曾 齊，蔡朝霞，劉亞平，金永國

（華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，國家蛋品加工技術(shù)研發(fā)分中心，湖北 武漢 430070）

禽蛋是功能蛋白質(zhì)和生物活性蛋白質(zhì)的豐富來源。蛋清中含有卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵黏蛋白、卵類黏蛋白、溶菌酶、卵巨球蛋白、核黃素結(jié)合蛋白等多種活性蛋白質(zhì)[1]，而蛋黃中則含有卵黃球蛋白、卵黃高磷蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等功能性蛋白質(zhì)。此外，從蛋殼和蛋殼膜中也可以獲得一些具有生物活性的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)是制備生物活性肽的潛在前體物質(zhì)[2-3]。作為一種重要的膳食蛋白質(zhì)，它提供了各種超出正常營養(yǎng)價值的生理益處，這歸功于在人體胃腸道蛋白質(zhì)消化過程中所產(chǎn)的多肽[4-5]。禽蛋多肽已被認為是一類很有前景的保健食品和功能性食品組分，除了提供能量和必需氨基酸，還對人體具有多種生物活性和促進健康作用[6]。

生物活性肽通常含有2～50 個氨基酸殘基，它們作為蛋白質(zhì)中某些結(jié)構(gòu)域的組分而具有生物活性。但是，很多活性肽段存在于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部，被認為是隱蔽狀態(tài)的，很難發(fā)揮相應(yīng)活性，一旦在酶消化或食品加工過程中釋放出來，就可以作為活性化合物發(fā)揮作用。它們可以由較長的多肽或蛋白質(zhì)通過不同的處理手段（如酶解、化學(xué)水解、微生物發(fā)酵、化學(xué)合成等）來制備。動物胃腸道和來自植物和微生物的非胃腸道蛋白酶常被用來水解蛋白質(zhì)，以釋放在親本蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中隱蔽的肽序列。而非胃腸道蛋白酶因具有不同的水解特異性，往往可獲得生物效價更高的生物活性肽[7]。通常采用超濾或色譜分級對水解產(chǎn)物中最有效的組分進行富集[8]。大量的研究只集中在特定的生物活性肽上，而不是整個水解物上。然而，從生理功能調(diào)節(jié)的相關(guān)性來看，完整水解產(chǎn)物可能比鑒定的單一肽具有更大的效用，因為生物學(xué)效應(yīng)往往是復(fù)雜的，會需要更多的活性組分參與。越來越多的科學(xué)證據(jù)表明，禽蛋源生物活性肽具有抗氧化、降血壓、抗菌、抗病毒、抗癌、抗糖尿病、抗炎、金屬離子結(jié)合與轉(zhuǎn)運、免疫調(diào)節(jié)、改善骨骼健康等多種功能。除了生物活性，目前有關(guān)多肽的研究重點在于胃腸道的生理穩(wěn)定性以及腸道吸收與轉(zhuǎn)運，以探究生物活性肽的生物利用率[9]。由于具有促進健康的潛力以及相對較低的安全風(fēng)險，禽蛋源生物活性肽將會持續(xù)引起人們的極大興趣和關(guān)注。本文綜述了禽蛋源生物活性肽的制備、鑒定、功能活性及胃腸道消化吸收與轉(zhuǎn)運方面的研究進展，以期為后續(xù)的深入研究與應(yīng)用開發(fā)提供一定的參考。

1 禽蛋源生物活性肽的制備

目前，已有酶解法、化學(xué)水解法、微生物發(fā)酵法和化學(xué)合成法用于制備目標(biāo)多肽，其中酶解法應(yīng)用最為廣泛，而在基礎(chǔ)研究方面，化學(xué)合成法是未來的發(fā)展趨勢[10-14]。禽蛋蛋白質(zhì)經(jīng)過水解得到的多肽種類繁多，為了達到預(yù)期的目的，必須對水解液進一步的分離純化?，F(xiàn)在常用的多肽分離純化的方法有凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法、反相色譜法、超濾法、電泳法、固定化金屬親和層析法等，有很多的研究應(yīng)用多種方法結(jié)合的方式來達到更好的分離效果。

1.1 酶解法

目前，酶水解是從禽蛋中制備生物活性肽的主要方法。許多模擬禽蛋胃腸道消化的研究表明，胃腸道酶在水解卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵黏蛋白、卵白蛋白等禽蛋蛋白質(zhì)方面效率并不高。植物或微生物來源的蛋白酶（如嗜熱菌蛋白酶、堿性蛋白酶、中性酶等）具有比胃腸道酶更豐富的切割位點，因而這些非胃腸道蛋白酶也陸續(xù)被用來從禽蛋蛋白質(zhì)中獲得更多種類的生物活性肽。最近，一些主要的蛋清蛋白質(zhì)（卵白蛋白、類卵黏蛋白和卵黏蛋白）在37 ℃下使用多種酶（胰蛋白酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶）組合進行水解可產(chǎn)生多種生物活性肽[15-17]。卵類黏蛋白經(jīng)堿性蛋白酶和胰蛋白酶處理后得到的水解肽具有多種生物活性，包括抗氧化、金屬離子螯合和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性[16]。除酶種類的影響外，采用預(yù)處理技術(shù)（如超聲波、脈沖電場、高靜水壓力）和烹調(diào)方法（如蒸煮、油炸）也能促進禽蛋蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)生生物活性肽。禽蛋蛋白質(zhì)水解前通過適當(dāng)熱處理可使蛋白質(zhì)變性，并暴露更多的蛋白質(zhì)切割位點，從而使蛋白質(zhì)更容易被蛋白酶水解和產(chǎn)生更高的水解效率[18]。油炸全蛋的腸道消化液顯示出很強的體外ACE抑制活性，并且在連續(xù)18 d口服1 000 mg/kgmb后，自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertension rats，SHRs）的收縮壓從191.4 mmHg下降到172.1 mmHg[19]。除了加熱，Majumder等還比較了超聲波和還原劑輔助下嗜熱菌蛋白酶處理的禽蛋蛋白質(zhì)水解物對ACE活性的影響。結(jié)果表明，兩者均進一步促進了ACE抑制肽的產(chǎn)生[20]。此外，在胃蛋白酶和糜蛋白酶的作用下，采用高靜水壓力有助于卵白蛋白水解產(chǎn)生生物活性肽，特別是能夠促進多種降血壓肽的釋放[21]。已報道的大多數(shù)多肽制備方法在實驗室規(guī)模下都是有效的，但技術(shù)的不適用性和高昂的純化技術(shù)成本限制了多肽的大規(guī)模生產(chǎn)[22]。值得注意的是，當(dāng)前已初步建立了嗜熱菌蛋白酶和胃蛋白酶處理的全蛋清水解物的大規(guī)模生產(chǎn)，所得水解物的降血壓效果已在SHRs中得到驗證[23-24]。與傳統(tǒng)的水解技術(shù)相比，生物活性肽的生產(chǎn)逐漸采用了一些新型連續(xù)水解手段，如使用固定化酶和酶膜反應(yīng)器（enzymatic membrane reactor，EMR）[25-26]。酶固定化是指將酶定位在特定基底材料上以保持其長期催化能力，其可重復(fù)使用性且反應(yīng)可控[27]。EMR由于具有酶和過程穩(wěn)定性、酶的可重用性、催化效率和產(chǎn)品回收率高等優(yōu)勢，已被廣泛開發(fā)用于生產(chǎn)生物活性肽[28-29]。Wu Shufen等通過EMR和色譜法聯(lián)用的方式實現(xiàn)了多功能肽的連續(xù)水解和分離，且發(fā)現(xiàn)比傳統(tǒng)的間歇反應(yīng)器更有效，實驗過程中以酪蛋白為原料，采用EMR、分子排阻色譜和陽離子交換色譜法同時制備了3 種生物活性肽，即ACE抑制肽、酪蛋白磷酸肽和抗菌肽[30]。

1.2 化學(xué)水解法

酸水解、堿水解和其他化學(xué)試劑也常被用來從蛋白質(zhì)中制備生物活性肽。卵黃高磷蛋白是一種高度磷酸化的蛋白質(zhì)，具有很強的抗氧化和金屬結(jié)合活性，但它對蛋白酶的超強抵抗力限制了其作為生物活性肽的來源[31]。Samaraweera等探索了利用堿和酸水解手段從卵黃高磷蛋白中制備多肽的可能性，并研究了所得多肽的功能活性。結(jié)果表明，HCl或NaOH可使卵黃高磷蛋白水解程度增加，但均對水解產(chǎn)物的抗氧化能力和鐵螯合能力產(chǎn)生負面影響，而對Cu2＋螯合能力有明顯提高[32]。特別地，相比木瓜蛋白酶或堿性蛋白酶處理，卵黏蛋白堿性條件下于100 ℃加熱15 min產(chǎn)生的多肽具有更高的Fe2＋結(jié)合能力和抗氧化活性[33]。人們還研究了亞臨界水水解方法以從包括禽蛋蛋白質(zhì)在內(nèi)的食品蛋白質(zhì)中制備生物活性肽。亞臨界水提取法具有成本低、反應(yīng)時間短、無需使用溶劑和酶、對環(huán)境友好等優(yōu)點。以脫脂蛋黃顆粒蛋白質(zhì)為原料，采用胰蛋白質(zhì)酶和亞臨界水提取法對脫脂蛋黃顆粒蛋白質(zhì)進行水解。研究發(fā)現(xiàn)，用胰蛋白質(zhì)酶水解360 min，水解物中蛋白質(zhì)量分數(shù)可達50%，而采用亞臨界水提取，反應(yīng)時間明顯縮短，得率提高到95%。胰蛋白質(zhì)酶水解物和亞臨界水解物中的低分子質(zhì)量多肽（＜1 kDa）分別占14%和63%[34]。亞臨界水水解最大的問題是它在蛋白質(zhì)中裂解肽鍵的非特異性，這種方法也會導(dǎo)致非常有限的二硫鍵斷裂。因此，可能需要在亞臨界水處理之前或之后對蛋白質(zhì)進行還原和烷基化，以改善已報道的蛋白質(zhì)序列的覆蓋率[35-36]?？偟膩碚f，與酶水解相比，化學(xué)水解過程更難控制，而且可能從L-氨基酸中產(chǎn)生各種不需要的次級化合物[32]。此外，化學(xué)水解的最終產(chǎn)物含有更多的鹽，且一些功能特性（如水溶性、吸濕性）不盡如人意[37]。這些問題限制了化學(xué)水解在生物活性肽制備中的應(yīng)用。

1.3 微生物發(fā)酵法

除了水解之外，通過微生物酶系統(tǒng)發(fā)酵也是一種很有前景的制備生物活性肽的方法，特別是利用廢棄的蛋白質(zhì)源進行發(fā)酵[38]。在發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌、乳酸菌和真菌能夠釋放大量的二肽、三肽和其他生物活性肽[39-40]。一般來說，在乳酸菌發(fā)酵過程中，禽蛋的蛋白質(zhì)和游離氨基酸的組成和含量均會發(fā)生較大的變化[41]。Li Sen等[42]為了確定乳酸菌發(fā)酵是否會降低蛋清的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）E結(jié)合能力，選擇桑氏乳桿菌、清酒乳桿菌和德氏乳桿菌分別對蛋清進行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)只有德氏乳桿菌組的IgE結(jié)合能力降低了50%。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測到蛋清發(fā)酵液沒有明顯的蛋白質(zhì)降解。進一步研究發(fā)現(xiàn)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的卵類黏蛋白在蛋清發(fā)酵后強度降低。基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間-質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization-time of flightmass spectrometry, MALDI-TOF-MS）分析分子質(zhì)量變化，發(fā)現(xiàn)含乙酰己糖胺的糖肽的峰強度發(fā)生了變化。這說明蛋清IgE結(jié)合能力的降低主要是由于卵類黏蛋白降解為糖肽，減弱了其過敏原性。Jain等以植物乳桿菌為菌種發(fā)酵禽蛋殼膜以制備功能性和生物活性蛋白質(zhì)水解物；這些殼膜水解物具有明顯的生物活性，如還原力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、ACE抑制活性以及對多種食源性致病菌生長的抑制作用；通過發(fā)酵蛋殼膜獲得的蛋白質(zhì)水解物可以加入到功能性食品和營養(yǎng)食品中，從而促進殼膜副產(chǎn)物的利用[43]。

1.4 化學(xué)合成法

隨著對生物活性肽結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，許多研究表明，通過N-9-芴甲氧羰基（9-fluorenylmethyl，F(xiàn)moc）固相多肽合成法（solid phase peptide synthesis，SPPS）可以有目的地合成具有特定氨基酸序列的活性肽[44]。簡而言之，SPPS首先將C-末端氨基酸固定在支撐的保護基團上，然后通過保護氨基酸的順序偶聯(lián)和洗脫來延長C-末端氨基酸的肽鏈[45]。ZhaoWenzhu等通過計算機模擬酶解和分子對接選取了蛋清中5 條肽段（ADF、MIR、FGR、FK和CDR），在Apex 396肽合成儀（美國AAPPTEC公司）上使用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc固相合成法合成了這些肽段，并用反相高效液相色譜聯(lián)合電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（reverse phase-high performance liquid chromatographyelectrospray ionization-mass spectrometry，RP-HPLCESI-MS/MS）測定了合成肽的分子質(zhì)量和純度。通過體外實驗證實肽段具有ACE和二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase，DPP）-IV抑制活性[14]。Ding Long等也采用固相合成法獲得了一條卵轉(zhuǎn)鐵蛋白源五肽（AVPSL），并通過RP-HPLC-MS/MS對五肽的序列和純度進行了鑒定，后續(xù)細胞實驗證明此多肽具有抗血壓作用[46]。鑒于采用酶解法、化學(xué)水解法和微生物發(fā)酵法制備生物活性肽會伴隨著耗時和高成本等問題，多肽化學(xué)合成法的應(yīng)用將會越來越廣泛。

2 生物活性肽的鑒定與表征

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)水解物經(jīng)過分級純化后，需要采用多種表征手段來獲得多肽組分的分子質(zhì)量、氨基酸組成、結(jié)構(gòu)特征等信息。關(guān)于多肽的鑒定技術(shù)和方法主要有SDSPAGE法、RP-HPLC-MS/MS法[47]、四極桿飛行時間質(zhì)譜法（quadrupole-time of flight-mass spectrometry，Q-TOF/MS）[48]、MALDI-TOF-MS[49]、同位素標(biāo)記-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[50]、中紅外光譜法、毛細管電泳-質(zhì)譜法[51]等。Huang Xi等用串聯(lián)質(zhì)譜分析了高溫常壓（high temperature and moderate pressure，HTMP）預(yù)處理對卵黃高磷蛋白酶解的及產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征的影響。研究發(fā)現(xiàn)單獨使用HTMP預(yù)處理可產(chǎn)生154 個肽，而胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶與HTMP聯(lián)合使用則分別產(chǎn)生252、280 個和164 個肽。這表明HTMP預(yù)處理可以提高卵黃高磷蛋白的酶解效率，便于活性肽的制備[52]。Shen Shengwen等采用離子交換色譜和反相高效液相色譜對嗜熱菌蛋白酶處理的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解液進行分離純化，獲得了14 條肽段。隨后通過LC-MS/MS鑒定了這些肽段，并測定了它們的氧自由基清除能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）[47]。蛋黃磷脂提取的副產(chǎn)物可作為抗氧化和ACE抑制活性肽的良好來源，有研究者利用酵母絲氨酸蛋白酶對蛋黃磷脂提取的副產(chǎn)物進行酶解，隨后通過膜過濾、凝膠過濾層析、反相高效液相色譜、質(zhì)譜等純化和表征方法，得到了具有較強清除DPPH自由基和ACE抑制活性的十肽（QSLVSVPGMS）[53]。采用多種酶對卵白蛋白、卵類黏蛋白和卵黏蛋白進行水解，通過LC-Nano ESI-MS/MS對酶解液進行分析，表明每種水解物中含有數(shù)十至數(shù)百種多肽，且大多數(shù)多肽的分子質(zhì)量均小于2 kDa。一般而言，含有短肽的水解物比含有長鏈肽的水解物具有更強的功能活性，但從水解物中提純具有特定功能的單一肽似乎不太可行，甚至是沒有意義的[15-16,33]。

3 生物活性肽的計算機輔助篩選

傳統(tǒng)上，基于活性導(dǎo)向的分級是篩選和鑒定生物活性肽的主要方法，即通過前人的研究來選擇食品級蛋白質(zhì)酶對目標(biāo)蛋白質(zhì)進行水解，優(yōu)先釋放特定的生物活性肽。隨后根據(jù)感興趣的結(jié)構(gòu)特征，用適當(dāng)?shù)亩嚯募兓侄螌λ玫鞍踪|(zhì)水解物進行分級和純化，可以得到具有生物活性和預(yù)期健康益處的高純度多肽。這些活性肽的序列?？赏ㄟ^生物活性肽的網(wǎng)絡(luò)開放獲取數(shù)據(jù)庫中查詢到，例如BIOPEP和PepBank，以供研究員參考。簡而言之，它涉及了一系列的過程，包括水解組分篩選、分離和純化技術(shù)（如超濾和RP-HPLC）以及鑒定（如LC-MS/MS和核磁共振），這些都是低效和耗時的[54]。隨著人們對生物活性肽的研究逐漸深入，基于定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）輔助的計算機模擬酶解方式在生物活性肽的篩選上得到了探索。該方法首先從國家生物技術(shù)信息中心（the National Center for Biotechnology Information，NCBI）和UniProt知識庫（UniProtKB）等數(shù)據(jù)庫中獲取蛋白質(zhì)序列，然后利用生物信息學(xué)軟件BIOPEP和ExPASy PeptideCutter對蛋白質(zhì)水解過程進行了計算機模擬。隨后，收集計算機模擬的多肽片段，并基于QSAR模型預(yù)測它們的活性。雖然QSAR建模識別的多肽也需要驗證其活性，但生物信息學(xué)方法優(yōu)化了生物活性肽的蛋白質(zhì)源的篩選，并節(jié)省了尋找有效生物活性肽所需的大量時間和成本[55]。關(guān)于發(fā)掘生物活性肽的經(jīng)典方法和生物信息學(xué)方法如圖1所示。

圖1 用于發(fā)掘生物活性肽的經(jīng)典方法和生物信息學(xué)方法示意圖Fig. 1 Classical and bioinformatics approaches for discovering bioactive peptides

QSAR建模方法已經(jīng)成功地應(yīng)用于從禽蛋蛋白質(zhì)中篩選ACE抑制肽，并制備了3 種有效的ACE抑制肽，即IRW、IQW和LKP[55]。Wang Xiong等借助Peptide cutter軟件，以胃蛋白酶和胰蛋白酶模擬卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的酶切過程，獲得了多條二肽序列，并合成了18 條純度達98%的二肽，隨后通過抗炎實驗驗證了其中5 條肽段有較好的抗炎效果[56]。Salim等從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得卵白蛋白序列，然后在peptide cutter軟件的輔助下使用不同的單一酶或組合酶進行計算機模擬酶解，共產(chǎn)生71 條肽段。根據(jù)氨基酸組成序列以及多肽與ACE、DPP-4的相互作用來預(yù)測肽段的生物活性，共篩選出10 條有潛在活性的肽段。體外驗證實驗結(jié)果表明，篩選出的多肽均能抑制ACE和DPP-4的活性[57]。類似地，Zhao Wenzhu等選擇了禽蛋中8 種蛋白質(zhì)（卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、類卵黏蛋白、溶菌酶、卵巨球蛋白、抗生物素蛋白、卵黃高磷蛋白、卵白蛋白和肌球蛋白-10）進行計算機模擬酶解，并通過分子對接預(yù)測了肽段對ACE和DPP-IV的抑制活性。之后采用固相合成法合成了有潛在活性的5 條肽段，并進行體外實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5 條肽段均對ACE有抑制活性，而有4 條肽段可抑制DPPIV活性[14]。然而，考慮到蛋白酶與蛋白質(zhì)相互作用的復(fù)雜性，并不能保證采用計算機模擬手段所得多肽可以在實驗中得到活性驗證。

4 禽蛋源生物活性肽功能活性及相關(guān)作用機制

4.1 抗氧化活性

食品蛋白質(zhì)源生物活性肽是一類具有潛在抗氧化活性的天然化合物。雖然潛在的機制還不完全清楚，但螯合金屬離子和直接清除自由基作用是關(guān)鍵所在[58]。在禽蛋蛋白質(zhì)中，卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶、卵黃高磷蛋白、卵抑制劑等均被報道具有抗氧化特性，且它們經(jīng)酶水解后也會產(chǎn)生具有抗氧化活性的多肽[59-60]。酶的種類對抗氧化肽的釋放有著顯著影響，堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶是用于在細胞或動物實驗中產(chǎn)生抗氧化活性多肽的酶。雖然嗜熱菌蛋白酶和胃蛋白酶都能產(chǎn)生抗氧化肽，但嗜熱菌蛋白酶似乎是一種更能促進釋放蛋清抗氧化肽的酶。鑒于一些芳香族氨基酸（Tyr、Trp、Phe）和疏水性氨基酸（Ala、Val、Leu、Ile）等在體外都顯示出抗氧化活性，那么氨基酸組成、序列以及分子質(zhì)量對蛋白質(zhì)源多肽的抗氧化能力起著至關(guān)重要的作用[61]。此外，通過糜蛋白酶和胃蛋白酶組合水解蛋清，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化水解條件，所得水解物用氧化損傷模型和IgE結(jié)合能力實驗進行評價，發(fā)現(xiàn)所得多肽具有高抗氧化活性和較低的致敏性[62]。Lin Songyi等以蛋清蛋白粉為主要原料，分別用堿性蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶水解制備抗氧化肽。隨后采用高場強脈沖電場對抗氧化肽進行處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)高場強脈沖電場處理的抗氧化肽比未處理組有更強的抗氧化能力[63]。Zhang Biying等采用超濾和Sephadex G-15柱層析對蛋清水解物進行純化和表征，鑒定出了4 種抗氧化多肽（VYLPR、EVYLPR、VEVYLPR和VVEVYLPR），其中VYLPR抗氧化活性最高。他們進一步進行抗氧化機制探討，發(fā)現(xiàn)VYLPR能抑制脂質(zhì)過氧化過程，保持細胞膜完整性，抑制細胞內(nèi)乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性，降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，提高總超氧化物岐化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）和谷胱甘肽氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性[64]。Xue Hui等對孵化第6天的胚蛋進行水解和超濾分離，獲得了不同分子質(zhì)量范圍的多肽組分，并通過DPPH自由基清除活性、羥自由基清除活性、超氧陰離子自由基清除活性、總抗氧化能力和還原力實驗考察了它們的抗氧化活性[65]。開發(fā)新型蛋白酶也有利于獲取更多種類的抗氧化肽，Hamin等從爪哇正青霉和嗜熱菌中分離出兩種新的真菌蛋白酶，對雞蛋和牛奶蛋白質(zhì)進行水解，也獲得了具有DPPH自由基清除能力和金屬螯合能力的抗氧化肽[66]。Zhang Deju等研究了卵黏蛋白胃蛋白酶水解產(chǎn)物五肽及其片段對細胞抗氧化酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)不同多肽的組合具有協(xié)同抗氧化作用，且在一定程度上表現(xiàn)出劑量依賴性。在細胞水平上，與過氧化物暴露組相比，多肽處理組的SOD、GSH-Px、過氧化氫酶活性較高，而MDA、LDH釋放水平較低[67]。Wang Jiapei等將煮熟的雞蛋在胃腸消化的體外模擬模型中進行消化。所得的消化物用液相色譜進行分級，并以血管平滑肌細胞（A7r5）為模型，測定了各肽段組分的體內(nèi)抗氧化活性。隨后從具有最高抗氧化活性的肽組分中進一步鑒定出了3 條源于卵白蛋白的肽段（DSTRTQ、DVYSF和ESKPV），并通過合成肽段驗證了它們在A7r5細胞中可降低ROS水平[68]。Carrillo等從胃蛋白酶處理的溶菌酶水解物中鑒定到5 條帶正電荷的多肽，采用ORAC實驗證實它們均表現(xiàn)出抗氧化活性。在斑馬魚實驗?zāi)Ｐ椭校ㄟ^測定硫代巴比妥酸反應(yīng)物值，發(fā)現(xiàn)這5 種肽均能有效抑制脂質(zhì)過氧化，但當(dāng)多肽質(zhì)量濃度高于50 μg/mL時會對斑馬魚產(chǎn)生細胞毒性[69]。另外，當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白源抗氧化肽在內(nèi)皮細胞中具有ORAC活性，但這些肽都沒有降低細胞中超氧化物的基礎(chǔ)水平及細胞因子誘導(dǎo)的超氧化物水平[70]。這一發(fā)現(xiàn)進一步強調(diào)了在評價抗氧化肽的抗氧化能力時，有必要使用更多與生理相關(guān)的評價指標(biāo)。

4.2 降血壓和ACE抑制活性

食品蛋白質(zhì)源降血壓肽得到了研究者的極大關(guān)注，不同的食物蛋白質(zhì)中已經(jīng)鑒定了各種降血壓肽[71]。作為生物活性肽的一大類，降血壓肽的研究已從鑒定拓展到機制、臨床試驗和商業(yè)化。禽蛋作為一種豐富的蛋白質(zhì)來源，一直是鑒定降血壓肽的熱門研究對象。由于ACE抑制劑是治療高血壓的一線藥物，從禽蛋蛋白質(zhì)中鑒定降壓肽通常是從體外ACE抑制實驗開始的，這使得鑒定出的多肽被稱為ACE抑制肽。近些年來，許多ACE抑制肽被從禽蛋中鑒定出來，它們大多來自蛋清蛋白質(zhì)，如卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶。在制備ACE抑制肽時，盡管水解參數(shù)可能會不同，但酶種類在確定禽蛋蛋白質(zhì)水解物的ACE抑制潛力方面發(fā)揮著重要作用[72]。與禽蛋水解物類似，這些ACE抑制肽（如LW、IVF、YAEERYPIL和FRADHPFL）通常由胃腸道酶產(chǎn)生，有些ACE抑制肽（如IRW、IQW和LKP）需要胃腸道酶輔助制備[73-74]。IRW、IQW和LKP是已報道的具有多種生物活性的ACE抑制肽，它們是由卵轉(zhuǎn)鐵蛋白經(jīng)嗜熱菌蛋白酶和胃蛋白酶水解后產(chǎn)生的，這些三肽的產(chǎn)生高度依賴于嗜熱菌蛋白酶對卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的預(yù)處理[75-76]。Khueychai等將卵白蛋白在40 ℃下進行堿水解，在水解8 h時觀察到水解產(chǎn)物具有最佳ACE抑制活性，通過RP-HPLC純化水解產(chǎn)物獲得肽段YV。使用Lineweaver-Burk圖分析，YV被確定為競爭性抑制劑。分子對接分析表明，YV與ACE的S1和S2口袋位點之間的結(jié)合主要通過氫鍵穩(wěn)定。YV在胃腸道消化后仍保持ACE抑制活性，對紅細胞、角質(zhì)形成細胞（HaCaT）和肺成纖維細胞（MRC-5）沒有細胞毒性。腸道吸收的體外模型表明，YV具有很高的Caco-2細胞單層模型吸收潛力[77]。Fan Hongbin等從嗜熱菌蛋白酶處理的蛋清水解液中篩選出6 種能被胃腸道消化的ACE抑制肽，即LAPYK、LKISQ、LKYAT、INKVVR、LFLIKH和LGHWVY，這進一步證明了蛋清肽作為功能食品配料應(yīng)用的潛力[78]。源于卵白蛋白的活性肽QIGLF已被體外表征為有效的ACE抑制劑。通過尾袖法評估口服QIGLF對SHRs的體內(nèi)降壓作用，發(fā)現(xiàn)單次口服后，SHRs的收縮壓明顯降低，且QIGLF（50 mg/kgmb）與降血壓藥物卡托普利（10 mg/kgmb）的作用效果相似[79]。然而，卵白蛋白衍生肽ERKIKVYL和FFGRCVSP在體外有較強的ACE抑制活性，而在SHRs中沒有任何降血壓作用[80]。因此，基于體外ACE抑制實驗鑒定的ACE抑制肽也需要進一步證實其在體內(nèi)的有效性。

于是，人們逐漸發(fā)現(xiàn)這些降壓肽的機制實際上超出了ACE抑制的范疇。IRW是源于蛋清卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的ACE抑制肽，研究發(fā)現(xiàn)它可以通過多種途徑降低SHRs的血壓，包括減少血管緊張素II（angiotensin II，Ang II）的循環(huán)，增強NO介導(dǎo)的血管舒張，改善內(nèi)皮炎癥和氧化應(yīng)激以及上調(diào)ACE2活性[19,71,76]。此外，IRW可以減弱因Ang II作用所引起血管平滑肌細胞的增殖、氧化應(yīng)激和炎癥，這表明其通過減緩血管重構(gòu)來降低血壓[81]。由Ang II誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞遷移也是高血壓發(fā)病的機制之一。Liao Wang等評價了IRW在Ang II誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞系A(chǔ)7r5細胞中的抗遷移活性。研究發(fā)現(xiàn)，IRW可下調(diào)基質(zhì)金屬肽酶9的表達，抑制Ang II誘導(dǎo)的A7r5細胞遷移，這與p38/絲裂原活化蛋白激酶（p38/mitogenactivated protein kinase，p38/MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)失活有關(guān)。更重要的是，IRW的抗遷移活性依賴于血管緊張素I型受體（angiotensin I receptor，AT1R）[82]。RVPSL也來自于蛋清卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，已被證明可通過調(diào)節(jié)腎素、ACE、AT1R和AT2R等血管緊張素系統(tǒng)組成部分的mRNA水平來降低SHR的血壓[83]。有研究者探討了嗜熱菌蛋白酶和胃蛋白酶水解的蛋清多肽對SHRs降壓作用的分子機制。主動脈ACE和AT1R表達下調(diào)，AT2R表達上調(diào)，參與了降壓機制[23]。因此，雖然禽蛋中已鑒定出豐富的ACE抑制肽，但這些多肽的作用機制可能并不局限于對ACE活性的抑制，還可以調(diào)節(jié)參與高血壓發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)分子的表達，最終導(dǎo)致血壓下降。目前已報道的降血壓作用機制如圖2所示。

圖2 禽蛋源降血壓肽的作用機制Fig. 2 Antihypertensive mechanisms of egg-derived peptides

4.3 抗菌活性

禽蛋中有著豐富的抗菌蛋白質(zhì)，且這些蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的多肽也表現(xiàn)出較強的抗菌活性。早有研究者通過酸水解技術(shù)從卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中純化出抗菌肽OTAP-92，該肽由92 個殘基組成，具有與昆蟲防御素相似的獨特結(jié)構(gòu)基序。這種抗菌肽能夠通過自我促進吸收導(dǎo)致細菌外膜滲透性改變，并對其生物功能造成損害，從而殺死革蘭氏陰性菌[84]。卵黏蛋白是一種從蛋清中提取的糖蛋白，具有潛在的抗黏附性。用酸性蛋白酶制備的卵黏蛋白水解物對兩株豬K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌具有抗凝集活性。將水解物純化后，共鑒定出6 種具有抗黏附活性的糖肽。通過結(jié)構(gòu)表征，這些肽具有1 個由雙乙酰氨基葡萄糖、3 個甘露糖殘基和1 個N-乙酰氨基葡萄糖組成的戊多糖中心結(jié)構(gòu)[85]。溶菌酶可有效抑制革蘭氏陽性菌增殖，同時一些研究通過額外的化學(xué)修飾來擴大其對特定革蘭氏陰性菌的損傷作用[86]。酶水解過程也能夠使溶菌酶釋放有效的抗菌肽，經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的溶菌酶對革蘭氏陽性菌（如金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌K-12）均有抑菌活性。從水解液中分離純化出的兩種抑菌肽IVSAGAGMAAT和HGLAATA，它們可分別抑制大腸桿菌K-12和金黃色葡萄球菌增殖。這些抗菌肽將溶菌酶的抗菌活性擴大到了革蘭氏陰性菌上[87]。Carrillo等采用RP-HPLC-ESI-MS/MS從經(jīng)胃蛋白酶水解的天然和加熱處理蛋清溶菌酶水解物中鑒定到51 條肽段，它們對大腸桿菌和肉質(zhì)葡萄球菌均表現(xiàn)出較高的抑菌活性。經(jīng)鑒定這些肽段為陽離子抗菌肽，富含陽離子氨基酸Lys和Arg[88]。類似地，采用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解卵白蛋白可分別產(chǎn)生5 種和3 種抗菌肽。胰蛋白酶水解產(chǎn)生的肽僅表現(xiàn)出對枯草芽孢桿菌的強殺菌活性，而胰凝乳蛋白酶水解產(chǎn)生的肽對革蘭氏陽性菌（如枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（如博德特氏菌、大腸桿菌和肺炎克雷伯菌）以及真菌（如白色念珠菌）均顯示出抗菌活性。采用風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對卵白蛋白進行酶解可得到抗菌肽。與其他組分相比，胃蛋白酶水解物顯示出最高的抗菌活性[89]。Ma Bin等從純化的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中鑒定出一種新型抗菌肽OVTp12，該天然抗菌肽對革蘭氏陽性和陰性細菌均具有較強的抑制活性。借助激光共聚焦掃描顯微鏡和流式細胞儀分析OVTp12對細菌胞內(nèi)外膜的影響，結(jié)果表明，這種抗菌肽可通過破壞細菌細胞膜的完整性和增加膜通透性來發(fā)揮抗菌活性[90]。為了純化和鑒定抗菌肽，Tang Wenting等提出了一種將脂質(zhì)體作為模擬生物膜系統(tǒng)的固定化脂質(zhì)體結(jié)合提取方法。通過比較胃蛋白酶水解液與固定化脂質(zhì)體膜作用前后的HPLC圖譜，同時預(yù)測了4 個肽段。一種新陽離子抗菌肽OPep2被測序為RVASMASEKMKI。此外，抗菌實驗表明，OPep2與細菌細胞膜相互作用導(dǎo)致鉀離子外流和核苷酸泄漏，最終導(dǎo)致細胞死亡[91]。由于固定化脂質(zhì)體結(jié)合提取法效率高、操作簡單，能比常規(guī)方法更有效地篩選抗菌肽，為抗菌肽的生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。

4.4 抗炎活性

一般而言，炎癥是宿主抵抗病原體或有害內(nèi)源性物質(zhì)的傷害而產(chǎn)生的一種防御性反應(yīng)，最終會消除壞死細胞和病原體，通常以腫脹、發(fā)紅、發(fā)熱和疼痛為特征。炎癥可以為生物體提供保護作用以及附帶的不利損傷[92]。病原體相關(guān)分子（如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS））可以激活MAPK及其下游因子，包括核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor kappa-B, NF-κB）和環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)序列，從而導(dǎo)致免疫相關(guān)的促炎蛋白質(zhì)（包括誘導(dǎo)型NO合成酶和環(huán)氧合酶-2）表達上調(diào)[93]。NO可以隨著誘導(dǎo)型NO合成酶濃度的增加而緊密積聚，并促進炎癥因子如細胞因子、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α和白細胞介素（interleukin，IL）的產(chǎn)生[94]。Jiao Huanli等的研究表明卵轉(zhuǎn)鐵蛋白衍生肽IRW可通過減少大鼠血清中TNF-α、IL-6和髓過氧化物酶活性來減緩LPS誘導(dǎo)的腹膜炎[95]。也有研究者通過計算機模擬酶解卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，獲得了18 條二肽，研究發(fā)現(xiàn)有5 條肽段（CR、FL、HC、LL和MK）均能顯著抑制Caco-2細胞促炎細胞因子TNF-α、IL-8、IL-6、IL-1β和IL-12基因表達，促進抗炎細胞因子IL-10基因表達。其中，CR和HC抑制了TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細胞中NF-κB和MAPK信號通路，而LL、FL和MK則通過抑制MAPK信號通路來發(fā)揮抗炎作用[56]。Zhang Mengya等發(fā)現(xiàn)皮蛋的胃腸道消化產(chǎn)物對Caco-2細胞和葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型具有抗炎活性。隨后，他們從消化產(chǎn)物中分離純化得DEDTQAMPFR（DR-10）、DEDTQAMPF（DF-9）、MLGATSL（ML-7）和MSYSAGF（MF-7）4 條肽段，通過TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細胞探索了肽段的抗炎作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，這4 條肽段可顯著抑制相關(guān)促炎細胞因子的基因表達，促進IL-10基因表達以及抑制c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的磷酸化。同時，DR-10和DF-9降低了IκB和p38的磷酸化[96-97]。Sun Xiaohong等發(fā)現(xiàn)由堿性蛋白酶產(chǎn)生的卵黏蛋白衍生肽具有抗炎活性，其通過抑制TNF介導(dǎo)的NF-κB通路而發(fā)生作用[85]。Yoo等從蛋殼膜水解產(chǎn)物中獲得了3 個組分，即組分I（＞10 kDa）、組分II（3-10 kDa）和組分III（＜3 kDa）。研究表明，不同組分均能抑制由脂多糖和干擾素-γ引起的Raw 264.7細胞炎癥反應(yīng)，減緩皮膚炎癥以及抑制膠原酶和彈性蛋白酶活性，其中組分I的抑制活性最顯著[98]。

4.5 抗癌活性

禽蛋蛋白質(zhì)已被認為是治療或預(yù)防癌癥的候選蛋白質(zhì)，其中溶菌酶是研究最廣泛的一種。溶菌酶被報道具有治療肺癌的潛力，實驗結(jié)果表明口服溶菌酶可以減緩肺癌小鼠的癌細胞轉(zhuǎn)移，其作用機制可能是激活脾臟和巨噬細胞[99]。不同酶制備的禽蛋蛋白質(zhì)水解物也具有一定的抗癌活性。有許多研究實例證明禽蛋蛋白質(zhì)及其多肽的抗癌活性是通過多種機制發(fā)生的，包括誘導(dǎo)細胞凋亡、防止DNA損傷、降低癌細胞的侵襲能力以及加強正常細胞對抗癌細胞的能力和抗誘變活性[100]。Moon等用不同的酶制備了9 種蛋清卵轉(zhuǎn)鐵蛋白水解物，并評價了其對7 種不同癌細胞株增殖活性的影響。雖然卵轉(zhuǎn)鐵蛋白處理也會降低這些癌細胞的活力，但每種水解物的半抑制濃度遠低于卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，這表明卵轉(zhuǎn)鐵蛋白經(jīng)酶水解釋放出的多肽可能對這些癌細胞更敏感[101]。Lee等也發(fā)現(xiàn)，相比天然卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，經(jīng)兩步酶水解所得的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白水解產(chǎn)物對癌細胞具有更強的細胞毒性[102]。蛋清卵黏蛋白糖肽的抗癌潛力也被報道，它被證明在小鼠雙移植瘤系統(tǒng)中能抑制腫瘤的生長，但具體機制尚不清楚。作為一種高黏度糖蛋白，卵黏蛋白由α亞基和β亞基組成，其β亞基對黑色素瘤細胞、Lewis肺癌細胞和肉瘤細胞（SR-180）具有細胞毒性作用[103]。這些發(fā)現(xiàn)提示β亞基可能是蛋清卵黏蛋白抗癌活性的功能基團。此外，用灰色鏈霉菌的蛋白酶水解卵黏蛋白能釋放出α亞基的3 種糖基化寡肽，此類肽可有效抑制腫瘤生長。也有研究者發(fā)現(xiàn)從蛋黃中獲得的多肽對結(jié)腸癌細胞具有抗增殖活性[104]。目前，植物源多酚是研究最多的具有抗癌潛力的天然物質(zhì)，而對食品蛋白質(zhì)源抗癌肽的了解還很有限，這可能會促進這一領(lǐng)域的研究，為抗癌治療的替代方案探索新的機會。

4.6 抗糖尿病作用

血糖水平是通過大腦、胰腺、肝臟、腸道、脂肪和肌肉組織釋放的各種激素和神經(jīng)肽來調(diào)節(jié)的。事實上，來自腸道的葡萄糖吸收、肝臟產(chǎn)生的葡萄糖以及外周組織對葡萄糖的吸收和代謝決定了體內(nèi)的血糖濃度[105]。生物活性肽可以通過影響體內(nèi)不同的靶點，包括飽腹感反應(yīng)、胃腸激素釋放、腸道葡萄糖吸收、胰島素分泌和敏感性、葡萄糖吸收和脂肪組織修飾，來對葡萄糖穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生積極影響[106]。然而，在所有這些靶點中，禽蛋源多肽作為α-葡萄糖苷酶和DPP-IV活性的潛在抑制劑被研究得最多。食源性α-葡萄糖苷酶抑制劑已經(jīng)從包括禽蛋蛋白質(zhì)在內(nèi)的不同蛋白質(zhì)來源中鑒定出來。例如，蛋清蛋白質(zhì)的堿性酶酶解產(chǎn)物中含有具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的多肽。其中，RVPSLM和TPSPR是最有效的活性多肽。KLPGF是一種卵白蛋白衍生肽，對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶也具有一定的抑制活性[107]。雖然已有文獻報道了食源性多肽在體外對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，但似乎α-葡萄糖苷酶的抑制活性與α-葡萄糖苷酶的來源有關(guān)[108]。因此，這就需要進一步通過體內(nèi)研究來驗證這些肽在生理條件下的有效性。DPP-IV會降解胰高血糖素樣肽-1，而這種肽在機體內(nèi)能通過增加餐后胰島素分泌來調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)[109]。近年來，許多研究揭示了食物蛋白質(zhì)作為DPP-IV抑制肽前體的潛力。胃蛋白酶水解脫脂蛋黃蛋白質(zhì)后，會產(chǎn)生對α-葡萄糖苷酶和DPP-IV具有抑制活性的YIEAVNKVSPRAGQF、YINQMPQKSRE、YINQMPQKSREA和VTGRFAGHPAAQ 4 種多肽。這些多肽還在體外發(fā)揮了ACE抑制活性和抗氧化活性[110-111]。增強胰島素敏感性和脂肪細胞分化以及減輕脂肪組織炎癥是生物活性肽影響葡萄糖穩(wěn)態(tài)的另外機制。雖然從大豆和乳清蛋白中提取的幾種肽已被報道可以恢復(fù)胰島素信號，促進胰島素敏感性和前脂肪細胞分化，并減輕脂肪細胞炎癥，但在禽蛋蛋白中幾乎沒有鑒定出類似的多肽[112-113]。最近發(fā)現(xiàn)卵轉(zhuǎn)鐵蛋白源多肽IRW可通過刺激胰島素信號來改善L6成肌細胞的胰島素抵抗，它主要是減少Ang II刺激的AT1R表達和氧化應(yīng)激來改善胰島素抵抗[114]。他們后續(xù)也使用大鼠骨骼肌細胞研究蛋清酶解產(chǎn)物及其核心多肽IRW對TNF-α誘導(dǎo)的胰島素抵抗的影響以及潛在的分子機制。研究發(fā)現(xiàn)兩種產(chǎn)物均可改善TNF-α誘導(dǎo)的細胞對葡萄糖的攝取，增加胰島素受體底物（insulin receptor substrate-1，IRS-1）酪氨酸殘基和蛋白激酶B的活化，而降低IRS-1絲氨酸殘基的活化。它們還可降低TNF-α誘導(dǎo)的促p38和JNK 1/2的激活，從而改善胰島素敏感性受損[115]。此外，用嗜熱菌蛋白酶和胃蛋白酶處理的蛋清水解物在脂肪細胞中顯示出胰島素模擬和增敏作用[116]。

4.7 金屬離子結(jié)合與轉(zhuǎn)運活性

在腸腔內(nèi)，礦物質(zhì)的結(jié)合與釋放是一個動態(tài)過程。一些活性肽具有金屬離子螯合性質(zhì)，它們可以與礦物質(zhì)（如鈣、鐵、鋅離子）結(jié)合，促進礦物質(zhì)在體內(nèi)的吸收與轉(zhuǎn)運，以改善礦物質(zhì)的生物利用率[117-118]。Abeyrathne等采用加熱、堿和酶處理卵黏蛋白，以探討處理后水解產(chǎn)物抗氧化、ACE抑制活性和金屬離子螯合活性的差異。結(jié)果表明，在堿性條件下經(jīng)胰蛋白酶處理的卵黏蛋白水解物對Cu2＋有最高的螯合活性，而卵黏蛋白在堿性條件下加熱15 min所產(chǎn)生的水解物有最高的Fe2＋螯合活性[33]。Hou Tao等研究發(fā)現(xiàn)鴨蛋清肽在草酸、磷酸和鋅離子存在下可促進Caco-2細胞單層對鈣的攝取。動物實驗結(jié)果表明，蛋清肽能有效促進機體對礦物質(zhì)的吸收，并能拮抗植酸的毒害作用。這些結(jié)果表明，蛋清肽可能通過3 條途徑促進鈣攝取，包括蛋清肽與鈣結(jié)合形成可溶性螯合物，避免鈣沉淀；螯合物以小肽形式被腸細胞吸收；蛋清肽通過與瞬時受體電位辣椒素（transient receptor potential cation channel subfamily V member 6，TRPV6）鈣通道相互作用，調(diào)節(jié)腸細胞的增殖和分化[119]。通過同源建模和分子對接方法分析已鑒定出的促骨形成四肽（VSGG）和TRPV6鈣通道的相互作用，確定了兩個可能的活性位點[120]。Sun Na等采用傅里葉變換紅外光譜、核磁共振氫譜和等溫滴定量熱法分析蛋清水解液中五肽（DHTKE）的結(jié)構(gòu)和熱力學(xué)特征，闡明了DHTKE與鈣離子的結(jié)合方式。研究表明，DHTKE能以1∶1的化學(xué)計量比自發(fā)地結(jié)合鈣，鈣結(jié)合位點對應(yīng)于DHTKE的羧基氧、氨基氮和咪唑氮原子。此外，利用Caco-2細胞體外研究了DHTKE-鈣復(fù)合物對鈣吸收的影響。結(jié)果表明，與對照相比，DHTKE-鈣復(fù)合物能促進鈣離子進入胞漿，進一步提高鈣在Caco-2細胞單層的吸收率（提高7 倍以上）[121]。同時，他們團隊的后續(xù)研究也發(fā)現(xiàn)這個五肽可以與鋅離子形成復(fù)合物，促進鋅離子在胃腸道中吸收和轉(zhuǎn)運[122]。Li Bo等以缺鐵性貧血大鼠為實驗對象，F(xiàn)eSO4作陽性對照，研究鴨蛋清肽對鐵在體內(nèi)生物利用率的影響。在喂食不同劑量蛋清肽-鐵螯合物后，貧血大鼠的血常規(guī)相關(guān)指標(biāo)在3 周后恢復(fù)到正常水平。研究發(fā)現(xiàn)這種螯合物可以調(diào)節(jié)二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白1、鐵轉(zhuǎn)運蛋白1和鐵調(diào)素的基因表達。通過HPLC-ESI-MS/MS對螯合物進行結(jié)構(gòu)表征，分析鑒定了8 種關(guān)鍵鐵螯合肽，且表明Glu、Asp、Lys、His、Ser和Cys殘基可能在蛋清肽與鐵的螯合中起著關(guān)鍵作用[123]。這些研究有助于了解多肽與礦物質(zhì)的結(jié)合機制，并提示蛋清肽作為功能食品在促進礦物質(zhì)吸收方面有著潛在的應(yīng)用前景。

4.8 免疫調(diào)節(jié)作用

免疫系統(tǒng)的不健康與慢性病的發(fā)展有關(guān)。例如，由免疫系統(tǒng)反應(yīng)不當(dāng)引起的慢性炎癥與糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化和癌癥有關(guān)[124-125]。因此，保持健康的免疫系統(tǒng)對健康至關(guān)重要。除了各種類型的免疫療法外，食物中活性成分也與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)有關(guān)。食源性免疫調(diào)節(jié)肽從經(jīng)胰蛋白酶處理的酪蛋白水解物中鑒定出來后，激發(fā)了將牛奶蛋白水解產(chǎn)物開發(fā)為免疫調(diào)節(jié)肽商品的探究[126]。禽蛋蛋白質(zhì)是免疫調(diào)節(jié)肽的另一來源。目前，已有源于禽蛋蛋白質(zhì)的免疫刺激多肽和免疫抑制多肽的報道。用胃蛋白酶消化制備的蛋黃水解物已被證明能夠誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，從而增加免疫缺陷小鼠（BALB/c）小腸黏膜細胞中IgA水平，表明其具有增強黏膜免疫反應(yīng)的潛力[127]。關(guān)于免疫抑制肽，研究發(fā)現(xiàn)蛋清蛋白質(zhì)的水解物，包括由胃蛋白酶、中性酶和堿性蛋白酶制備的卵白蛋白、溶菌酶和全蛋清蛋白質(zhì)水解物，可以刺激淋巴細胞增殖和細胞因子的產(chǎn)生[128]。LPS可刺激巨噬細胞分泌促炎性細胞因子酶，而卵黃球蛋白及其胃蛋白酶和堿性蛋白酶水解物則能不同程度地降低巨噬細胞中這些標(biāo)志物的水平[129]。用消化酶處理溶菌酶，并在LPS刺激下用溶菌酶水解物在Caco-2細胞中測定IL-8的產(chǎn)生，結(jié)果表明，胃蛋白酶水解溶菌酶產(chǎn)生的肽降低了IL-8水平[130]。由卵白蛋白產(chǎn)生的多肽可提高巨噬細胞吞噬活性以及在癌癥免疫治療中增強免疫應(yīng)答[131]。Polanowski等在從蛋黃中提取卵黃免疫球蛋白時，也獲得一些具有免疫調(diào)節(jié)活性的多肽。他們采用分子排阻色譜、SDS-PAGE和HPLC對多肽混合物進行純化分級和鑒定，獲得了8 條肽段，隨后通過促細胞因子實驗證實這些多肽可作為細胞因子IL-1β和IL-6釋放的有效誘導(dǎo)劑[132]。Martinez等用小鼠的腸上皮細胞和樹突狀細胞進行蛋清過敏性實驗，發(fā)現(xiàn)蛋清能誘導(dǎo)腸上皮細胞和樹突狀細胞中促炎性細胞因子上調(diào)。而當(dāng)以胃蛋白酶處理的卵白蛋白水解物作為免疫治療劑加入到這兩種細胞中時，細胞對蛋清的致敏性產(chǎn)生了耐受。進一步研究表明，卵白蛋白水解物可誘導(dǎo)免疫細胞中乙醛脫氫酶的表達以及促進與調(diào)節(jié)性T細胞生長和分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的產(chǎn)生[133]。其他研究者也發(fā)現(xiàn)喂食蛋清致敏小鼠一定量蛋清產(chǎn)物后，由于促進了小鼠體內(nèi)Foxp3＋調(diào)節(jié)性T細胞的生長發(fā)育，過敏反應(yīng)明顯得到了改善[134-135]。

4.9 改善骨骼健康

蛋白質(zhì)對骨骼健康既有積極影響，也有不利影響，這取決于各種因素，如蛋白質(zhì)來源、蛋白質(zhì)攝入量、鈣攝入量和飲食中的酸平衡。一項由65 名絕經(jīng)期婦女組成的隨機雙盲臨床實驗表明口服蛋黃多肽制劑6 個月可顯著降低骨質(zhì)重吸收標(biāo)志物的水平。在攝入蛋黃多肽時骨質(zhì)密度維持在健康的數(shù)值，而不攝入時則會下降[136]。細胞和動物實驗研究進一步證實了蛋黃肽對骨骼健康的作用。研究發(fā)現(xiàn)，蛋黃水溶性蛋白組分能促進前成骨細胞MC3T3-E1增殖和青春期雄性大鼠骼生長[137]。據(jù)報道，蛋黃中另一種不同酶水解的多肽具有抗骨質(zhì)疏松的作用。蛋黃源多肽對前成骨細胞MC3T3-E1的增殖有激活作用，對破骨細胞生成有抑制作用。喂食去卵巢大鼠一定量蛋黃多肽，發(fā)現(xiàn)蛋黃多肽可通過增加骨密度和防止去卵巢引起的松質(zhì)骨丟失來起到骨質(zhì)保護作用。此外，蛋黃多肽可通過調(diào)節(jié)成骨基因表達來劑量依賴性地促進成骨細胞MG-63增殖、膠原合成和鈣沉積[138]。Kobayashi等研究了禽蛋蛋黃水解物對5～8 月齡去睪丸小狗的骨代謝影響。以骨形成標(biāo)志物骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BAP）和骨吸收標(biāo)志物尿脫氧吡啶酚（deoxypyridinoline，DPD）水平作為骨代謝指標(biāo)。在整個臨床研究過程中，相比對照組，喂食富含蛋黃水解物的小狗血清BAP水平較高，且DPD水平較低。特別地，在睪丸切除后2 個月，喂食富含蛋黃水解物的小狗血清BAP水平顯著高于非喂食組。這表明蛋黃水解物在小狗睪丸切除后會快速促進骨形成[139]。陳宏杰的研究也表明蛋黃經(jīng)胰蛋白酶水解后，水解產(chǎn)物可促進前成骨細胞MC3T3-E1細胞的增殖、分化和礦化[140]。同樣地，蛋清肽在促進骨骼形成方面也發(fā)揮著重要作用[141]。Hou Tao等采用維甲酸誘導(dǎo)的骨丟失模型評價蛋清肽對鈣吸收和骨形成的影響。骨丟失模型雌性大鼠在補充蛋清肽后，鈣吸收率增加，部分血清和骨指標(biāo)恢復(fù)正常。形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，大鼠在補充蛋清肽后骨組織形態(tài)得到改善，破骨細胞數(shù)量減少。體外研究表明，TRPV6鈣通道是蛋清肽和已鑒定的四肽（VSGG）的主要轉(zhuǎn)運途徑[142]。后續(xù)研究也證實此四肽可通過介導(dǎo)細胞外因子β-連環(huán)蛋白信號通路和腸道微生物區(qū)系來促進骨骼生長和抑制脂質(zhì)異常代謝[143]。由于能促進鈣的攝取和骨形成的調(diào)節(jié)，蛋清肽有望成為一種很有前景的骨丟失治療藥物的替代品。

4.10 其他功能活性

隨著對生物活性肽研究的逐漸深入，生物活性肽的一些其他功能活性也被發(fā)掘出來。例如，蛋清肽可以減少肝臟和肌肉中異位脂肪堆積，促進脂肪排泄，從而起到抵抗肥胖的作用[106]。Hou Tao等報道鴨蛋清肽還能促進鈣代謝以及通過對腸道微生物區(qū)系和十二指腸絨毛表面積產(chǎn)生有益影響來改善腸道健康[144]。也有研究者從卵白蛋白中獲得了具有治療阿爾茨海默病潛力的三肽。他們鑒定出了3 條三肽（IEK、LYR和CIK），通過分子對接確定了這3 條多肽分別與乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）、丁酰膽堿酯酶（benactyzine hydrochloride，BChE）和β位點淀粉樣前體蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1，BACE1）相互作用的最佳位置。體外實驗結(jié)果表明，這3 種多肽均對AChE 、BChE和BACE1有較好的抑制活性[145]。另外，蛋清源多肽還具有抗病毒[146]、抗焦慮[147]、改善生殖功能失調(diào)[148]等功能。而蛋黃中水溶性多肽還可以通過刺激血管內(nèi)皮生長因子來促進毛發(fā)的生長[149]。蛋殼膜中含有膠原蛋白、角蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶等，對其進行酸、堿和酶水解也可以產(chǎn)生具有生物活性的產(chǎn)物[6]。Park等探討了蛋殼膜水解產(chǎn)物對皮膚美白、創(chuàng)面愈合和紫外線防護的影響。按分子質(zhì)量將水解產(chǎn)物分為組分I（大于10 kDa）、組分II（3～10 kDa）、組分III（小于3 kDa），所有組分的蛋白質(zhì)量分數(shù)都在90%以上。用永生化表皮細胞（HaCaT）進行的傷口愈合實驗表明，在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，組分I對傷口愈合的促進作用效果略好于其他組分，但隨著濃度的增加，效果差異不顯著。在抑制酪氨酸酶和L-3,4-二羥基苯丙氨酸氧化的美白效果實驗中，完整的蛋殼膜水解產(chǎn)物表現(xiàn)出與熊果苷（陽性對照組）相近的抑制效果。在抑制B16-F1黑色素瘤細胞黑色素形成的實驗中，組分I表現(xiàn)出較強的抑制作用。皮膚紫外線防護實驗中，各組分的HaCaT細胞存活率均高于空白對照組[150]。這一研究表明蛋殼膜水解產(chǎn)物有作為功能性化妝品配料的潛力。禽蛋中主要蛋白質(zhì)源多肽的功能活性總結(jié)見表1。

表1 禽蛋中主要蛋白質(zhì)源多肽的功能活性Table1 Functional activities of peptides derived from egg proteins

5 生物活性肽的胃腸道消化吸收與轉(zhuǎn)運

生物活性肽需以完整形式或其他活性片段在小腸中被吸收，以發(fā)揮生理健康益處。在到達血液循環(huán)之前，生物活性肽必須經(jīng)歷一系列復(fù)雜的反應(yīng)，如經(jīng)消化酶、腸上皮和腸細胞肽酶水解[54,178]。與非胃腸道蛋白酶相比，體外模擬胃腸道消化產(chǎn)肽的研究特別有意義，因為體外測定的多肽效價和生物利用率可能反映口服和體內(nèi)胃腸道消化后蛋白質(zhì)的生理益處。體外模擬胃腸道消化通常用于簡單模擬體內(nèi)消化過程，模擬體系主要包括胃蛋白酶和胰液（包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、羧肽酶等）。有研究認為短肽（少于6 個氨基酸）可抵抗胃腸道消化，并能完好無損地穿過腸上皮[179]。蛋清源降血壓肽TNGIIR、RVPSL和QIGLF很難被胃腸道酶水解，其他肽如RADHP、YAEER、YPI、IQW和LKP可以抵抗胃腸道消化[43,73,164,180]。然而，較長的肽段，如FRADHPFL和YAEERYPIL，可被完全地消化成FRADHPF、RADHPF、ADHPF、RADHP、YAEER和YPI。這些較長的肽可能通過RADHPF、YAEER和YPI等片段發(fā)揮生理降血壓作用，但這些肽片段在體外并沒有顯示出更好的ACE抑制活性[74,152-153,164]。此外，胃腸道消化還可能產(chǎn)生有效的生物活性肽。例如，IRW、IQW和LKP都是由胃蛋白酶和嗜熱菌蛋白酶水解的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白所產(chǎn)生的，并且IQW和LKP可以有效地抵抗胰腺的消化[73]。胃腸消化可以使肽變得更小，這有利于它們稍后在小腸的管腔中吸收。在胃腸道酶消化過程之后，多肽需抵抗腸細胞肽酶消化以通過腸上皮，這樣才能最終被吸收。

結(jié)腸癌細胞系（Caco-2）是一種被廣泛接受的模擬小腸吸收食物成分的模型。這是一種比體外和體內(nèi)模型更容易和更低成本的方法，常用來研究肽的吸收情況。成熟的Caco-2功能類似成熟的腸細胞，可穩(wěn)定表達刷狀緣肽酶和轉(zhuǎn)運蛋白，這是小腸轉(zhuǎn)運和吸收的前提[181]。目前，生物活性肽有多種轉(zhuǎn)運途徑，包括肽轉(zhuǎn)運蛋白1（peptide-transporters 1，PepT1）介導(dǎo)的主動轉(zhuǎn)運、緊密連接的細胞旁路轉(zhuǎn)運、細胞胞吞轉(zhuǎn)運和被動跨細胞轉(zhuǎn)運途徑。腸細胞轉(zhuǎn)運系統(tǒng)中存在一個pH依賴性的H＋/Na＋交換通道，轉(zhuǎn)運多肽過程中會依靠H＋電化學(xué)質(zhì)子梯度供能。腸上皮細胞單層轉(zhuǎn)運多肽的途徑如圖3所示。簡而言之，在H＋電化學(xué)梯度的協(xié)助下，PepT1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運主要參與二肽和三肽的轉(zhuǎn)運，且這些肽一般為中性電荷的非極性疏水肽。細胞旁路轉(zhuǎn)運首選中性或帶負電荷、小分子和親水性多肽。長鏈和高疏水性的多肽容易通過胞吞作用轉(zhuǎn)運。而帶正電荷且疏水的大分子肽傾向于被動跨細胞轉(zhuǎn)運[179,182]。在蛋源生物活性肽中，較小的肽更能抵抗腸細胞肽酶的降解。較大的肽如FRADHPFL和YAEERYPIL會被水解，其中水解程度最高的是YAEERYPIL，它被完全降解為YAE和YPI[183]。雖然IQW、IRW和RVPSL等較小的肽在運輸過程中也被降解，但其他如LKP、YAEER和YPI被發(fā)現(xiàn)運輸時完好無損，沒有任何降解。五肽和六肽（RVPSL、QIGLF和TNGIIR）通過細胞旁路途徑轉(zhuǎn)運，三肽（YPI、IRW、IQW和LKP）通過PepT1轉(zhuǎn)運。事實上，IRW、IQW和LKP還參與了細胞旁路轉(zhuǎn)運，這可能是歸因于中間位置的R、Q和K殘基所體現(xiàn)的親水性[46,180,184-185]。FRADHPFL和YAEERYPIL的胃腸消化吸收結(jié)果進一步表明，較長肽段的生物活性可能是由小的活性片段（如RADHP、YAEER和YPI）介導(dǎo)的。有趣的是，在細胞單層膜的基底外側(cè)表面沒有檢測到RADHP，這表明RADHP似乎不需要被吸收就能發(fā)揮降血壓作用，這可能是多肽通過與胃腸道中的受體相互作用來調(diào)節(jié)血壓[186]。Wang Liying等研究了蛋清肽在Caco-2細胞單層和外翻大鼠腸囊中跨膜轉(zhuǎn)運情況。結(jié)果表明，與外翻大鼠腸囊相比，蛋清肽在Caco-2細胞單層中具有更高的通透性，但降解程度更低。從Caco-2細胞單層的基底外側(cè)和外翻大鼠腸囊的漿液側(cè)均鑒定了4 種肽（LGAKDSTRT、DGSRQPVDN、VNDLQGKTS和GKKDPVLKD），這表明這4 種肽可以在兩個模型系統(tǒng)中以完整序列運輸。同時，從Caco-2細胞單層的頂端側(cè)和外翻大鼠腸囊的黏膜側(cè)鑒定出了24 種肽，表明這些肽對刷狀緣膜肽酶有著潛在抗水解性。其中，IRDLLER、YAEERYP和IRNVLQPS被證明具有DPP-IV抑制活性。此外，分子對接揭示了DPP-IV抑制肽可能與活性位點之間形成了氫鍵、π-π鍵以及電荷相互作用[187]。禽蛋中的許多生物活性肽已被證實在體內(nèi)的作用，但這些肽是如何到達循環(huán)系統(tǒng)并參與生理代謝的還需要更多的確鑿證據(jù)來進一步揭示。

圖3 腸上皮細胞單層轉(zhuǎn)運生物活性肽的途徑[182]Fig. 3 Pathways for transporting bioactive peptides across intestinal epithelial cell monolayers[182]

6 結(jié) 語

禽蛋源生物活性肽具有巨大的研究潛力，可以開發(fā)成改善類健康的功能性食品，但仍需要深入且精準(zhǔn)的研究以闡明生物活性肽的相關(guān)作用機制以及解決應(yīng)用開發(fā)過程中所面臨的問題。首先，傳統(tǒng)的活性導(dǎo)向純化和分級鑒定生物活性肽的方法非常耗時，因此有必要將經(jīng)典方法與生物信息學(xué)方法相結(jié)合，以高效且全面地篩選隱蔽的生物活性肽序列或其蛋白質(zhì)前體，這樣就可發(fā)掘禽蛋蛋白質(zhì)作為新型生物活性肽來源的潛力。同時，為了開發(fā)經(jīng)濟且規(guī)?；纳锘钚噪纳a(chǎn)技術(shù)，還需進一步結(jié)合多種預(yù)處理手段和新技術(shù)（如亞臨界水提取法、固定化酶、酶膜反應(yīng)器）來高效制備禽蛋蛋白質(zhì)水解物及高純度的肽組分。其次，雖然從禽蛋蛋白質(zhì)中已鑒定出大量生物活性肽，但它們針對某一特定生物活性可能存在著多重作用機制，那就還需要在細胞和分子水平上詳盡地闡明生物活性肽的作用機制。盡管生物活性肽的體外實驗可以提供用于體內(nèi)功能活性評估所需的初步證據(jù)，但它在很大程度上忽略了一個事實，即多肽可能存在較差的生理吸收和轉(zhuǎn)運特性以及可能會在體內(nèi)代謝為非活性序列。因此，考慮到這些多肽可能存在胃腸道代謝不穩(wěn)定性或低生物利用率問題，可對活性肽進行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾或構(gòu)建包埋遞送體系（如微膠囊、納米脂質(zhì)載體、乳液體系、液晶相體系等）以提高生物利用率。而當(dāng)前的新趨勢是設(shè)計和研究對肽酶具有高抵抗力和對PepT1具有高親和力的食源性活性肽。但這些方法可能會增加活性肽的生產(chǎn)成本以及造成安全問題。另外，目前多肽研究主要集中在體外或動物模型上的生物活性，這就缺乏強有力的臨床證據(jù)來證實其有效性和支撐未來產(chǎn)品的健康益處聲明。因此，在后續(xù)的臨床實驗中需要更多地關(guān)注生物活性肽的安全性、有效性、作用機制和劑量效應(yīng)的關(guān)系、肽與其他藥物的相互作用、吸收、分布、代謝和排泄等方面。此外，如果多肽在復(fù)雜的混合物中能保持其生物活性，那么使用含有生物活性多肽的粗水解物似乎更適用于功能性食品配方。但在生物活性肽轉(zhuǎn)化為商業(yè)化產(chǎn)品時，還可能存在多肽產(chǎn)品溶解性差、有苦味（苦味肽）等問題，那么就需要開發(fā)有效的工藝技術(shù)來獲得具有生物活性且消費者可接受的多肽產(chǎn)品。