2 ? 辣椒CaExo-PG基因家族

2.2.1 ? 辣椒CaExo-PG基因家族進(jìn)化樹(shù)分析

為了解辣椒Exo-PG基因家族和擬南芥（ATexo）之間的同源關(guān)系，構(gòu)建辣椒、擬南芥 Exo-PG基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1）。辣椒CaExo-PG基因家族可分為三個(gè)亞家族（Group1、Group2和Group3）。其中第一亞家族有成員21個(gè);第二亞家族有成員19個(gè)，第三亞家族有成員9個(gè)，ATexo-PG1與CaExo-PG47位于同一亞家族，且具有較高的同源性，說(shuō)明這兩個(gè)基因具有相似的生理學(xué)功能。

2.2.2 ? 染色體定位分析 ? 對(duì)辣椒CaExo-PG基因家族成員進(jìn)行染色體定位分析，結(jié)果顯示，49個(gè)基因分散于辣椒的所有染色體上（圖2）。其中2號(hào)、4號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、11號(hào)染色體上有2個(gè)基因;1號(hào)染色體上有4個(gè)基因;5號(hào)、9號(hào)、12號(hào)、0號(hào)染色體上有6個(gè)基因;3號(hào)染色體上有7個(gè)基因。其中0號(hào)染色體最長(zhǎng)，3號(hào)、9號(hào)、12號(hào)染色體出現(xiàn)基因簇且都分布于染色體上端，3號(hào)染色體分布的基因最多。大多數(shù)染色體上有2個(gè)基因。

2.2.3 ? 保守基序分析 ? 對(duì)辣椒CaExo-PG基因家族的蛋白質(zhì)保守基序進(jìn)行分析（圖3），共獲得6個(gè)保守基序（Motif1、Motif2、Motif3、Motif4、Motif5、Motif6），其中CaExo- PG24和CaExo-PG25沒(méi)有保守基序。絕大多數(shù)基因中有Motif1、Motif5分布，說(shuō)明Motif1與Motif5在該家族基因中發(fā)揮重要的作用。Motif2、Motif3、Motif4、Motif6也廣泛分布于該基因家族。

2.3 ? 基因結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子順式作用元件分析

2.3.1 ? 基因結(jié)構(gòu) ? 通過(guò)GSDS網(wǎng)站分析辣椒CaExo-PG基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)及數(shù)目（圖4）。從基因內(nèi)含子數(shù)目分析，該基因家族成員的內(nèi)含子數(shù)目為1～13個(gè)之間，大多數(shù)成員具有3～5個(gè)內(nèi)含子，其中CaExo- PG10具有的內(nèi)含子數(shù)目最多，數(shù)量為13個(gè)。從基因的長(zhǎng)度進(jìn)行分析，CaExo-PG4的長(zhǎng)度最長(zhǎng)，大于12 kb，CaExo-PG2長(zhǎng)度最短，小于1 kb。有3個(gè)成員（CaExo-PG12、CaExo-PG35、CaExo-PG9）含有非翻譯區(qū)。

2.3.2 ? 啟動(dòng)子順式作用元件分析 ? 利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)分析了啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件（圖5）。CaExo-PG家族基因的啟動(dòng)子順式作用元件可以分為9大類(lèi)，分別為auxin（生長(zhǎng)素）、defense and stress（防御與脅迫）、gibberellin（赤霉素）、low-temperature（低溫響應(yīng)）、salicylic acid（水楊酸）、anaerobic induction（厭氧誘導(dǎo)）、MeJA（茉莉酸甲酯）、meristem expression（分生組織表達(dá)）、endosperm expression（胚乳表達(dá)）。其中CaExo-PG9只有厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件，CaExo- PG29只有水楊酸響應(yīng)元件。多數(shù)基因含有水楊酸、茉莉酸甲酯和分生組織表達(dá)的作用元件。

3 ? 結(jié)論與討論

本研究從辣椒全基因組范圍內(nèi)共鑒定出 49個(gè)CaExo-PG 基因，分散排布在辣椒的全部染色體上，其中大多數(shù)染色體上有2個(gè)基因，3號(hào)、5號(hào)、9號(hào)、12號(hào)染色體上端有明顯的基因簇出現(xiàn)。該基因家族的蛋白質(zhì)分子量為11 415.82～63 472.85，差異較大;等電點(diǎn)介于4.73～9.80，其中有24個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)呈酸性，25個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)呈堿性;亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)該基因家族蛋白全定位于細(xì)胞外，說(shuō)明在細(xì)胞外發(fā)揮重要功能。

利用1個(gè)擬南芥和49個(gè)辣椒CaExo-PG蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，根據(jù)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果將辣椒CaExo-PG家族成員分為3個(gè)亞家族，分別為第一亞家族（Group1）、第二亞家族（Group2）及第三亞家族（Group3）。對(duì)CaExo- PG基因家族進(jìn)行了蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)蛋白具有Motif1、Motif5，說(shuō)明Motif1、Motif5在該家族基因中發(fā)揮重要功能。結(jié)合進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)，同一亞族的基因基本含有相似的保守基序。對(duì)CaExo-PG基因結(jié)構(gòu)分析，大多數(shù)基因具有3～5個(gè)內(nèi)含子，CaExo-PG10含有內(nèi)含子最多（13個(gè)）;在該家族成員中，有3個(gè)成員含有非翻譯區(qū)，其中基因CaExo-PG12非翻譯區(qū)長(zhǎng)度最短，CaExo-PG35長(zhǎng)度次之，CaExo-PG9最長(zhǎng)。

研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)辣椒CaExo-PG基因含有激素和逆境響應(yīng)相關(guān)順式調(diào)控元件（水楊酸、茉莉酸甲酯和分生組織表達(dá)），其中CaExo-PG9只有厭氧誘導(dǎo)、CaExo-PG29只有水楊酸響應(yīng)?；駽aExo-PG4和CaExo-PG49只含有2個(gè)作用元件，即水楊酸響應(yīng)和厭氧誘導(dǎo);基因CaExo-PG21和基因CaExo-PG43含有作用元件最多，有7個(gè)。

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（本文責(zé)編：楊 ? ?杰）

收稿日期：2021 - 06 - 15

基金項(xiàng)目：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（S202010733089）;甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)科研訓(xùn)練計(jì)劃（SRTP）項(xiàng)目（202012012）。

作者簡(jiǎn)介：馬正寶（1998 — ），男，甘肅蘭州人，碩士在讀，研究方向?yàn)槭卟藢W(xué)。Email：2372128737@qq.com。

通信作者：魏兵強(qiáng)（1980 — ），男，甘肅天水人，副研究員，博士，主要從事蔬菜遺傳與分子育種。聯(lián)系電話：（0931）7632155。Email：bqwei@gsau.edu.cn。

執(zhí) ?筆 ?人：劉 ? 銘。