實(shí)時熒光定量PCR在EB病毒DNA檢測中的應(yīng)用

符秋娟 符小芳

【摘要】目的：研究實(shí)時熒光定量PCR在EB病毒DNA檢測中的臨床效果。方法：選擇我院2019年5月至2021年6月間的191例感染患者作為研究對象，實(shí)時熒光定量PCR對191例已確診感染EBV的患者進(jìn)行檢驗(yàn)，對EBV-DNA外周血實(shí)施檢驗(yàn)，包括白細(xì)胞（WBC）、超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、肌酸激酶（CK）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）等指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)，并選擇200例健康人群對以上各指標(biāo)進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果：感染組的各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)較之正常人群對比差異明顯，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;且EBV-DNA的陽性檢出率顯著高于正常人群，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：EB感染者的臨床表現(xiàn)較為復(fù)雜，經(jīng)過檢驗(yàn)EBV-DNA指標(biāo)可進(jìn)行前期診斷與評估，值得臨床借鑒和推廣。

【關(guān)鍵詞】實(shí)時熒光定量PCR;EB病毒;EB-DNA;陽性檢出率

【中圖分類號】R446.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【DOI】

Application of real-time fluorescent quantitative PCR in detection of Epstein Barr virus DNA

Fu qiujuan， Fu Xiaofang

（Affiliated Hospital of Guangdong Medical University， Zhanjiang， Guangdong 524000）

【Abstract】Objective： To study the clinical effect of real-time fluorescent quantitative PCR in detection of EB virus DNA. Methods： 191 patients with EBV infection in our hospital from May 2019 to June 2021 were selected as the research objects. Real time fluorescent quantitative PCR was used to test 191 patients with EBV infection， and the peripheral blood of EBV-DNA was tested， including white blood cell （WBC）， high sensitivity C-reactive protein （hs CRP）， alanine aminotransferase （ALT）， creatine kinase （CK）， creatine kinase （CRP）， and the expression of serum creatine kinase （CK） Aspartate aminotransferase （AST） and other indicators were tested， and 200 healthy people were selected to test the above indicators. Results： compared with the normal population， the related indexes of the infection group were significantly different （P<0.05）; And the positive detection rate of EBV-DNA was significantly higher than that of normal people， P< 0.05， the difference was statistically significant. Conclusion： the clinical manifestations of patients with EB infection are complex. EBV-DNA can be used for early diagnosis and evaluation， which is worthy of clinical reference and promotion.

【Key words】real time fluorescent quantitative PCR; Epstein Barr virus; EB-DNA;Positive detection rate

EB病毒（EBV）也被稱為人類皰疹病毒4型，在兒童時期極易引發(fā)感染，并且包括慢性活動性EBV感染、淋巴瘤等多種不良預(yù)后。該病毒在人群中分布廣泛，經(jīng)過相關(guān)研究顯示，在我國3～5歲兒童群體中，EBVVCA-IgG的抗體陽性率極高，幼兒被感染后無顯著癥狀，僅會導(dǎo)致咽炎和上呼吸道感染等。青年群體的原發(fā)感染，將近一半的可能性發(fā)生傳染性單核細(xì)胞增多癥。該病毒主要傳播途徑為唾液，也會經(jīng)血液傳播。EBV多數(shù)在口咽部的上皮細(xì)胞進(jìn)行增殖，影響B(tài)淋巴細(xì)胞，將會經(jīng)過血液循環(huán)導(dǎo)致全身性感染，可在淋巴組織中長時間存在，當(dāng)人體的抵抗力降低時，EBV活化導(dǎo)致感染出現(xiàn)，包括單核細(xì)胞增多癥、淋巴瘤等疾病[1-2]。因此，本文將研究實(shí)時熒光定量PCR在EBV中的應(yīng)用效果，從而對臨床診斷提供新思路，現(xiàn)對結(jié)果進(jìn)行闡述。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇我院2019年5月至2021年6月間的191例感染患者作為研究對象，年齡2～11歲，其中男性115例，女性76例，所有患者中普通感染92例，傳染性單核細(xì)胞增多癥99例為感染組，另選擇200正常人群為健康組。兩組研究對象的各項(xiàng)基本資料對比無顯著差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，存在可比性，P>0.05。

1.2 方法

獲取EDTA-K2抗凝血3mL，選擇TaqMan熒光探針基因擴(kuò)增技術(shù)實(shí)施檢驗(yàn)，選擇上海宏石SLAN-96S實(shí)施熒光定量PCR儀，50℃2min、95℃3smin，95℃10s、60℃1min、40個循環(huán)。使用貝克曼全套儀器和試劑盒對ALT、AST、CK、CK-MB進(jìn)行檢驗(yàn)。使用全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對WBC、異常淋巴細(xì)胞、hs-CRP進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將本次研究所得所有項(xiàng)目數(shù)據(jù)資料均納入SPSS21.0軟件分析，t檢驗(yàn)與X 2檢驗(yàn)，P<0.05可認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01有非常顯著性的差異。

2 結(jié)果

經(jīng)過檢驗(yàn)后得知，感染組的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)均高于健康組，P<0.05，hs-CRP兩組對比差異不明顯，詳見表1。

3 討論

EBV在臨床中是小兒感染性疾病的主要病原，是導(dǎo)致各類惡性腫瘤的關(guān)鍵因素。當(dāng)發(fā)生感染時，絕大部分為陰性感染，在臨床診斷中極易發(fā)生漏診和誤診的情況。經(jīng)過相關(guān)資料顯示，EBV針對小兒具有較高的影響，明確其臨床特點(diǎn)是干預(yù)治療的關(guān)鍵所在。結(jié)合本研究結(jié)果，對3500例患者實(shí)施分析發(fā)現(xiàn)，傳染性單核細(xì)胞增多癥的臨床特征較為復(fù)雜，主要以發(fā)熱、淋巴結(jié)腫大為主。證明了傳染性單核細(xì)胞增多癥為主的疾病中癥狀和體征數(shù)量較多，且病情均不相同，在傳統(tǒng)的檢驗(yàn)當(dāng)中，多應(yīng)用ELISA法進(jìn)行診斷，但是因?yàn)樵摬《径喟l(fā)于小兒，使得陽性率普遍偏高[3]。結(jié)合我院接納的患兒分析，傳染性單核細(xì)胞增多癥和上呼吸道感染的數(shù)量最多，側(cè)面說明了EBV所引發(fā)的疾病類型復(fù)雜，數(shù)量眾多，在診斷過程中需要進(jìn)行甄別，降低漏診誤診的發(fā)生，有利于提升治療效果。因此，針對EBV患者來說，因?yàn)槠潴w征和癥狀復(fù)雜，會導(dǎo)致各類疾病的發(fā)生，嚴(yán)重威脅了患者的生命健康，故早期準(zhǔn)確快速的診斷對其具有重要意義[4]。因?yàn)樵摷膊〉臐摲谳^長，經(jīng)過感染后無顯著特異性，在傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法中，無法反饋病原體的感染情況，因此在臨床應(yīng)用中具有較高的局限性，并且因?yàn)椴糠只颊叩臋C(jī)體抵抗力低下，使得檢出率并不理想，所以酶聯(lián)免疫吸附不適合該疾病的前期診斷和評估，反之熒光定量PCR技術(shù)可利用探針釋放熒光基團(tuán)，在病毒檢測中，表現(xiàn)出了高敏感性以及特異度，適用于病毒感染的前期診斷。

實(shí)時熒光定量PCR作為一項(xiàng)新型的檢驗(yàn)措施，因?yàn)椴僮鞅憬?、具有較高的靈敏度、強(qiáng)特異性等優(yōu)勢在臨床中得到了廣泛的應(yīng)用，并且也是最關(guān)鍵的檢驗(yàn)方式，可將1個試管內(nèi)的目的基因擴(kuò)大至十萬或百萬倍，更利于結(jié)果的觀察，并且因?yàn)橐鬃詣踊芍貜?fù)操作，在各類疾病診斷中得到了廣泛應(yīng)用。當(dāng)下，在分子診斷方面通過對細(xì)胞中DNA、RNA的測定，能明確病原體的數(shù)量，還能反饋出多基因遺傳病的mRAN表達(dá)量。并且有研究建議，利用實(shí)時熒光定量聯(lián)合ELISA進(jìn)行檢驗(yàn)。經(jīng)過相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在乙肝病毒的檢驗(yàn)和診斷中，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)能區(qū)分病毒的類型，具有較高的靈敏度，廣泛的檢測范圍。該方式較之免疫學(xué)檢驗(yàn)具有較高的準(zhǔn)確性，并且可直接反饋病原微生物的情況?？偨Y(jié)近年來的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR技術(shù)的診斷效能已經(jīng)被得到證實(shí)。當(dāng)發(fā)生EBV感染后，機(jī)體將會表現(xiàn)出急性或亞急性全身性疾病，病變涉及涵蓋了心、肺、腎、血液、淋巴結(jié)等。因?yàn)閭€體的疾病程度不同，所以臨床表現(xiàn)也存在區(qū)別。經(jīng)過本研究結(jié)果顯示，研究對象的ALT、AST、CK以及CK-MB水平均會隨著EBV-DNA拷貝數(shù)量的增加而變化。應(yīng)用熒光定量PCR對EBV-DNA拷貝數(shù)量實(shí)施檢驗(yàn)，可評估患者的疾病情況，在疾病監(jiān)控方面具有較高的應(yīng)用價值?？傮w來說，EBV感染后主要導(dǎo)致呼吸道疾病，同時發(fā)病年齡大多集中在3～8歲兒童，主要和生活環(huán)境具有一定聯(lián)系，在診斷過程中，也應(yīng)當(dāng)考慮是否為集體感染的可能性[5]。因此前期診斷和治療對EBV具有重要意義。結(jié)合本研究結(jié)果進(jìn)行分析，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對EBV-DNA進(jìn)行檢驗(yàn)，有利于EBV感染的診斷，對EBV-DNA拷貝數(shù)進(jìn)行分析，可明確病毒在機(jī)體內(nèi)的復(fù)制情況，可用于疾病判斷，針對該病毒導(dǎo)致的其他感染或器官損傷的預(yù)防中具有重要意義[6]。在相關(guān)研究資料中顯示，EBV-DNA水平和肝功能損傷表現(xiàn)正相關(guān)，當(dāng)下普遍認(rèn)為病理機(jī)制是EBV通過增殖復(fù)制，對細(xì)胞免疫起到了激活的作用，進(jìn)而一步對機(jī)體的淋巴組織和淋巴器官進(jìn)行影響，異常的淋巴細(xì)胞侵襲中央靜脈鄰近和肝小葉，特別是距離中央靜脈越近，肝小葉的分布越密集，最終導(dǎo)致干細(xì)胞損傷。需要注意的是，傳染性單核細(xì)胞增多癥為自限性，預(yù)后較為理想[7-8]。綜合本研究結(jié)果可以得出，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在臨床中應(yīng)用廣泛，在各個疾病檢測中均有使用，因?yàn)樵摲绞侥転榕R床診斷提供可靠有效的根據(jù)，進(jìn)而一步協(xié)助醫(yī)生發(fā)現(xiàn)病毒感染的特征，而且，經(jīng)過相關(guān)研究顯示，從檢測樣本到獲取結(jié)果，僅僅需要兩個小時，針對小兒不明原因發(fā)熱，咽炎等疾病具有較高的臨床診斷意義。

總體來說，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)第EBV-DNA進(jìn)行檢驗(yàn)，有利于前期診斷和相關(guān)治療方案的制定，并且能有效評估疾病的發(fā)展情況，經(jīng)過本研究分析得知，EBV感染者的樣本獲取時間和EBV-DNA拷貝數(shù)存在密切聯(lián)系，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對EB病毒的診斷具有較高的應(yīng)用價值，值得臨床研究和借鑒。

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