陳慶學(xué)，石豐毅，趙麗娜，梁勝男，Masumuzzanm MD，霍貴成，李柏良

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150036）

母乳是嬰兒營(yíng)養(yǎng)的最佳選擇。母乳中的HMOs是僅次于乳糖和脂肪的第三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，HMOs不能被人近端腸道吸收，但可在大腸發(fā)揮益生元的作用，其對(duì)嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育、免疫系統(tǒng)發(fā)育、腸道微生態(tài)系統(tǒng)建立和腸黏膜屏障功能等方面有重要的作用。HMOs或許能縮小配方粉喂養(yǎng)嬰兒與母乳喂養(yǎng)兒的差距[1]。母乳中約含有1%的HMOs，在足月母乳中巖藻糖基化、唾液酸化和非巖藻糖基化中性HMOs的比例大約為35%～50%、12%～14%和42%～55%[2]。HMOs的體內(nèi)代謝關(guān)系到其功能活性，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)特性又決定了體外合成的難度。因此，了解HMOs的體內(nèi)代謝與體外合成對(duì)HMOs的深入研究與應(yīng)用具有重要意義。

1 HMOs的差異性與多樣性

1.1 HMOs在個(gè)體間的差異性

研究指出HMOs在不同個(gè)體間存在著明顯的差異。Mcguire等[3]的研究團(tuán)隊(duì)報(bào)告了不同地理環(huán)境的人群HMOs在組成與濃度上的差異。出現(xiàn)這種差異主要受到母親的血型和相關(guān)基因的表達(dá)以及外在環(huán)境因素的影響。不同Lewis（Le）血型及分泌類(lèi)型與HMOs的組成密切相關(guān)，其在體內(nèi)表達(dá)的含量和活性的高低決定了HMOs糖鏈中成分結(jié)構(gòu)的差異。其次，外在原因還包含母親飲食、地域環(huán)境（比如一個(gè)地區(qū)城市與農(nóng)村之間）等因素的影響。HMOs在同一個(gè)體的不同哺乳期也存在不同，并且隨著體質(zhì)量與年齡的變化而變化[3]。HMOs在人初乳中質(zhì)量濃度達(dá)到20～25 g/L，而在成熟乳中降至5～10 g/L。在24～28 歲母親的乳中，HMOs的含量明顯高于14～18 歲母親的乳汁[4]。此外，與足月分娩的婦女相比，早產(chǎn)兒的母乳中HMOs的濃度高于足月兒，并且早產(chǎn)婦女乳汁中含有的巖藻糖基化或唾液酸化的HMOs存在更大的差異[5]。

了解不同HMOs的結(jié)構(gòu)差異是非常重要的，因?yàn)樵絹?lái)越多的研究表明，不同結(jié)構(gòu)的HMOs可能對(duì)嬰兒健康和疾病風(fēng)險(xiǎn)有特定的影響。例如，一項(xiàng)關(guān)于墨西哥嬰兒的研究中，食用低濃度2’-巖藻糖基乳糖（2’-fucosyllactose，2’-FL）的嬰兒腹瀉發(fā)病率顯著高于食用高濃度2’-FL的嬰兒[6]。另一項(xiàng)研究表明含有更高濃度的Fut2基因編碼的HMOs與嬰兒低過(guò)敏風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)[7]。此外，較低濃度的總HMOs與較高濃度的3’-唾液酸乳糖（3’-sialyllactose，3’-SL）與人類(lèi)免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）的傳播有關(guān)[8]。目前，眾多的研究表明了HMOs在人體間差異的原因，但對(duì)于這些因素以什么樣的形式產(chǎn)生影響，以及影響的程度尚不明確；因此，需要進(jìn)行針對(duì)性的基因組學(xué)分析，以確定這些差異受遺傳變異影響的程度，同時(shí)，需進(jìn)一步分析生活條件、行為和環(huán)境因素對(duì)差異產(chǎn)生的貢獻(xiàn)大小。

1.2 HMOs結(jié)構(gòu)的多樣性

HMOs結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類(lèi)繁多。了解母乳中HMOs不同的結(jié)構(gòu)與含量具有重要意義。目前已經(jīng)具有較為成熟的檢測(cè)分析方法能夠?qū)Σ糠諬MOs進(jìn)行定性定量分析。首先，由于母乳中含有的多種成分，如脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、乳糖和鹽類(lèi)，可能會(huì)干擾HMOs的定量檢測(cè)，因此分析檢測(cè)樣品中HMOs必須進(jìn)行前處理。脂類(lèi)和蛋白質(zhì)通常通過(guò)在0～4 ℃下離心、氯仿/甲醇萃?。ㄖ貜?fù)2～3 次）、乙醇沉淀、乙腈沉淀和超濾分離等技術(shù)去除[9-10]。然后，采用無(wú)孔石墨化碳將樣品進(jìn)一步純化去除鹽類(lèi)、乳糖、還原劑等[11]。最后，將處理后的樣品先進(jìn)行分離，之后通過(guò)檢測(cè)器檢測(cè)。用于樣品分離的技術(shù)，包括多孔石墨化碳、毛細(xì)管電泳、液相色譜，一般采用質(zhì)譜和熒光檢測(cè)器檢測(cè)。目前，已有超過(guò)150 種HMOs被檢測(cè)出來(lái)。

HMOs是由5種單體排列組合后加到乳糖分子上構(gòu)成的，這5 種單體分別是N-乙酰葡萄糖胺（N-acetylglucosamine，GlcNAc）、D-葡萄糖（D-glucose，Glc）、D-半乳糖（D-galactose，Gal）、L-巖藻糖（L-fucose，F(xiàn)uc）、唾液酸（sialic acid，SA）。HMOs一般包含3～22 個(gè)糖單元，具有一定的結(jié)構(gòu)骨架（圖1A、B），其還原端都含有一個(gè)乳糖（Galβ1-4Glc）[12]。乳糖可以直接被Fuc與N-乙酰神經(jīng)氨酸（N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac）（SA的前體）修飾。同時(shí)，HMOs糖鏈的延伸也可以通過(guò)在還原端的乳糖上連接兩種二糖結(jié)構(gòu)（I型鏈Gal-β-1,3-GlcNAc和II型鏈Gal-β1-4GlcNAc）進(jìn)行糖鏈的延伸。利用β-1,3鍵添加二糖結(jié)構(gòu)使糖鏈發(fā)生線性延伸，而兩個(gè)二糖之間的β-1,6鍵則引入鏈的分支[13]，延伸的糖鏈又可以進(jìn)行巖藻糖基化或唾液酸化。一些HMOs還會(huì)以幾種異構(gòu)體形式存在，例如乳酰-N-巖藻糖基五糖（圖1C）。之前的研究基于所發(fā)現(xiàn)的HMOs結(jié)構(gòu)，提出了一個(gè)由13 個(gè)結(jié)構(gòu)組成的核心單元。但隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)了更多新的HMOs結(jié)構(gòu)，13 個(gè)核心單元已不能完全描述所發(fā)現(xiàn)的HMOs結(jié)構(gòu)。因此，有研究人員提出將13 個(gè)核心單元擴(kuò)展到19 個(gè)。本文給出了新提出的6 種核心單元的結(jié)構(gòu)示意圖[14]（圖1D）。

圖1 HMOs的結(jié)構(gòu)[12,14]Fig. 1 Structures of HMOs[12,14]

HMOs是在母親乳腺中糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成的，乳腺中糖基轉(zhuǎn)移酶的合成受基因調(diào)控，除巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶外，所有的母親自身都能夠合成其他糖基轉(zhuǎn)移酶[15]。而巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶與母親分泌類(lèi)型和Lewis血型抗原有關(guān)，分泌型（secretor，Se）基因編碼一個(gè)α-1,2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（fucosyltransferase 2，F(xiàn)UT2），Le基因編碼α-1,3/4巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶（FUT3）[16]。不同母親的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)具有很大差異，導(dǎo)致酶活性不同，從而導(dǎo)致不同個(gè)體中巖藻糖基化HMOs的差異。因此，可以將女性分為4 組（Se±/Le±）不同的表現(xiàn)形式。唾液酸化的HMOs則通過(guò)唾液酸轉(zhuǎn)移酶將一個(gè)或多個(gè)SA添加到HMOs的糖鏈上，這一過(guò)程是將Neu5Ac連接至末端Gal或內(nèi)部GlcNAc上[17]。

2 HMOs的生物學(xué)功能

2.1 調(diào)節(jié)腸道菌群

腸道菌群與宿主的健康和疾病有著密切的關(guān)系，它在腸道營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝、抵抗致病微生物定植、促進(jìn)免疫系統(tǒng)發(fā)育及成熟等方面發(fā)揮著重要作用[18]。健康腸道菌群結(jié)構(gòu)的建立對(duì)嬰兒的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，嬰兒在生命前期腸道內(nèi)微生物狀態(tài)是逐漸向著雙歧桿菌占主導(dǎo)地位過(guò)渡的[19]，而嬰兒腸道的微生物定植是一個(gè)具有挑戰(zhàn)的過(guò)程[20]。研究發(fā)現(xiàn)缺少HMOs的配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒與母乳喂養(yǎng)的嬰兒相比腸道菌群更脆弱[21]。一方面，HMOs能夠作為嬰兒腸道中有益細(xì)菌的代謝基質(zhì)，有助于塑造嬰兒腸道微生物群；另一方面，HMOs經(jīng)腸道益生菌代謝后產(chǎn)生多種人體可吸收利用的短鏈脂肪酸和乳酸鹽，并使腸道的pH值呈酸性，從而抑制過(guò)度繁殖的有害菌[22]。

2.2 調(diào)節(jié)免疫

HMOs在嬰兒免疫系統(tǒng)的發(fā)育中發(fā)揮著特殊的作用。HMOs的豐富多樣性具有調(diào)節(jié)嬰兒先天性免疫和適應(yīng)性免疫的潛力。胃腸道對(duì)嬰兒的免疫至關(guān)重要，腸道上皮構(gòu)成一個(gè)功能屏障，阻止腸道內(nèi)微生物群特別是病原菌對(duì)宿主的侵襲，并且提供大量免疫細(xì)胞。嬰兒的胃腸道極為敏感，容易出現(xiàn)炎癥基因的過(guò)度表達(dá)和負(fù)責(zé)先天性信號(hào)反饋調(diào)節(jié)的基因表達(dá)不足，這可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)的放大，導(dǎo)致過(guò)度炎癥[23]。母乳喂養(yǎng)可以顯著改善嬰兒腸道免疫功能，這主要是因?yàn)槟溉橹械腍MOs可以阻止嬰兒腸內(nèi)炎癥基因的表達(dá)，提高嬰兒的免疫力。

巖藻糖基HMOs通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制抑制細(xì)菌毒素與腸黏膜受體的黏附，如空腸彎曲菌和大腸桿菌毒素[24]。大多數(shù)巖藻糖基HMOs能夠促進(jìn)輔助型T細(xì)胞2（T helper 2 cell，Th2）的活性，如2’-FL、LNFP I、LNFP III[24]。同時(shí)2’-FL與LNFP I在體外降低了促炎性巨噬細(xì)胞源性白介素（interleukin，IL）-12和γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）的水平，增加了促進(jìn)Th2極化的IL-10水平[25]。而LNFP Ⅲ在體外抑制巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞2（dendritic cell 2，DC2）的成熟，從而促使IL-4和抑制促炎性IFN-γ的產(chǎn)生[26]。與巖藻糖基HMOs類(lèi)似，唾液酸化HMOs也被證明能阻止病原菌與腸道上皮細(xì)胞的結(jié)合，增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)。含一個(gè)或兩個(gè)唾液酸殘基的HMOs組分顯著降低血小板中性粒細(xì)胞復(fù)合體（platelet-neutrophil complex，PNC）的形成和中性粒細(xì)胞的活化[27]。3’-SL通過(guò)肽聚糖模式識(shí)別3（peptidoglycan pattern recognition 3，PGlyRP3）促進(jìn)Th2反應(yīng)，減少細(xì)胞IL-8、IL-12和TNF-α基因的表達(dá)[28]。另外，唾液酸化HMOs刺激DCs釋放細(xì)胞因子，促進(jìn)T細(xì)胞轉(zhuǎn)向免疫應(yīng)答更為平衡的表型Th1和Th2[29]。許多研究證實(shí)半乳糖基乳糖（galactosyllactoses，GL）具有調(diào)節(jié)免疫的能力，如3’-GL、4’-GL、6’-GL通過(guò)抑制IL-8的產(chǎn)生，進(jìn)而抑制多胞二酸（polycytodilic acid，PIC）誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞的炎癥[30]。

碳水化合物的結(jié)合物是HMOs在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用的潛在機(jī)制，一些凝集素已被證明參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，如C型凝集素、類(lèi)動(dòng)物凝集素和半乳糖凝集素[23]。一方面，HMOs可能影響凝集素功能，從而有助于細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。大多數(shù)凝集素受體在與多價(jià)碳水化合物配體交聯(lián)后通過(guò)其多聚體誘導(dǎo)信號(hào)通路[31]。另一方面，HMOs可以作為抑制性配體，唾液酸化HMOs能夠抑制選擇素介導(dǎo)的白細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞[32]。同樣，已有研究表明，一些HMOs能夠調(diào)節(jié)在啟動(dòng)細(xì)胞免疫反應(yīng)中起著中心作用的Toll樣受體（toll-like receptor，TLR）的表達(dá)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。體外實(shí)驗(yàn)表明，添加LNFP I和6’-GL可促進(jìn)TLR4的mRNA表達(dá)，而3’-SL、6’-SL和6’-GL可增強(qiáng)TLR4和TLR2的表達(dá)[24]。

2.3 抗病毒、抗菌作用

HMOs具有很強(qiáng)的抗病毒、抗菌潛力?？梢缘钟喾N病毒病原體，如諾若病毒、輪狀病毒、流感病毒、HIV[33-34]（表1）。病毒附著于宿主表面是建立病毒感染的關(guān)鍵，通過(guò)特定的碳水化合物黏附于宿主上皮細(xì)胞，許多參與這一過(guò)程的細(xì)胞表面聚糖表位已經(jīng)被鑒定，如人類(lèi)血型抗原（human blood group antigens，HBGAs），根據(jù)糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，將HBGAs分為4 種不同類(lèi)型，即血型A、B、H和Lewis[33]。HMOs抗病毒最可能的機(jī)制是通過(guò)減少病毒對(duì)靶細(xì)胞的黏附，HMOs類(lèi)似于各種細(xì)胞表面糖基化結(jié)構(gòu)如糖脂或糖蛋白結(jié)構(gòu)，能夠充當(dāng)病毒的可溶性受體[34]。一些具有抗病毒作用的HMOs單體已經(jīng)被證明（表1）。

表1 HMOs抗病毒作用Table1 Antiviral effect of HMOs

HMOs還可以像其抗病毒作用一樣，作為細(xì)菌特別是致病菌與宿主相互作用界面上的抗黏接劑，HMOs可以顯著減少大腸桿菌對(duì)培養(yǎng)的上皮細(xì)胞的附著，阻止微生物病原體進(jìn)入[35]，如導(dǎo)致大多數(shù)細(xì)菌性腹瀉的空腸彎曲菌[36]和腸致病性大腸桿菌[35]。此外，HMOs可能有一種更直接的方法來(lái)控制病原體。HMOs可以不依賴于宿主免疫，直接抑制無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae，GB）的生長(zhǎng)，GB是嬰兒侵襲性細(xì)菌感染的主要原因，通常是在分娩時(shí)垂直獲得，與嬰兒患肺炎、敗血癥和腦膜炎密切相關(guān)[37]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)存在HMOs時(shí)，GB不再增殖[38]。體外研究表明，HMOs具有類(lèi)似于一些抗生素的作用，GB利用一種糖基轉(zhuǎn)移酶將特定的HMOs結(jié)合到細(xì)胞膜中，進(jìn)而阻止GB增殖[39]。進(jìn)一步研究分離不同的HMOs組分，發(fā)現(xiàn)其抑制GB活性僅限于特定的非唾液酸化HMOs，這些非唾液酸化HMOs與多種常規(guī)抗生素具有協(xié)同作用[38]。

2.4 HMOs對(duì)腦發(fā)育的影響

越來(lái)越多的證據(jù)表明，HMOs在大腦的生長(zhǎng)發(fā)育以及認(rèn)知能力的建立中起著關(guān)鍵作用。髓鞘化、突觸的形成以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放都受到受體糖基化的調(diào)節(jié)。有報(bào)道稱(chēng)在大鼠大腦的突觸連接中有巖藻糖基化糖蛋白，并且放射性標(biāo)記的巖藻糖經(jīng)顱內(nèi)注射后可迅速并入糖蛋白并轉(zhuǎn)移到神經(jīng)末梢[40]。Vázquez等[41]首次在嚙齒動(dòng)物中證明了巖藻糖基化母乳低聚糖能提升大鼠與小鼠的認(rèn)知能力，并且增加了腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等參與記憶形成的分子。

在大腦中，SA是腦神經(jīng)節(jié)苷脂和修飾神經(jīng)細(xì)胞黏附分子的poly-SA鏈的重要組成部分。SA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與神經(jīng)元細(xì)胞間的通訊有關(guān)。母乳中的SA主要以唾液酸化的HMOs形式存在。這些唾液酸化神經(jīng)節(jié)苷脂在突觸形成、軸突生長(zhǎng)、樹(shù)突再生和神經(jīng)傳遞中起著重要作用。動(dòng)物研究表明，學(xué)習(xí)能力的提高與腦神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白中SA的濃度有關(guān)[42]。此外，研究發(fā)現(xiàn)飲食中添加3’-SL或6’-SL會(huì)增加大腦不同區(qū)域的總SA和神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合SA的濃度[43]。HMOs對(duì)嬰兒腦結(jié)構(gòu)和認(rèn)知的發(fā)育的潛在機(jī)制解析尚不完善，在嬰兒個(gè)體中的研究鮮有報(bào)道。因此，關(guān)于HMOs對(duì)腦發(fā)育影響的深入研究尤為重要，這也會(huì)為HMOs在嬰兒配方粉中的應(yīng)用增加必要性。

3 HMOs在機(jī)體內(nèi)的吸收與利用

HMOs被認(rèn)為是人類(lèi)第一益生元，在嬰兒胃腸道的上端不能被消化，這是由于嬰兒胃腸道上端缺乏糖苷水解酶和腸膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[44]，所以大多數(shù)HMOs能直接到達(dá)胃腸道遠(yuǎn)端，作為特定微生物的底物影響胃腸道微生物群的組成和活性。嬰兒代謝不同HMOs的能力與微生物群密切相關(guān)，是通過(guò)特定的細(xì)菌組合進(jìn)行的，特別是雙歧桿菌屬、擬桿菌屬和乳酸桿菌屬[45]。HMOs與利用它的細(xì)菌具有特異性，HMOs能夠特異性地刺激腸道內(nèi)微生物的活性，而這些微生物又能夠特異性地表達(dá)唾液酸酶或者巖藻糖苷酶來(lái)切割唾液酸化和巖藻糖基化的HMOs[46]。所以腸道內(nèi)多種雙歧桿菌和類(lèi)桿菌可以對(duì)不同種類(lèi)HMOs加以利用，而腸桿菌等條件致病菌對(duì)HMOs的利用能力相對(duì)較差，一些有害細(xì)菌如致瀉性大腸桿菌、梭狀芽孢桿菌等幾乎不能利用HMOs[47]。

3.1 雙歧桿菌代謝HMOs的途徑

在生命早期，雙歧桿菌是母乳喂養(yǎng)嬰兒腸道的優(yōu)勢(shì)菌群，這些細(xì)菌具備專(zhuān)用的糖苷水解酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體和其他有助于利用HMOs的分子，所以是HMOs的主要消耗者。雖然有多種雙歧桿菌可利用HMOs，但并不是所有雙歧桿菌都能利用HMOs，不同的雙歧桿菌物種和菌株在利用HMOs的能力方面具有高度特異性，這種利用HMOs的能力取決于雙歧桿菌所配備的酶[48]。研究發(fā)現(xiàn)了兩種長(zhǎng)雙歧桿菌亞種代謝HMOs的途徑（圖2）。其一，兩歧雙歧桿菌（Bifidobacterium bifidum）通過(guò)半乳糖-N-二糖/乳糖-N-二糖（galacto-N-biose/lactose-N-biose，GNB/LNB）途徑代謝HMOs[49]。兩歧雙歧桿菌具有細(xì)胞膜結(jié)合的LNB糖苷酶，能在細(xì)胞外解聚HMOs，并產(chǎn)生LNB水解產(chǎn)物，LNB通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體導(dǎo)入，并在GNB/LNB途徑中被LNB磷酸化酶進(jìn)一步水解（圖2A）。其二，嬰兒雙歧桿菌（Bifidobacterium longumsubsp.infantis）與兩歧雙歧桿菌不同，其沒(méi)有胞外將HMOs裂解為L(zhǎng)NB的乳糖-N-生物糖苷酶同系物，但是嬰兒雙歧有一個(gè)獨(dú)特的43 kb基因簇，負(fù)責(zé)編碼一系列糖苷酶、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體和細(xì)胞外寡糖溶質(zhì)結(jié)合蛋白[50]。所以HMOs能夠通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體完整地運(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)，由各種胞漿糖苷酶進(jìn)行水解。如：巖藻糖苷酶、β-半乳糖苷酶、唾液酸酶（圖2B）[51]。

圖2 兩歧雙歧桿菌（A）和嬰兒雙歧桿菌（B）代謝HMOs的途徑[52]Fig. 2 Metabolic pathways of HMOs in Bifidobacterium bifidum (A)and Bifidobacterium infantis (B)[52]

3.2 Roseburia代謝HMOs的途徑

低聚糖抵抗人體胃部及腸道前端酶的消化到達(dá)腸道末端為腸道菌群的建立提供主要驅(qū)動(dòng)力。雙歧桿菌屬不同成員在利用HMOs方面的競(jìng)爭(zhēng)力，加強(qiáng)了雙歧桿菌在母乳喂養(yǎng)嬰兒的腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)地位。嬰兒腸道微生物群在斷奶和引入固體食品期間發(fā)生顯著變化，即雙歧桿菌被硬壁菌取代，成為成熟腸道菌群中最豐富的門(mén)。在這一時(shí)期，來(lái)自碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸如丙酸鹽和丁酸鹽，其濃度顯著增加[53]。鑒于在腸道菌群建立初期，雙歧桿菌在HMOs上的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)決定其在菌群中的優(yōu)勢(shì)地位，因此在斷奶期以及之后一段時(shí)期，處于優(yōu)勢(shì)地位的梭狀芽孢桿菌目特別是Roseburia對(duì)HMOs的代謝能力受到關(guān)注。

Pichler等[54]通過(guò)基因組分析，發(fā)現(xiàn)在Roseburia中，HMOs利用位點(diǎn)具有多樣性并普遍存在，并提出了Roseburia代謝HMOs的全新途徑（圖3）。研究揭示了Roseburia兩個(gè)亞種R.homis和R.inulinivorans代謝HMOs的機(jī)制。在R. homis中，LNT、LNB和黏蛋白衍生的GNB被LNB轉(zhuǎn)運(yùn)體捕獲并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)隨后水解為L(zhǎng)NB，然后被磷酸化酶（RhGLnbp112）進(jìn)一步磷酸化為1-磷酸-α-D-半乳糖和相應(yīng)的N-乙酰己糖胺。乳糖則被β-半乳糖苷酶水解。在R.inulinivorans中，HMOs在細(xì)胞外表面先進(jìn)行初步水解，由相應(yīng)的酶（RiLea/b136）催化發(fā)生，初步水解的HMOs通過(guò)相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)體（RiLea/bBP）進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)巖藻糖苷酶（RiFuc29和RiFuc95）的協(xié)同作用去除Fuc，然后與在R. homis中一樣，被磷酸化酶進(jìn)一步分解。同時(shí)，SA單糖也可以通過(guò)相應(yīng)的轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入到R. inulinivorans進(jìn)行分解。分解產(chǎn)生的半乳糖和1-磷酸半乳糖通過(guò)Leloir途徑轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖，N-乙酰己糖胺在進(jìn)入糖酵解前轉(zhuǎn)化為6-磷酸-N-乙酰葡萄糖胺。部分經(jīng)過(guò)糖酵解產(chǎn)生的丙酮酸可以轉(zhuǎn)化為丁酸鹽[55]。

圖3 Roseburia代謝HMOs的途徑[54]Fig. 3 Metabolic pathway of HMOs in Roseburia[54]

3.3 極少量被胃腸道吸收的HMOs的代謝途徑

雖然HMOs在胃腸道上端不被消化，但HMOs對(duì)母乳喂養(yǎng)的嬰兒具有全身健康益處，如全身免疫調(diào)節(jié)。這需要HMOs進(jìn)入嬰兒的血液，研究發(fā)現(xiàn)高達(dá)1%的HMOs被胃腸道吸收[56]，在全身循環(huán)中可以被利用。一些研究利用13C標(biāo)記的半乳糖喂養(yǎng)哺乳期婦女，該標(biāo)記物可以直接進(jìn)入到母親的母乳低聚糖中，最終在嬰兒的尿液中檢測(cè)到這些13C-HMOs。這表明HMOs在吸收后可能先進(jìn)入嬰兒的血液循環(huán)中，然后通過(guò)尿液排出[57]。研究人員對(duì)16 例健康母乳喂養(yǎng)嬰兒的尿液和血漿研究發(fā)現(xiàn)，一些小分子質(zhì)量的HMOs能被完整地吸收到血液循環(huán)中，如2’-FL、3’-FL、LNnT[58]。

4 HMOs體外合成

從母乳中分離出HMOs僅在結(jié)構(gòu)鑒定和基礎(chǔ)研發(fā)有一定的應(yīng)用，但是，受限于其極低的產(chǎn)量，這種方法不適合商業(yè)化的生產(chǎn)，HMOs的有限供應(yīng)阻礙了其在嬰兒營(yíng)養(yǎng)中的應(yīng)用，并阻礙了對(duì)其生物學(xué)效應(yīng)的研究。因此，對(duì)于HMOs人工合成的探索與開(kāi)發(fā)尤為重要。從化學(xué)合成到生物技術(shù)制造的轉(zhuǎn)變，使得它們的產(chǎn)量和價(jià)格都更加趨向于商業(yè)化應(yīng)用，特別是應(yīng)用在嬰兒配方奶粉。它也加速了臨床前的基礎(chǔ)研究和臨床HMOs生物學(xué)領(lǐng)域的研究。

4.1 合成策略

越來(lái)越多關(guān)于HMOs合成的研究提出了許多HMOs合成的有效策略，這些策略為高效、精準(zhǔn)以及大量合成HMOs提供了有力依據(jù)。Faijes等[17]在研究中總結(jié)并提出了逆向聚合合成策略來(lái)進(jìn)行HMOs的合成（圖4）。最常用的逆合成策略是2＋2聚合反應(yīng)，將I型或II型糖鏈結(jié)構(gòu)組裝到乳糖受體上，并且根據(jù)相關(guān)的化學(xué)或酶反應(yīng)對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)保護(hù)和活化。該反應(yīng)能夠產(chǎn)生不同的線性糖鏈或分支糖鏈結(jié)構(gòu)，這些糖鏈結(jié)構(gòu)可以進(jìn)一步被巖藻糖基化或唾液酸化以獲得相應(yīng)的衍生物。另一個(gè)逆合成策略類(lèi)似于HMOs的生物合成途徑，在乳糖分子上以順序的方式依次添加N-乙酰氨基葡萄糖和半乳糖進(jìn)行糖鏈延伸，在延伸的糖鏈結(jié)構(gòu)上進(jìn)行巖藻糖基化或唾液酸化生成各種HMOs。這兩種策略都先添加I型或II型糖鏈再進(jìn)行巖藻糖基化或唾液酸化，而另一種策略則是直接使用巖藻糖基化或唾液酸化的供體，如Lewis表位（Lea/Lex或Leb/Ley）直接添加到乳糖分子上[1]。

圖4 逆向合成策略進(jìn)行HMOs的合成[17]Fig. 4 General retrosynthetic strategies for HMO production[17]

4.2 合成方法

4.2.1 化學(xué)合成法

糖苷鍵的構(gòu)建是化學(xué)合成中最基本、最重要的過(guò)程。保護(hù)基的選擇和糖苷化反應(yīng)中特定糖苷鍵構(gòu)型的選擇性生成，是HMOs化學(xué)合成中的關(guān)鍵點(diǎn)。特定位置與構(gòu)型的糖苷鍵的穩(wěn)定高效構(gòu)建需要選擇出適合的保護(hù)基?；瘜W(xué)合成的方法一般包括逐步縮合定向、“一鍋法”合成和固相合成。比如，Glycom A/S公司已經(jīng)通過(guò)化學(xué)合成大規(guī)模生產(chǎn)2’-FL和LNnT，并且能夠用于臨床前和臨床項(xiàng)目的研究中；Jennum等[59]利用一鍋糖基化反應(yīng)，半乳糖硫糖苷化學(xué)選擇性偶聯(lián)至鄰苯二甲酰亞胺保護(hù)的葡糖胺硫糖苷產(chǎn)生二糖，然后耦合到乳糖中的3’-位置，在第一次偶聯(lián)中形成受保護(hù)的乳糖胺硫苷時(shí)，能夠合成四糖結(jié)構(gòu)的HMOs。同時(shí)，“一鍋法”已用于高效合成由N-乙酰基乳糖胺、乳糖和巖藻糖組成的乳糖-N-新巖藻糖等五糖結(jié)構(gòu)的HMOs。

化學(xué)合成方法能夠合成所需要的特定結(jié)構(gòu)的HMOs，特別是在合成結(jié)構(gòu)復(fù)雜、分支多的HMOs時(shí)具有優(yōu)越性。但是，HMOs的化學(xué)合成過(guò)程存在許多問(wèn)題，如糖苷鍵形成的立體和區(qū)域選擇性控制的不準(zhǔn)確，多個(gè)活化、保護(hù)和脫保護(hù)步驟的復(fù)雜性使工業(yè)化生產(chǎn)具有諸多挑戰(zhàn)，同時(shí)，其HMOs得率卻難以提升。并且隨著鏈長(zhǎng)或分支模式的增加將使其合成更為復(fù)雜[60]。

4.2.2 體外酶法

體外酶法與體內(nèi)細(xì)胞工廠法都離不開(kāi)酶的作用，特別是糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH），因?yàn)镠MOs合成中糖基化反應(yīng)由這兩種酶催化進(jìn)行。糖基轉(zhuǎn)移酶催化單糖從糖核苷酸供體轉(zhuǎn)移到受體形成糖苷鍵，進(jìn)而合成二糖、寡糖或多糖。GH則在特定條件下催化轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)[12,61]。體外酶法的關(guān)鍵點(diǎn)是通過(guò)酶工程合成更為有利的酶，因?yàn)橄嚓P(guān)的酶是HMOs合成過(guò)程中必不可少的。

體外酶法合成具有能有效保證糖苷化反應(yīng)中糖苷鍵構(gòu)型和能夠?qū)翁侵饌€(gè)加到糖基受體特定位置的兩大顯著優(yōu)點(diǎn)。酶法在體外進(jìn)行，合成條件較體內(nèi)的細(xì)胞法更容易控制，所以復(fù)雜的HMOs可以通過(guò)該方法合成。體外酶法合成HMOs依然面臨許多挑戰(zhàn)，比如，獲得在體外仍然具有高效的酶是困難的，在體外反應(yīng)中還會(huì)受到酶本身性質(zhì)的限制。

4.2.3 體內(nèi)細(xì)胞工廠法

細(xì)胞法通過(guò)代謝工程微生物生產(chǎn)HMOs，利用微生物的代謝機(jī)制和體內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶的區(qū)域和立體選擇性的活性，糖基轉(zhuǎn)移酶的功能表達(dá)、其供體和受體底物在體內(nèi)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞或合成的可用性，以及防止核苷酸副產(chǎn)物對(duì)合成酶的產(chǎn)物抑制作用，重組全細(xì)胞過(guò)度表達(dá)相應(yīng)的異源糖基轉(zhuǎn)移酶基因和參與糖核苷酸供體生物合成的基因[17,62]。目前通過(guò)合成生物學(xué)和代謝工程策略構(gòu)建的一些模式宿主菌株，主要包括大腸桿菌、酵母、谷氨酸棒桿菌和枯草芽孢桿菌。在單細(xì)胞培養(yǎng)基中生產(chǎn)HMOs時(shí)，大腸桿菌是生產(chǎn)HMOs最常用的微生物[63]。

到目前為止，已有文獻(xiàn)報(bào)道使用細(xì)胞工廠方法生產(chǎn)了超過(guò)42 種結(jié)構(gòu)的HMOs。并且微生物細(xì)胞工廠和大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)已成功應(yīng)用于2’-FL的工業(yè)規(guī)模合成。但是體內(nèi)細(xì)胞工廠法目前僅能夠合成含有3～10 個(gè)單糖單元的低聚糖，并且大多數(shù)情況下不產(chǎn)生獨(dú)特的HMOs，而是低聚糖的混合物。

5 HMOs在嬰兒配方粉產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用

嬰兒配方奶粉的發(fā)展一直致力于向母乳更加靠近，但目前仍有眾多因素與母乳存在區(qū)別，特別是HMOs成分。目前市售的奶粉主要是利用益生元（將低聚半乳糖（galactooligosaccharides，GOS）與低聚果糖（fructooligosaccharides，F(xiàn)OS）按照質(zhì)量比9∶1添加）來(lái)代替HMOs，雖然益生元有一定的作用，但其取代不了HMOs。越來(lái)越多的臨床實(shí)驗(yàn)表明，添加了人工合成的HMOs的配方奶粉不僅在成分上更接近母乳，而且在功能上也更接近母乳，用該配方奶粉喂養(yǎng)的嬰兒在生長(zhǎng)發(fā)育、耐受性、吸收和排泄效率、免疫發(fā)育等方面與母乳喂養(yǎng)的足月嬰兒相似。因此，HMOs在嬰兒配方食品中的應(yīng)用已然成為這一行業(yè)發(fā)展的新趨勢(shì)。

目前，在國(guó)外部分HMOs已被允許應(yīng)用于嬰兒配方奶粉中（表2）。毋庸置疑，隨著全球各地監(jiān)管和法規(guī)進(jìn)程的推進(jìn)，可以預(yù)計(jì)會(huì)有越來(lái)越大的HMOs市場(chǎng)容量被釋放出來(lái)，也將會(huì)有更多的生產(chǎn)廠商加入進(jìn)來(lái)。當(dāng)前市場(chǎng)上HMOs的生產(chǎn)供應(yīng)商全部是國(guó)外的公司，如巴斯夫、杜邦、菲仕蘭等。雖然我國(guó)目前尚未允許HMOs在嬰兒配方粉中應(yīng)用，但是已有越來(lái)越多的學(xué)者關(guān)注到這一領(lǐng)域，并且在研究中也取得了不錯(cuò)的成果。

表2 可用于嬰兒配方粉中的HMOsTable2 HMOs approved for application in infant formula

6 結(jié) 語(yǔ)

總之，作為母乳重要組成部分的HMOs具有重要的功能作用，但是其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)限制著人們對(duì)HMOs的認(rèn)知以及應(yīng)用。隨著HMOs人工合成的進(jìn)一步發(fā)展，特別是重組細(xì)胞的生物合成在大規(guī)模生產(chǎn)和分離純化方面有了一定的進(jìn)展，HMOs在嬰兒配方奶粉中的應(yīng)用會(huì)更被重視。HMOs的種類(lèi)眾多，僅添加一種或少數(shù)幾種是不足以滿足嬰兒對(duì)HMOs的所有需求，并且HMOs在個(gè)體之間還存在著差異，因此仍需大量深入研究，特別是需要大量臨床研究為HMOs的有益效果以及在嬰兒配方奶粉中的應(yīng)用提供合理詳細(xì)的證據(jù)。