劉 娟，馬可忠，楊 峰，吳校林，卞 芳，龔 芳

0 引 言

心肌缺血再灌注損傷是多種心血管疾病的病理過(guò)程，如何減輕心肌缺血再灌注損傷一直是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，研究表明中醫(yī)藥可以減緩缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷[1-3]。桑白皮是?？浦参颩orusalbaL.的干燥根皮，桑白皮多糖是其主要活性成分之一，具有抗氧化的作用[4]。研究報(bào)道桑白皮多糖能顯著升高小鼠血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低血清中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量，改善小鼠體內(nèi)異常的過(guò)氧化狀態(tài)[5]。桑白皮聯(lián)合卡托普利通過(guò)抗氧化應(yīng)激改善大鼠糖尿病腎病的腎功能[6]。然而桑白皮多糖對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道circDLGAP4可通過(guò)靶向miR-143調(diào)節(jié)B細(xì)胞白血病/淋巴瘤2(B cell lymphoma/leukemia-2，BCL2)改善心肌缺血再灌注損傷中的心肌細(xì)胞凋亡[7]。急性缺血性中風(fēng)患者的血漿和小鼠中風(fēng)模型中circDLGAP4水平顯著降低；circDLGAP4的過(guò)表達(dá)可改善缺血性卒中[8]。且生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)circDLGAP4與miR-320有結(jié)合位點(diǎn)。研究報(bào)道m(xù)iR-320-3p具有保護(hù)大鼠心肌細(xì)胞免受缺血/再灌注損傷[9]。miR-320通過(guò)靶向A激酶相互作用蛋白1(A kinase-interacting protein 1，AKIP1)調(diào)節(jié)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[10]。以上研究表明circDLGAP4和miR-320均可改善缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡。然而circDLGAP4與miR-320的關(guān)系，及桑白皮多糖是否通過(guò)調(diào)控circDLGAP4和miR-320的表達(dá)影響心肌細(xì)胞損傷尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在研究桑白皮多糖對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制是否與circDLGAP4和miR-320有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料H9C2細(xì)胞購(gòu)自上海雅吉生物公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Genmed公司；桑白皮多糖購(gòu)自上海益本生物醫(yī)藥科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)試劑盒、凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本同仁研究所；蛋白提取試劑盒購(gòu)自武漢純度生物科技有限公司；MDA含量檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)、SOD活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；SYBR Premix ExTaqTM試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海臻諾生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞處理與分組H9C2細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將其置于無(wú)氧處理過(guò)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃、95% N2、5% CO2條件下缺氧培養(yǎng)6 h，然后換成正常培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2條件下復(fù)氧6 h，作為缺氧/復(fù)氧(H/R)組。正常對(duì)照組：培養(yǎng)H9C2細(xì)胞在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)相同時(shí)間，不作任何處理。

分別用0.01、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 μg/mL桑白皮多糖處理H9C2細(xì)胞及缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9C2細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞活性選曬事業(yè)濃度，而后選擇0.1、0.2、0.4 μg/mL的桑白皮多糖預(yù)處理H9C2細(xì)胞然后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理，作為H/R+桑白皮多糖低、中、高劑量組。

將pcDNA及3個(gè)pcDNA-circDLGAP4質(zhì)粒分轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞，RT-qPCR檢測(cè)circDLGAP4表達(dá)水平，選擇表達(dá)水平較高的用于后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。H/R+pcDNA組、H/R+pcDNA-circDLGAP4組：將pcDNA、pcDNA-circDLGAP4轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理；H/R+桑白皮多糖高劑量+si-circDLGAP4組：將si-circDLGAP4轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞后用0.4 μg/mL桑白皮多糖處理，再進(jìn)行缺氧/復(fù)氧處理。

1.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度值(A值)。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集各組培養(yǎng)48 h的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，與500 μL的結(jié)合緩沖液混勻；先加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，取適量蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，用封閉液封閉膜1 h，將膜置于加入Bax、Bcl-2一抗(1∶1000)的雜交袋中4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜后將其置于加入二抗(1∶2000)的雜交袋中37 ℃孵育2 h，顯影、成像，Quantity-One軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.6試劑盒檢測(cè)細(xì)胞MDA含量、SOD活性和培養(yǎng)液中LDH活性收集各組細(xì)胞，按MDA、SOD試劑盒說(shuō)明檢測(cè)MDA含量、SOD活性；收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按LDH試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè)LDH活性。

1.7RT-qPCR檢測(cè)circDLGAP4和miR-320的表達(dá)水平提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR，以GAPDH和U6為內(nèi)參，用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。circDLGAP4上游引物序列：5'-ACGGCTACTGGTTCCTAAAGC-3'，下游引物序列：5'--GGGGTCTTCTTATACGCCACT-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3'，下游引物序列：5'-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3'；miR-320上游引物序列：5'-ACACTCCAGCTGGGAAAAGCTGGGTTGAGA-3'，下游引物序列：5'-TGGTGTCGTGGAGTCG-3'；U6上游引物序列：5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3'，下游引物序列：5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。

1.8雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)構(gòu)建circDLGAP4的野生型和突變型熒光素酶載體wt-circDLGAP4和mut-circDLGAP4，將wt-circDLGAP4和mut-circDLGAP4分別與miR-NC或miR-320共轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞中，按照試劑盒說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 桑白皮多糖對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2凋亡的影響與正常對(duì)照組相比，H/R組H9C2細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，Bax表達(dá)水平升高，Bcl-2表達(dá)水平降低(P<0.05)；與H/R組相比，H/R+桑白皮多糖低、中、高劑量組H9C2細(xì)胞活性升高，凋亡率降低，Bax表達(dá)水平降低，Bcl-2表達(dá)水平升高，呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)，見(jiàn)圖1、圖2，表1。

a：正常對(duì)照組；b：H/R組；c：H/R+桑白皮多糖低劑量組；d：H/R+桑白皮多糖中劑量組；e：H/R+桑白皮多糖高劑量組

表1 桑白皮多糖對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞活性和凋亡的影響

2.2桑白皮多糖對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2氧化應(yīng)激的影響與正常對(duì)照組相比，H/R組H9C2細(xì)胞中MDA含量及LDH活性升高，SOD活性降低(P<0.05)；與H/R組相比，H/R+桑白皮多糖低、中、高劑量組H9C2細(xì)胞中MDA含量及LDH活性降低，SOD活性升高，呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 桑白皮多糖對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2氧化應(yīng)激的影響

2.3桑白皮多糖對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2中circDLGAP4和miR-320表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，H/R組H9C2細(xì)胞中circDLGAP4表達(dá)水平降低，miR-320表達(dá)水平升高(P<0.05)；與H/R組相比，H/R+桑白皮多糖低、中、高劑量組H9C2細(xì)胞中circDLGAP4表達(dá)水平升高，miR-320表達(dá)水平降低，呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 circDLGAP4和miR-320表達(dá)的檢測(cè)

2.4過(guò)表達(dá)circDLGAP4對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2凋亡氧化應(yīng)激的影響與pcDNA組相比，pcDNA-circDLGAP4 1、2、3組circDLGAP4表達(dá)水平升高，表明轉(zhuǎn)染成功，見(jiàn)圖3。與H/R+pcDNA組相比，H/R+pcDNA-circDLGAP4組circDLGAP4表達(dá)水平升高，miR-320表達(dá)水平降低，MDA含量、LDH活性降低，SOD活性升高；H9C2細(xì)胞活性升高，H9C2細(xì)胞凋亡率及Bax表達(dá)水平降低，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4、圖5，表4。

表4 過(guò)表達(dá)circDLGAP4對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞活性、凋亡及氧化應(yīng)激的影響

2.5抑制circDLGAP4對(duì)桑白皮多糖作用的缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2凋亡氧化應(yīng)激的影響與H/R+桑白皮多糖高劑量組相比，H/R+桑白皮多糖高劑量+si-circDLGAP4組circDLGAP4表達(dá)水平降低，miR-320表達(dá)水平升高，H9C2細(xì)胞中MDA含量、LDH活性升高，SOD活性降低，H9C2細(xì)胞活性降低，H9C2細(xì)胞凋亡率及Bax表達(dá)水平升高，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖6、圖7，表5。

表5 抑制circDLGAP4可逆轉(zhuǎn)桑白皮多糖對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞活性、凋亡及氧化應(yīng)激的影響

2.6circDLGAP4靶向miR-320circDLGAP4和miR-320的互補(bǔ)序列，見(jiàn)圖8。wt-circDLGAP4與miR-320共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性較與miR-NC共轉(zhuǎn)染的降低(P<0.05)，mut-circDLGAP4與miR-320共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)顯著變化，見(jiàn)表6。

1：pcDNA；2：pcDNA-circDLGAP4 1；3：pcDNA-circDLGAP4 2；4：pcDNA-circDLGAP4 3

a：H/R+pcDNA組；b：H/R+pcDNA-circDLGAP4組

1：H/R+pcDNA組；2：H/R+pcDNA-circDLGAP4組

a：H/R組；b：H/R+桑白皮多糖高劑量組；c：H/R+桑白皮多糖高劑量+si-circDLGAP4組

1：H/R組；2：H/R+桑白皮多糖高劑量組；3：H/R+桑白皮多糖高劑量+si-circDLGAP4組

圖8 circDLGAP4和miR-320的互補(bǔ)序列

表6 wt-circDLGAP4、mut-circDLGAP4與miR-320、miR-NC共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性

3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激與缺血再灌注損傷密切相關(guān)，抑制心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激是防治缺血再灌注損傷的重要途徑[11]。中藥多糖具有顯著抗氧化作用，可減少氧化應(yīng)激損傷[12]。研究報(bào)道桑白皮多糖對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性肝損傷有明顯保護(hù)作用[13]。從桑白皮中提取的毛果多糖可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和減輕胰腺組織的氧化應(yīng)激來(lái)改善胰腺功能[14]。本實(shí)驗(yàn)用缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞模擬缺血再灌注，用不同劑量桑白皮多糖處理，結(jié)果顯示，H9C2細(xì)胞活性升高，凋亡率及Bax表達(dá)水平降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平升高；表明桑白皮多糖可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；此外，MDA含量、LDH活性降低，而SOD活性升高；表明桑白皮多糖抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激。

研究報(bào)道冠心病患者外周血白細(xì)胞以及單核巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程中circDLGAP4的表達(dá)水平明顯降低[15]。circDLGAP4可以通過(guò)減少細(xì)胞凋亡及線(xiàn)粒體損傷，從而減弱MPP +對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用[16]。circDLGAP4通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的缺血/再灌注損傷[17]。以上研究表明circDLGAP4可參與調(diào)控細(xì)胞損傷過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中circDLGAP4表達(dá)水平降低。過(guò)表達(dá)circDLGAP4后，MDA含量、LDH活性降低，而SOD活性升高；此外，H9C2細(xì)胞活性升高，H9C2細(xì)胞的凋亡率降低；表明過(guò)表達(dá)circDLGAP4可抑制缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

研究報(bào)道m(xù)iR-320過(guò)表達(dá)可減弱胰島素對(duì)心肌缺血損傷的心臟保護(hù)作用[18]。下調(diào)miR-320對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞中miR-320表達(dá)水平升高，與前人研究結(jié)果相符。且本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)circDLGAP4可靶向調(diào)控miR-320，提示circDLGAP4可能通過(guò)下調(diào)miR-320的表達(dá)進(jìn)而影響心肌細(xì)胞損傷。此外，不同劑量桑白皮多糖處理可提高circDLGAP4表達(dá)水平，降低miR-320表達(dá)水平；說(shuō)明桑白皮多糖可調(diào)控circDLGAP4和miR-320的表達(dá)；而同時(shí)抑制circDLGAP4表達(dá)和桑白皮多糖處理，MDA含量、LDH活性升高，SOD活性降低，H9C2細(xì)胞活性降低，H9C2細(xì)胞凋亡率升高；表明抑制circDLGAP4可逆轉(zhuǎn)桑白皮多糖對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2損傷的影響。提示桑白皮多糖可能通過(guò)調(diào)控circDLGAP4/miR-320的表達(dá)影響H9C2細(xì)胞損傷。

綜上所述，桑白皮多糖通過(guò)調(diào)控circDLGAP4/miR-320對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷起保護(hù)作用。然而本實(shí)驗(yàn)還存在一些不足之處，目前實(shí)驗(yàn)僅在體外細(xì)胞中進(jìn)行，其是否在體內(nèi)具有同樣效用還有待于進(jìn)一步研究。