氧化脅迫對豬肉內(nèi)源酶及保水性的影響

王夢琦，李洪軍,2，張 東，賀稚非,2,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400715）

我國是豬肉第一生產(chǎn)和消費大國。保水性作為肉制品重要的品質(zhì)特征，不僅與肉制品的感官特性密切相關(guān)，而且與豬肉加工企業(yè)經(jīng)濟效益直接掛鉤[1]。一般而言，保水性好的肉制品具有較好的質(zhì)地特性，擁有良好的滋味和口感。此外，提高肉制品保水性對提高肉類工業(yè)的經(jīng)濟效益具有重要意義。影響肉制品保水性的因素有很多，如包裝方式[2]、貯藏方式[3]、蛋白質(zhì)氧化[1]等。

近年來，國內(nèi)外關(guān)于蛋白質(zhì)氧化對肉品保水性的影響已逐漸成為了研究熱點。Huff-Lonergan等[4]指出蛋白質(zhì)氧化是導致肌肉成熟過程中保水性變化的重要因素。Ali等[5]發(fā)現(xiàn)反復凍融雞胸肉蛋白質(zhì)氧化是導致保水性下降的主要原因。Liu Zelong等[6]發(fā)現(xiàn)氧化引起豬肉保水性下降，這主要是因為蛋白質(zhì)交聯(lián)限制了肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）擴張。王兆明等[7]指出蛋白氧化破壞了原有的氧化還原平衡，改變了蛋白質(zhì)與水分子間建立靜電相互作用、氫鍵和毛細管力的能力，從而對肌肉保水性產(chǎn)生影響。Zhang Dong等[8]研究發(fā)現(xiàn)MP體外氧化也是引起肌肉保水性變化的原因。此外，肌肉保水性還與鈣蛋白酶以及組織蛋白酶等內(nèi)源酶密切相關(guān)。有研究表明，肉中的內(nèi)源酶對蛋白質(zhì)的氧化降解具有一定的調(diào)控作用[9-10]。但在氧化脅迫條件下，關(guān)于氧化、內(nèi)源酶表達量、蛋白降解三者之間的關(guān)系仍不明確，尤其是這三者對肌肉保水能力的綜合影響值得進一步深入探討。

因此，本研究采用羥自由基氧化體系對豬肉進行模擬氧化實驗，并對氧化處理后的豬肉進行進一步的生化指標分析。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blotting）實驗探討氧化脅迫對豬肉內(nèi)源酶表達量的影響，將經(jīng)氧化處理后的豬肉中的肌漿蛋白（sarcoplasmic protein，SP）和MP提取出來，測定熒光光譜、紫外光譜、羰基含量等指標，探討氧化脅迫對豬肉蛋白的影響。最后通過皮爾遜相關(guān)性分析探討內(nèi)源酶的變化與蛋白氧化之間的關(guān)系，為深層次揭示氧化脅迫條件下，氧化程度、內(nèi)源酶變化、蛋白氧化降解三者之間的關(guān)系提供一定理論參考，為闡明氧化脅迫條件對豬肉保水性的影響提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背部最長肌選購自重慶北碚永輝超市的12 月齡本香豬肉，放置于冷藏箱中運送至實驗室，豬肉的L*值為51.08，pH值約為5.9。然后去除可見的脂肪及結(jié)締組織，沿著肌纖維的方向切成1 cm×1 cm×1 cm的塊狀，放置于－80 ℃下冷凍備用。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鎂（MgCl2）、抗壞血酸（VC）、三氯化鐵（FeCl3）、過氧化氫（H2O2）、氯化鈉（NaCl）、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸（ethylenebis (oxyethylenenitrilo) tetraacetic acid，EGTA）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、考馬斯亮藍R250、冰乙酸、甲醇、乙酸乙酯、鹽酸胍、十二烷基硫酸鈉等（均為分析純）重慶市鈦新化工有限公司。

1.2 儀器與設備

BSA323S型分析天平 德國賽多利斯科學儀器有限公司；Avanti J-30I型冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司；UV-16001型紫外-可見分光光度計 日本島津儀器有限公司；XHF-D型內(nèi)切式勻漿機 寧波新芝生物科技股份有限公司；Elix10型純水機 美國密理博公司；Bio-Rad Protean II xi cell型電泳儀 美國Bio-Rad公司；S25型渦旋混合器 德國IKA集團；F-2500型熒光分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 豬背部最長肌的準備

將凍存于－80 ℃下的1 cm×1 cm×1 cm的塊狀背部最長肌放在4 ℃下過夜解凍，然后用吸水紙輕輕擦拭，以去除肉塊表面水分。

1.3.2 豬背部最長肌的氧化

豬背部最長肌的氧化參考Liu Zelong等[11]的方法并稍作修改，將背部最長肌與羥自由基生成體系的溶液以1∶4（m/V）混合。羥自由基生成體系溶液中FeCl3和VC的濃度分別為0.01 mmol/L和0.1 mmol/L，不同組別的H2O2濃度分別為0（對照組）、0.5、1、3、5、10、20 mmol/L。背部最長肌樣品與自由基生成體系在4 ℃下反應24 h，在氧化過程中將混合物輕輕攪動。氧化處理后，通過添加1 mmol/L EDTA終止氧化反應，將背部最長肌用吸水紙輕輕擦干后測定離心損失率并提取MP和SP。

1.3.3 豬背部最長肌離心失水率的測定

離心失水率的測定參考Shen Xue等[12]的方法并略作修改，取10 g背部最長肌用吸水紙包裹，然后放入離心管中。在2 380×g下（4 ℃）離心10 min，按下式計算離心失水率。

式中：m1表示離心前背部最長肌的質(zhì)量/g；m2表示離心后背部最長肌的質(zhì)量/g。

1.3.4 SP和MP的提取

SP和MP的提取參考Wang Zhaoming等[13]的方法并稍作修改，將10 g絞碎的背部最長肌與4 倍體積的0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（包含0.1 mol/L NaCl、0.001 mol/L EGTA、0.002 mol/L MgCl2，pH 7.0）混合，在7 000 r/min下均質(zhì)1 min。然后在7 680×g下（4 ℃）離心15 min，離心后上清液即為SP。將離心后的沉淀重復上述操作2 次，然后于得到的沉淀中加入4 倍體積的0.1 mol/L的NaCl溶液，按上述操作參數(shù)重復兩次均質(zhì)和離心。最后一次離心前加入40 mL 0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.0），在7 000 r/min下均質(zhì)1 min，然后用4 層紗布過濾，得到的濾液在7 680×g下（4 ℃）離心15 min，最后得到的沉淀就是MP。

1.3.5 SP和MP相關(guān)性質(zhì)分析

1.3.5.1 羰基含量的測定

參考Wang Zhaoming等[14]的方法，并略作修改。在5 mL離心管中加入0.8 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的蛋白，然后加入1.6 mL含有質(zhì)量分數(shù)0.3% 2,4-二硝基苯肼的3 mol/L HCl，在室溫下反應30 min，空白組中不添加2,4-二硝基苯肼。然后加入0.8 mL質(zhì)量分數(shù)40%的三氯乙酸，搖勻后離心（7 680×g、4 ℃、5 min），棄上清液。沉淀用2 mL乙醇-乙酸乙酯（1∶1，V/V）溶液洗滌離心3 次，最后得到的沉淀用3 mL 6 mol/L的鹽酸胍溶液溶解，在370 nm波長下測吸光度。根據(jù)摩爾消光系數(shù)（22 000（L/（mol·cm））計算羰基含量。

1.3.5.2 內(nèi)源熒光光譜的測定

內(nèi)源熒光光譜的測定參考Wang Zhaoming等[15]的方法，將SP和MP配制成0.5 mg/mL的溶液，用熒光分光光度計記錄300～400 nm的熒光光譜。激發(fā)波長為295 nm，掃描速率為300 nm/min。

1.3.5.3 紫外吸收光譜的測定

紫外吸收光譜的測定參考Lü Liangtao等[16]的方法并稍作修改。將SP和MP配制成0.5 mg/mL的溶液，然后用紫外-可見分光光度計測定SP和MP溶液在230～320 nm波長處的紫外吸收光譜。

1.3.5.4 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）參考Gan Xiao等[17]的方法并稍作修改，將SP和MP配制成質(zhì)量濃度2 mg/mL的溶液，然后，將SP和MP溶液與上樣緩沖液按體積比1∶4的比例混勻，于沸水浴加熱5 min。使用電泳儀進行電泳。制備質(zhì)量分數(shù)5%的濃縮膠和10%分離膠。將20 μL上述樣品混合物加到上樣孔中。使用9～245 kDa的標準蛋白來確定分子質(zhì)量。

1.3.5.5 Western-Blot法測定鈣轉(zhuǎn)運ATP酶和組織蛋白酶L表達量

Western-Blot實驗參考Fu Qingquan等[18]的方法并稍作修改，配制質(zhì)量分數(shù)10%的分離膠和4%的濃縮膠。上樣量為50 μg，電泳電壓為80 V，電泳液為甘氨酸緩沖液。電泳完成后，取出一張聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜置于3 層濾紙中間，放入轉(zhuǎn)移槽中，加滿轉(zhuǎn)移液，80 V約1 h，轉(zhuǎn)完后將膜自然晾干。用0.01 mol/L磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate buffered saline-Tween，PBST）洗滌5 min，然后轉(zhuǎn)移至含封閉液的容器中，室溫下封閉約4 h。然后用0.01 mol/L PBST洗滌3 次。加入稀釋的I抗體，室溫下3～4 h，用0.01 mol/L PBST洗滌3 次。加辣根過氧化物酶（herseradish peroxidase，HRP）標記的二抗，室溫下1～2 h，用0.01 mol/L PBST洗滌3 次。將PVDF置于化學發(fā)光試劑中增強反應1～3 min，最后放入凝膠成像系統(tǒng)進行圖像掃描分析。采用Image J圖像分析軟件對Western Blot條帶進行灰度分析，將目標條帶與內(nèi)參條帶灰度的比值作為目標蛋白的表達量。

1.3.6 背部最長肌微觀結(jié)構(gòu)的觀察

微觀結(jié)構(gòu)的觀察參考Zhang Dong等[19]的方法，將背部最長肌切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm塊狀，并在4 ℃下于含有質(zhì)量分數(shù)2.5%戊二醛的磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2）中固定24 h。將固定后的樣品用磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.2）洗滌3 次，并分別用30%、50%、70%、90%、100%乙醇溶液逐漸脫水（每個階段1 h）。將樣品用真空冷凍干燥機干燥，然后將干燥的樣品切片噴金，并通過掃描電子顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗重復3 次，所有結(jié)果均以平均值±標準差的形式表示。運用SPSS 22.0軟件對實驗結(jié)果進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），用最小顯著差異分析（least significant difference，LSD）進行顯著性分析，并利用該軟件進行指標間的皮爾遜相關(guān)性分析，繪圖采用Origin 8.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外氧化對豬背部最長肌離心損失率的影響

由圖1可知，隨著H2O2濃度的增加，豬背部最長肌的離心損失率呈現(xiàn)顯著增加的趨勢（P＜0.05），這可能是由于氧化程度的增加導致肉的蛋白質(zhì)氧化變性嚴重，進而影響肉的組織結(jié)構(gòu)，導致結(jié)構(gòu)松散，使得在外力作用下水分損失加劇。一般而言，肌纖維存儲了許多水分，當氧化程度增加時，肌束和肌束膜間會出現(xiàn)明顯的間隙，細胞排出的水可以儲存在間隙中。但是間隙中儲存的水分和肌肉結(jié)合不緊密，在離心作用下會被輕易排出，導致離心損失率的增加[20]。Xia Minquan等[21]在研究中發(fā)現(xiàn)，添加一定量的SP可以縮小MP凝膠中的空隙，使得游離水含量下降，結(jié)合水含量增加，進而提高蛋白凝膠保水能力。

圖1 不同氧化程度對豬背部最長肌離心損失率的影響Fig. 1 Effects of different oxidation degrees on centrifugal loss of pork Longissimus dorsi

2.2 體外氧化對豬背部最長肌中蛋白羰基含量的影響

由圖2可知，隨著H2O2濃度的增加，SP和MP中的羰基含量均呈顯著增加的趨勢（P＜0.05）。當H2O2濃度達到20 mmol/L時，SP和MP中的羰基含量均達到最大值，分別為1.51 nmol/mg和2.20 nmol/mg。這與Zhang Dong等[8]發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同濃度H2O2處理的MP羰基含量變化類似，其發(fā)現(xiàn)當H2O2濃度為20 mmol/L時，相比于對照組，H2O2處理組的MP羰基含量增加了近2 nmol/mg。Lu Han等[22]在研究中也發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度的增加，魚肉中MP的羰基含量從0.45 nmol/mg增加到1.30 nmol/mg。蛋白質(zhì)羰基化合物的形成是由于在氧化應激條件下，蛋白質(zhì)的側(cè)鏈氨基酸被氧化，進而轉(zhuǎn)為羰基衍生物[22]。此外，活性氧可以從氨基酸殘基的α-C—H鍵提取氫原子，生成穩(wěn)定的碳中心自由基，碳中心自由基可以繼續(xù)與氧發(fā)生反應進而生成烷氧自由基，然后通過二酰胺、α-酰胺化途徑發(fā)生裂解，導致蛋白質(zhì)發(fā)生羰基化[15]。也有研究者指出活性氧會導致肽鍵破壞，引發(fā)肽段的裂解以及蛋白質(zhì)骨架裂解，這也是導致蛋白質(zhì)羰基化的機制[23]。

圖2 不同氧化程度對豬背部最長肌中SP和MP羰基含量的影響Fig. 2 Effects of different oxidation degrees on the carbonyl contents of sarcoplasmic protein (SP) and myofibrillar protein (MP) in pork Longissimus dorsi

2.3 體外氧化對豬背部最長肌中蛋白內(nèi)源熒光光譜的影響

蛋白中一些芳香族的氨基酸對氧化應激比較敏感，內(nèi)源熒光光譜能夠反映蛋白中色氨酸等具有熒光基團的氧化反應程度，因此可以表征蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及構(gòu)象的變化[4]。由圖3可知，不同處理組蛋白在波長335 nm附近出現(xiàn)了強熒光吸收峰。隨著H2O2濃度的增加，SP和MP的熒光強度相比于對照組均呈下降的趨勢。SP和MP的熒光強度在不同處理組中不同，這可能是SP和MP中的熒光基團含量不一樣導致的。隨著氧化強度的增加，兩種蛋白的內(nèi)源熒光強度呈下降趨勢，這可能是由于隨著氧化強度的增加，蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚集加劇，使得色氨酸殘基等熒光基團被包埋，引起蛋白熒光強度的下降[24]。也有研究者認為，在氧化應激條件下，隱藏的一些疏水殘基，特別是色氨酸的吲哚側(cè)鏈逐漸暴露在氧化環(huán)境中，熒光基團被攻擊，最終導致熒光強度的降低[25]。因此，蛋白熒光強度的降低可能是色氨酸殘基被活性氧攻擊，導致蛋白交聯(lián)聚集包埋了熒光基團。

圖3 不同氧化程度對豬背部最長肌中SP和MP內(nèi)源熒光光譜的影響Fig. 3 Effects of different oxidation degrees on the endogenous fluorescence spectra of SP and MP in pork Longissimus dorsi

2.4 體外氧化對豬背部最長肌蛋白紫外光譜的影響

蛋白質(zhì)紫外光譜可用于評估蛋白中芳香族氨基酸側(cè)鏈的變化，進而反映蛋白構(gòu)象的變化[26]。由圖4可知，兩種蛋白的紫外光譜中，特征吸收峰均出現(xiàn)在270 nm附近，這表明苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸殘基是豬背部最長肌蛋白中最主要的芳香族氨基酸殘基[7]。隨著H2O2濃度的增加，兩種蛋白的紫外特征吸收峰強度均呈下降的趨勢，這表明苯丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生了明顯變化。Wang Zhaoming等[25]指出氧化會導致蛋白的酪氨酸及色氨酸殘基的微環(huán)境發(fā)生改變，進而導致紫外特征吸收峰強度下降。這一結(jié)果與蛋白熒光強度降低的結(jié)果一致。Lü Liangtao等[16]在研究中也指出蛋白表面的酪氨酸及色氨酸殘基發(fā)生氧化修飾會導致蛋白的最大紫外特征吸收峰強度下降。

圖4 不同氧化程度對豬背部最長肌中SP和MP紫外光譜的影響Fig. 4 Effects of different oxidation degrees on the UV absorption spectra of SP and MP in pork Longissimus dorsi

2.5 體外氧化對豬背部最長肌蛋白的SDS-PAGE圖譜影響結(jié)果

采用SDS-PAGE在還原（＋β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME））和非還原（－β-ME）條件下，研究了不同H2O2濃度對豬背部最長肌中SP和MP氧化降解的影響。如圖5A1所示，與對照組相比，隨著H2O2濃度的增加，SP中100、60、45 kDa附近的條帶強度逐漸減弱，而在25～45 kDa之間出現(xiàn)新的條帶，并且小分子條帶強度隨著氧化強度的增大而呈增加趨勢。如圖5A2所示，在β-ME存在的情況下，180、100、60、45 kDa附近的條帶被還原。如圖5B1所示，隨著H2O2濃度的增加，MP中245 kDa附近的條帶光密度呈現(xiàn)下降的趨勢，而凝膠頂部積累的條帶光密度呈上升的趨勢。此外，隨著H2O2濃度的增加，在35～45 kDa之間出現(xiàn)了新的條帶。如圖5B2所示，在β-ME存在的情況下，MP中消失的條帶會被還原，但凝膠頂部仍有積累的條帶，這說明除二硫鍵外還有其他的化學鍵參與了蛋白質(zhì)的交聯(lián)。這些結(jié)果表明隨著H2O2濃度的增加，豬背部最長肌中SP和MP氧化降解加劇。有研究者指出，活性氧能從半胱氨酸S—H基團提取出氫原子，從而產(chǎn)生硫中心自由基，硫中心自由基可進一步和其他巰基反應生成二硫鍵，產(chǎn)生蛋白交聯(lián)[23]。此外，蛋白中酪氨酸及色氨酸在氧化脅迫下可導致酪氨酸與酪氨酸、酪氨酸與色氨酸之間產(chǎn)生交聯(lián)[27]，進而導致蛋白質(zhì)聚集體的產(chǎn)生。這一結(jié)果與氧化強度的增加導致蛋白內(nèi)源熒光強度的降低一致。

圖5 H2O2對背部最長肌中SP和MP在還原和非還原條件下凝膠電泳圖譜的影響Fig. 5 Effect of H2O2 on SDS-PAGE patterns of SP and MP in pork Longissimus dorsi under reducing and non-reducing conditions

2.6 體外氧化對豬背部最長肌中鈣轉(zhuǎn)運ATP酶表達量的影響

作為一種膜蛋白，鈣轉(zhuǎn)運ATP酶在細胞鈣穩(wěn)態(tài)及信號傳導中起著非常重要的作用。如圖6所示，與對照組相比，隨著H2O2濃度的增加，豬背部最長肌中鈣轉(zhuǎn)運ATP酶的表達量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。但隨著氧化強度的進一步增加（H2O2的濃度達到10 mmol/L和20 mmol/L），鈣轉(zhuǎn)運ATP酶的表達量無顯著差異（P＞0.05）。當氧化強度較低時，鈣轉(zhuǎn)運ATP酶表達量呈下降趨勢可能是由于適當?shù)难趸瘜е缕湎牧吭黾樱坏谳^低氧化強度下，細胞的穩(wěn)態(tài)沒有受到較大的影響，胞內(nèi)外的鈣離子轉(zhuǎn)運處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)，因此鈣轉(zhuǎn)運ATP酶表達量雖然下降，但變化不顯著。當氧化強度繼續(xù)增大時，胞內(nèi)外的鈣離子處于不平衡的狀態(tài)，為了維持胞內(nèi)鈣離子處于較低水平，鈣轉(zhuǎn)運ATP酶被激活以促進將鈣離子轉(zhuǎn)運至肌質(zhì)網(wǎng)，保護細胞免受破壞[28]；因此，隨著H2O2濃度繼續(xù)增加，鈣轉(zhuǎn)運ATP酶的表達量整體呈現(xiàn)上升的趨勢。

圖6 不同氧化程度對豬背部最長肌中鈣轉(zhuǎn)運ATP酶表達量的影響Fig. 6 Effects of different oxidation degrees on the expression of calcium-transporting ATPase in pork Longissimus dorsi

2.7 體外氧化對豬背部最長肌中組織蛋白酶L表達量的影響

組織蛋白酶作為一類重要的蛋白酶，廣泛存在于動植物及其他生物中[29]。有研究者指出組織蛋白酶L對肉品的嫩度和保水性具有一定影響[30]。組織蛋白酶L作為溶酶體中半胱氨酸蛋白酶的主要成員，其具有獨特的合成及轉(zhuǎn)運方式[31]。如圖7所示，隨著氧化強度的增加，組織蛋白酶L的表達量呈下降趨勢，這可能是由于隨著氧化強度的增加，組織蛋白酶L與其他蛋白酶發(fā)生水解反應，導致其含量下降。此外，氧化強度的增加可能導致溶酶體膜的穩(wěn)定性下降，進而釋放并激活較多的組織蛋白酶L，而激活的組織蛋白酶L又會參與蛋白質(zhì)的降解，最終導致其含量的下降。張麗等[32]也指出，氧化會導致組織蛋白酶喪失活力。

圖7 不同氧化程度對豬背部最長肌中組織蛋白酶L表達量的影響Fig. 7 Effects of different oxidation degrees on the expression of cathepsin L in pork Longissimus dorsi

2.8 體外氧化對豬背部最長肌微觀結(jié)構(gòu)的影響

肉制品的組織結(jié)構(gòu)與其品質(zhì)特性如保水能力密切相關(guān)[33]。如圖8A所示，當H2O2濃度較小時（＜1 mmol/L），肌束纖維之間的間隙無明顯差異，當H2O2濃度大于3 mmol/L時，肌束纖維之間的間隙增加，當H2O2濃度達到20 mmol/L，肌束纖維之間的間隙明顯增大。這說明不同H2O2濃度對肌肉的纖維結(jié)構(gòu)有不同的影響，高濃度的H2O2會導致肌肉纖維結(jié)構(gòu)變得松散。如圖8B所示，當H2O2濃度較小時（＜1 mmol/L），肌肉的纖維束表面是光滑整齊的。隨著H2O2濃度繼續(xù)增加，纖維束表面開始變得粗糙，當H2O2濃度達到10 mmol/L和20 mmol/L時，一些纖維束的表面遭到嚴重破壞，甚至出現(xiàn)斷裂的現(xiàn)象。這表明高濃度的H2O2會嚴重影響肌肉的纖維結(jié)構(gòu)，導致纖維束的完整性遭到破壞。有研究者指出，氧化強度的增加導致肌肉組織結(jié)構(gòu)間隙的增加是因為氧化導致了肌原纖維的收縮[11]?；钚匝鯐е录±w維中的肌球蛋白和肌動蛋白發(fā)生氧化聚集，這一過程涉及到肌球蛋白內(nèi)部及分子間的交聯(lián)，以及肌絲內(nèi)部和相互之間的交聯(lián)。單個的肌原纖維和肌絲的聚集導致彼此之間間隙增加，累積起來最終導致纖維束之間的間隙顯著增加[34]。

圖8 不同氧化程度對豬背部最長肌微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig. 8 Effects of different oxidation degrees on the microstructure of pork Longissimus dorsi

2.9 相關(guān)性分析和PCA結(jié)果

皮爾遜相關(guān)性分析（表1）與主成分分析（圖9）被廣泛用于評估變量之間的相關(guān)性。載荷圖中載荷向量的距離和方向可以表征各個指標間的相關(guān)性。由表1可知，H2O2濃度與豬背部最長肌的離心損失率之間呈極顯著正相關(guān)（r＝0.759，P＜0.01），與曹云剛等[35]得到的結(jié)果一致，表明H2O2濃度是影響豬背部最長肌保水性的重要因素。H2O2濃度與豬背部最長肌SP羰基含量（r＝0.713，P＜0.01）和MP羰基含量（r＝0.842，P＜0.01）均呈極顯著正相關(guān)，與豬背部最長肌SP最大熒光強度（r＝－0.952，P＜0.01）和MP最大熒光強度（r＝－0.945，P＜0.01）均呈極顯著負相關(guān)，與豬背部最長肌中的鈣轉(zhuǎn)運ATP酶表達量呈極顯著正相關(guān)（r＝0.853，P＜0.01），而與組織蛋白L表達量呈極顯著負相關(guān)（r＝－0.738，P＜0.01）。鈣轉(zhuǎn)運ATP酶和組織蛋白酶L與豬背部最長肌SP和MP的氧化指標具有較高的相關(guān)性，與離心損失率也具有較高的相關(guān)性。由圖9可知，鈣轉(zhuǎn)運ATP酶表達量與豬背部最長肌SP和MP的蛋白質(zhì)氧化指標（羰基含量）在右側(cè)象限且彼此靠近，而組織蛋白酶L表達量與豬背部最長肌SP和MP的蛋白質(zhì)氧化指標（熒光強度）在左象限且彼此靠近，表明鈣轉(zhuǎn)運ATP酶和組織蛋白酶L與蛋白質(zhì)氧化之間具有潛在的聯(lián)系。綜上，情況表明H2O2濃度越高，豬背部最長肌的SP和MP的氧化降解越嚴重。此外，H2O2濃度越高，對豬背部最長肌中酶的表達調(diào)控影響也越大，酶的表達又會反作用于蛋白質(zhì)，引起蛋白質(zhì)的氧化降解。因此，在H2O2的氧化脅迫下，豬背部最長肌中的蛋白及酶活性發(fā)生變化，引起微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進而導致保水能力下降。

表1 各指標相關(guān)性分析Table1 Correlation analysis among all indicators tested

圖9 前兩個主成分各指標載荷圖Fig. 9 PCA Loading plot of PC1 versus PC2

3 結(jié) 論

本研究主要探討了氧化脅迫對豬背部最長肌內(nèi)源酶及保水性的影響。結(jié)果表明，背部最長肌中SP和MP羰基含量隨H2O2濃度的增大而升高。SP和MP最大熒光強度隨H2O2濃度的增大而下降。H2O2濃度的增加會導致背部最長肌中蛋白質(zhì)的氧化降解程度加劇，引起豬背部最長肌的離心失水率增加，特別是當H2O2濃度達到10 mmol/L和20 mmol/L時離心損失率與對照組相比顯著增加。同時實驗也證明了不同H2O2濃度的氧化脅迫下，豬背部最長肌中內(nèi)源酶具有不同的表達量，而內(nèi)源酶又會反作用于蛋白質(zhì)，引起蛋白質(zhì)的氧化降解。在氧化脅迫條件下，豬肉中的內(nèi)源酶參與了蛋白質(zhì)氧化降解的調(diào)控，最終影響豬肉的保水能力。