海洋源生物活性肽的構(gòu)效關(guān)系與作用機理研究進(jìn)展

黃沐晨，楊傅佳,2，陳 旭,2，蔡茜茜,2，陳 選,2，吳金鴻，張 恒，張 軍，汪少蕓,

（1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；2.福州大學(xué)石油化工學(xué)院，福建 福州 350108；3.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；4.安徽國肽生物科技有限公司，安徽 宣城 242199；5.中食都慶（山東）生物技術(shù)有限公司，山東 菏澤 274108）

海洋是地球上最大的生物資源庫。海洋生物鏈完整且再生能力強，其獨特而復(fù)雜的孕育環(huán)境和悠久的演化發(fā)展歷程，使海洋生物體內(nèi)的防御體系和代謝機制具有特殊的性質(zhì)[1]，來自海洋生物的活性肽可分為內(nèi)源性肽和外源性肽。內(nèi)源性海洋生物活性肽是存在于海洋生物中的特異性功能肽，可積極發(fā)揮各種功能和生物學(xué)活性，主要包括海洋生命體中內(nèi)分泌腺產(chǎn)生的肽類抗生素、激素等生物體代謝產(chǎn)物，血液或組織中存在的組織激肽以及神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)活動調(diào)節(jié)肽等[2]?？梢赃\用分離純化技術(shù)將內(nèi)源性海洋生物活性肽直接從生命體中提取出來。外源性海洋生物活性肽是海洋源蛋白質(zhì)通過水解產(chǎn)生的具有特定功效的肽，最主要的制備方法是酶解法[2]。根據(jù)不同酶的酶切位點可以產(chǎn)生多種不同功能活性的肽片段。通過微生物強大的酶系統(tǒng)發(fā)酵也是制備生物活性肽的有效手段，在發(fā)酵過程中，常選用枯草芽孢桿菌和真菌等從廢棄的海洋源蛋白質(zhì)中制備生物活性肽釋放大量不同的二肽、三肽和其他生物活性肽[3]?；瘜W(xué)合成法常用于已知氨基酸序列的海洋源生物活性肽，并可依據(jù)不同活性肽的構(gòu)效機制對海洋源生物活性肽的氨基酸序列進(jìn)行定向設(shè)計改造，從而快速獲得理想有效的肽類藥物[4]。根據(jù)生物活性肽的來源和種類，選擇相應(yīng)合適的制備方法以合理有效的獲取目標(biāo)活性肽尤為重要。

海洋生物是開發(fā)新型生物活性肽的良好資源，有著巨大的開發(fā)利用潛力[1]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和化學(xué)技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用，科技工作者們已利用豐富的海洋原料及其加工副產(chǎn)物，挖掘出眾多結(jié)構(gòu)新穎、功能特殊的生物活性肽，如抗氧化肽[5-8]、抗菌肽[9]、抗凍肽[10]、金屬離子螯合肽[11-12]、免疫肽[13]等。近年來，有關(guān)海洋源生物活性肽的研究屢見報道。因此，有必要對海洋源生物活性肽的構(gòu)效關(guān)系及作用機制進(jìn)行綜述，以期為海洋源生物活性肽的進(jìn)一步挖掘及開發(fā)應(yīng)用提供啟發(fā)。

1 抗氧化肽

1.1 氨基酸序列與抗氧化的構(gòu)效關(guān)系

自由基是機體代謝的中間產(chǎn)物，自由基的產(chǎn)生和積累會導(dǎo)致DNA的氧化損傷、蛋白質(zhì)交聯(lián)或降解、酶失活、發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)以及破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，造成機體免疫系統(tǒng)出現(xiàn)多種損傷和惡性病變，加速機體衰老，引發(fā)癌癥、心血管疾病、阿爾茨海默癥等慢性疾病的發(fā)展[5,8]。常見化學(xué)合成的抗氧化劑，如丁基化的羥基甲苯、叔丁基對苯二酚和丁基化的羥基茴香醚等存在毒性，危及人體健康。已有諸多研究表明，海洋加工副產(chǎn)物水解制備的抗氧化肽能夠有效防止氧化造成的機體損傷，已成為最重要的人工抗氧化劑取代來源。

大多數(shù)抗氧化肽是由2～20 個氨基酸組成，低分子質(zhì)量的肽相比于其親本蛋白質(zhì)更容易接近自由基從而抑制自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化。Kim等[14]發(fā)現(xiàn)抗氧化能力與肽的分子質(zhì)量緊密相關(guān)，低分子質(zhì)量組分（1～3 kDa）的鱈魚蛋白水解產(chǎn)物組分相比于其他高分子質(zhì)量組分具有更高的抗氧化活性。同樣的，林琳等[15]發(fā)現(xiàn)以魷魚皮膠原蛋白為原料制備的小于2 kDa的多肽組分相比于其他分子質(zhì)量更大的組分對羥自由基和超氧陰離子自由基的清除效果更好。Ranathunga等[16]發(fā)現(xiàn)，來源于康吉鰻的分子質(zhì)量低于1 kDa的肽組分對體外脂質(zhì)過氧化的防御效果優(yōu)于天然抗氧化劑生育酚。

氨基酸組成及其位于肽序列中的位置對多肽抗氧化活性起著至關(guān)重要的作用。含苯環(huán)的氨基酸、酸性氨基酸和堿性氨基酸是抗氧化肽的活性位點，肽鏈的氨基酸位置決定了抗氧化肽到達(dá)細(xì)胞中自由基生成位點（如線粒體）的能力[17]。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)抗氧化肽通常在N端含有疏水性氨基酸，增強了它們在脂質(zhì)中的溶解度，使其易于進(jìn)入靶器官發(fā)揮作用。顏阿娜等[18]從黑鯊魚皮中酶解制備和分離純化得到新型抗氧化肽Pro-Gly-Gly-Thr-Met（PGGTM），從圖1中其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基機理圖可以看出，N端的脯氨酸和C端的蛋氨酸可能是清除自由基的關(guān)鍵性位點。在抗氧化肽清除自由基的過程中，脯氨酸能夠向DPPH自由基提供質(zhì)子，并且兩個帶自由基的脯氨酸能夠結(jié)合，從而阻止自由基鏈?zhǔn)絺鬟f[19-21]。疏水性氨基酸如蛋氨酸能增強多肽的抗氧化活性，蛋氨酸通過消耗周圍環(huán)境的氧，被快速氧化生成甲硫氨酸亞砜，起到抗氧化作用[22]。Qian Zhongji等[23]采用體外胃腸消化法水解牡蠣得到抗氧化肽，確定了肽的氨基酸序列為LKQELEDLLEKQE（1.60 kDa），得到比生育酚活性更高的抗氧化肽。Yang Qian等[7]以黑鯊魚皮為原料獲得的新型抗氧化肽在500 μg/mL的質(zhì)量濃度下對2,2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基具有81.5%的清除活性，序列為ATVY，其作用于ABTS的抗氧化作用位點為N末端的酪氨酸。Sinthusamran等[24]采用多種水解工藝酶解太平洋白對蝦頭胸部，不同的水解過程直接影響水解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)回收率、化學(xué)組成和抗氧化活性，得到的所有水解產(chǎn)物均以谷氨酸/谷氨酰胺、天冬氨酸/天冬酰胺、精氨酸和亮氨酸為主。另外，Zhao Kesheng等[25]發(fā)現(xiàn)Szeto Schiller（SS）肽可滲透細(xì)胞、靶向保護(hù)線粒體免受細(xì)胞氧化。SS肽的這種功能歸因于它們有獨特的結(jié)構(gòu)基序，并含有芳香族和堿性氨基酸。

圖1 Pro-Gly-Gly-Thr-Met清除DPPH自由基機理圖[18]Fig. 1 Schematic illustration of the reaction mechanism between Pro-Gly-Gly-Thr-Met and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radicals[18]

1.2 抗氧化機制

抗氧化肽在作用機理方面，主要從以下3 個方面抑制氧化反應(yīng)[26]：1）通過抗氧化肽的肽鍵和羥基提供氫原子或電子清除自由基，以消除自由基對生物分子的破壞作用；2）通過鈍化氧化酶的活性，螯合在氧化反應(yīng)中起催化作用的金屬離子，在脂質(zhì)顆粒外形成保護(hù)膜等方式，封閉引起氧化的物質(zhì)，阻截氧化反應(yīng)的進(jìn)行；3）上調(diào)內(nèi)源性抗氧化劑如谷胱甘肽、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶[27]，調(diào)節(jié)細(xì)胞生理生化反應(yīng)的抗氧化酶聯(lián)防御功能[28]，能夠?qū)?xì)胞器破壞誘導(dǎo)慢性疾病發(fā)展起到抑制作用[29]。

抗氧化肽分子質(zhì)量較小，容易穿過細(xì)胞膜被人體吸收利用，且安全性高，在吸收速率和生物學(xué)功能上具有顯著優(yōu)勢?？寡趸目梢杂米魇称放浞街械某煞?，預(yù)防、控制和管理氧化應(yīng)激相關(guān)疾病，還可以作為食品中的添加劑抑制食品的氧化。彭新顏等[30]發(fā)現(xiàn)藍(lán)點馬鮫魚皮抗氧化肽可有效抑制4 ℃冷藏過程中熟肉糜蛋白降解和脂質(zhì)氧化，保持熟豬肉糜品質(zhì)。在保健應(yīng)用及美白醫(yī)藥方面，王奕等[31]研究證實了日本刺參膠原肽對羥自由基等有顯著的清除能力，并提高B16黑素瘤細(xì)胞的增殖水平，抑制酪氨酸酶活性進(jìn)而抑制B16細(xì)胞黑素的合成。隨著生命科學(xué)的發(fā)展和生物學(xué)作用機制研究的不斷深入，抗氧化肽的構(gòu)效關(guān)系將更加明確，海洋源抗氧化肽用于開發(fā)藥物或作為保健品的功能因子將成為食品和高科技產(chǎn)業(yè)的前沿和熱點，在醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⒕哂懈玫陌l(fā)展前景和優(yōu)勢。

2 抗菌肽

2.1 二級結(jié)構(gòu)與抗菌的構(gòu)效關(guān)系

抗菌肽又稱為肽類抗生素或抗微生物肽，是生物體內(nèi)免疫防御機制經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的抵御外界微生物侵害的特殊小分子多肽。海洋源抗菌肽富含賴氨酸或精氨酸，使抗菌肽帶正電荷，含較多的疏水性氨基酸形成疏水或兩親性結(jié)構(gòu)[32]，其分子質(zhì)量小，容易到達(dá)被感染的位置，與傳統(tǒng)抗生素不同，抗菌肽有廣譜抗菌效果，且不會產(chǎn)生耐藥性[33-34]。根據(jù)二級結(jié)構(gòu)的差異可將抗菌肽分為4 類：α螺旋型、β折疊型、環(huán)形結(jié)構(gòu)類以及伸展性螺旋結(jié)構(gòu)類。

α螺旋型抗菌肽是水脂兩親性結(jié)構(gòu)，疏水性氨基酸和帶正電荷的親水性氨基酸分布在螺旋軸的兩側(cè)，螺旋度的變化會影響其抗菌效果和穿透細(xì)菌細(xì)胞膜的能力[35]。β折疊型抗菌肽在氨基酸組成上富含半胱氨酸，可以形成分子內(nèi)二硫鍵以穩(wěn)定β折疊結(jié)構(gòu)[35]。Qin Chuanli等[36]利用反相高效液相色譜從紫貽貝中分離出含55 個氨基酸殘基的新型抗菌肽，這種新型抗菌肽對真菌和革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出卓越的抗菌活性，其分子質(zhì)量為6 621.55 Da，具有一個幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)域，分子中6 個半胱氨酸殘基形成3 個分子內(nèi)二硫鍵。環(huán)形結(jié)構(gòu)類型在抗菌肽家族中較為少見，其環(huán)狀結(jié)構(gòu)由序列中的一個單鍵維持，這類抗菌肽可能同時具有α螺旋結(jié)構(gòu)、β折疊結(jié)構(gòu)。環(huán)形結(jié)構(gòu)類型抗菌肽能對抗細(xì)菌和真菌，通過核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術(shù)測定發(fā)現(xiàn)具有反平行β片層的結(jié)構(gòu)，序列11位和18位間形成二硫鍵，通過二硫鍵穩(wěn)定整個結(jié)構(gòu)[35]。第4種抗菌肽為伸展性螺旋結(jié)構(gòu)，其缺少典型的二級結(jié)構(gòu)，一般呈線型，且氨基酸序列中不含半胱氨酸。富含脯氨酸的伸展性螺旋結(jié)構(gòu)類抗菌肽，其結(jié)構(gòu)含有多個Pro-Arg-Pro特征序列，部分抗菌肽在特定位置的氨基酸殘基上還存在與生物功能密切相關(guān)的O-糖基化位點。

海洋源與陸生及兩棲動物來源的抗菌肽在整體結(jié)構(gòu)方面不具有顯著的差別，但是，海洋源抗菌肽也存在一些如富含組氨酸的Piscidins這類特有的家族結(jié)構(gòu)[37]，為海洋源抗菌肽的開發(fā)應(yīng)用提供了新思路。

2.2 膜損傷和非膜損傷機制

抗菌肽作為多細(xì)胞生物體內(nèi)的防御物質(zhì)，由于其不同于傳統(tǒng)抗生素的作用機制而備受關(guān)注。對現(xiàn)有研究進(jìn)行總結(jié)，抗菌肽的廣譜抗菌作用主要分為膜損傷機制和非膜損傷機制。

膜損傷機制認(rèn)為抗菌肽首先導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變形，再通過靜電相互作用導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜穿孔，破壞細(xì)胞膜產(chǎn)生孔隙，細(xì)胞內(nèi)的水溶性物質(zhì)外溢而死亡。破膜型抗菌肽的作用機制假說主要有圖2所示的4 種[38]：桶板模型、環(huán)孔模型、毯式模型、聚集模型。在抗菌肽破膜模型中，當(dāng)膜上抗菌肽的濃度超過閾值時便會插入細(xì)胞膜內(nèi)，形成孔隙，即桶板模型?？咕母采w在膜周圍，裂解膜形成地毯模型或插入到膜內(nèi)形成環(huán)孔模型。聚集模型與去污劑作用模式相似，即結(jié)合于脂質(zhì)膜表面的抗菌肽通過改變其自身結(jié)構(gòu)與磷脂分子形成凝聚物，破壞膜結(jié)構(gòu)，形成穿孔跨越細(xì)胞膜。Zhu Xin等[39]通過在α螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵連接處放置不同類型的氨基酸殘基來表征其抗微生物特性和作用機理，設(shè)計了一系列的兩親性肽，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化的序列通過誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)膜電位損失和改變膜通透性而表現(xiàn)出優(yōu)異的抗微生物能力。海洋魚類獨有的抗菌肽Piscidins家族的作用機理屬于典型的環(huán)孔模型機制。有研究者發(fā)現(xiàn)Piscidins-1相比于同源的Piscidins-3具有更強的殺菌能力，可能是由于N端2位的苯丙氨酸增強了螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而非極性部分17位的組氨酸則提高了破膜能力，改變了細(xì)胞膜的電導(dǎo)率和黏彈性，進(jìn)而起到抗菌效果[40-41]。這一研究清楚地解釋了Piscidins的結(jié)構(gòu)與其抗菌作用機制間的關(guān)系。

圖2 文獻(xiàn)中常被引用的抗菌肽作用模式圖[38]Fig. 2 Modes of action of antimicrobial peptides against microbial membrane commonly reported in the literature[38]

非膜損傷機制通常作為一種輔助性作用方式，與細(xì)胞膜損傷機制聯(lián)合作用于菌體細(xì)胞。部分抗菌肽可以穿過細(xì)胞壁膜進(jìn)入細(xì)胞，作用于菌體胞內(nèi)的靶點。如圖3所示，抗菌肽的非膜損傷機制主要包括：抑制細(xì)胞壁合成，改變細(xì)胞脂膜（抑制細(xì)胞膜間隔的形成），誘導(dǎo)菌體自溶，抑制胞內(nèi)酶活力，抑制DNA、RNA、蛋白質(zhì)的合成以及與DNA結(jié)合等[42]。Powers等[43]研究者使用1H-NMR法測定來源于鱟的鱟肽I的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)鱟肽 I是通過I型β轉(zhuǎn)角連接的兩親性β-發(fā)夾結(jié)構(gòu)，可轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中發(fā)揮抗菌作用。

圖3 抗菌肽細(xì)胞內(nèi)作用機制[42]Fig. 3 Intracellular mode of action of antimicrobial peptides[42]

抗菌肽除了在醫(yī)藥領(lǐng)域有望替代抗生素外，在食品行業(yè)也具有潛在的開發(fā)和利用價值[33]。宋宏霞[44]采用紫貽貝抗菌肽溶液浸泡草莓及鱸魚，監(jiān)測在一定貯藏條件下有關(guān)指標(biāo)的變化情況，研究結(jié)果表明抗菌肽具有保鮮防腐的作用。海洋無脊椎動物只依靠體內(nèi)免疫機制抵抗入侵細(xì)菌或病原體，因此內(nèi)源性抗菌肽豐富[45]，但海洋抗菌肽的獲取存在提取操作繁瑣、純化成本高等問題，使其生產(chǎn)應(yīng)用受限。提高抗菌肽的生產(chǎn)效率、降低成本是研究者們關(guān)注的焦點，高效經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)安全、穩(wěn)定的海洋源抗菌肽對其發(fā)展和應(yīng)用起有力的推動作用。

3 抗凍肽

3.1 冰晶-肽鏈的構(gòu)效關(guān)系

抗凍蛋白（antifreeze protein，AFP）是一類具有熱滯活性、能夠抑制冰晶生長和重結(jié)晶的蛋白質(zhì)，許多極地海洋魚類能夠存活于低溫環(huán)境中正是得益于體內(nèi)的AFP有效阻止血液在低溫條件下凝固成冰[46]。海洋魚源AFP根據(jù)氨基酸組成和結(jié)構(gòu)不同可分為6 種[47-49]（圖4）：抗凍糖蛋白（antifreeze glycoprotein，AFGPs）、AFP I、AFP II、AFP III和AFP IV及高活性AFP。AFGPs是最早被提取的AFP，肽鏈由肽糖單元重復(fù)連接而成，且發(fā)現(xiàn)糖基團(tuán)是重要的抗凍活性基團(tuán)[50]，AFGPs在溶液中自發(fā)形成左手螺旋構(gòu)像，保證肽鏈中的親水的雙糖基一側(cè)朝向溶液，形成氫鍵與水分子結(jié)合。AFP I的分子質(zhì)量為3.3～4.5 kDa，富含丙氨酸[51]，在AFP中結(jié)構(gòu)最為簡單，其二級結(jié)構(gòu)均呈現(xiàn)兩親性α螺旋，即親水性氨基酸鏈與疏水性氨基酸鏈分別位于螺旋軸的兩側(cè)。AFP II結(jié)構(gòu)特征表現(xiàn)為半胱氨酸含量較高，且約有一半能形成二硫鍵。研究證明，用巰基乙醇或者二硫蘇糖醇破壞其二硫鍵會造成熱滯活性喪失，因此，二硫鍵在AFP II分子中起著關(guān)鍵作用[52]。AFP III二級結(jié)構(gòu)主要由9 個β折疊組成，其兩兩形成三明治樣結(jié)構(gòu)，剩余的游離在外，另外，AFP III中的親水殘基可以形成多個氫鍵使其和冰晶之間的結(jié)合力增強[53]。AFP IV的分子質(zhì)量約為12.3 kDa，谷氨酰胺含量高，二級結(jié)構(gòu)富含兩親性α螺旋，α螺旋以反向排列折疊成螺旋束的形式使得疏水基團(tuán)朝內(nèi)，親水基團(tuán)向外與冰晶結(jié)合[52]。Marshall等[54]從冬鰈魚中分離得到一種高活性的AFP，它的活性和分子質(zhì)量都比其他類型的AFP更高，使冬鰈魚能夠在－1.9 ℃的極限溫度下生存。

圖4 6 種魚類AFP結(jié)構(gòu)圖[55]Fig. 4 Structural illustration of six kinds of fish antifreeze proteins[55]

但是，天然海洋源AFP含量甚微，應(yīng)用成本高，隨著對AFP活性結(jié)構(gòu)研究的深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)AFP的抗凍活性可來源于其一級結(jié)構(gòu)多肽鏈中的某些片段[56]。海洋源抗凍肽則是利用海洋源蛋白質(zhì)通過生物酶解技術(shù)，篩選出具有抗凍活性的肽段，一般具有GP-X（X為任何氨基酸殘基）三肽重復(fù)序列、GTPG-和GPP(OH)_G-等特殊結(jié)構(gòu)特征，且存在特定的氨基酸序列長度[10,57-59]。例如，Wang Shaoyun等[10]將鯊魚皮膠原蛋白酶解產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，得到了等電點小于5.0、分子質(zhì)量為906 Da的純化親水性抗凍肽SsC-AFP，其氨基酸序列為GAIGPAGPLGP。對保加利亞乳桿菌進(jìn)行低溫脅迫處理，當(dāng)SsC-AFP質(zhì)量濃度為250 μg/mL時，菌種存活率高達(dá)90.28%。不同來源的抗凍肽無論結(jié)構(gòu)或活性都存在著很大的差異，其抗凍機理、學(xué)說也不完全一致，闡明抗凍肽的作用機制對研究者來說仍然是一個巨大挑戰(zhàn)。

3.2 吸附-抑制與親水-互補作用機理

“吸附-抑制”學(xué)說認(rèn)為AFP能夠在冰晶結(jié)合面上吸附，形成冰曲面，通過開爾文效應(yīng)抑制其生長[60]。在純水體系中，冰晶垂直于晶體表面的方向生長（圖5A），當(dāng)AFP/抗凍肽分子吸附于冰生長路徑的表面上（圖5B、C），需要在外施加推動力促使冰在雜質(zhì)間生長。具有特定分子質(zhì)量和氨基酸結(jié)構(gòu)的抗凍肽積累在冰-水界面，與水分子形成氫鍵吸附于冰核表面，改變冰晶生長方向和形態(tài)，形成六棱柱型或六角雙錐體型，抑制冰晶生長及重結(jié)晶[10,57-59,61]。

圖5 溶液中冰晶的形狀[55]Fig. 5 Shapes of ice crystals in solutions[55]

汪少蕓[10,57]、Damodaran[58]等根據(jù)活性肽氨基酸序列結(jié)構(gòu)進(jìn)一步對抗凍肽與冰結(jié)構(gòu)層相互作用的理論模型進(jìn)行了分子動力學(xué)模擬構(gòu)建，采用表面“親水-互補”模型對其作用機制進(jìn)行分析[57]，如圖6所示，該模型認(rèn)為，具有特定氨基酸長度和結(jié)構(gòu)的抗凍膠原肽的冰晶結(jié)合位點所形成的表面與冰結(jié)構(gòu)層面通過氫鍵互補聯(lián)結(jié)，同時抗凍肽所含有的脯氨酸和丙氨酸殘基等烷基側(cè)鏈可以提供非極性環(huán)境以穩(wěn)定氫鍵間的作用?？箖鲭呐c冰的結(jié)合阻止了冰晶的生長，表現(xiàn)出顯著的冰晶生長抑制活性。

圖6 抗凍多肽與冰晶表面親水-互補作用示意圖[62]Fig. 6 Surface hydrophilic-complementary interaction between antifreeze peptides and ice molecules[62]

抗凍肽具有良好抗凍活性的同時，也具有穩(wěn)定的性質(zhì)，獲取手段便捷，制備量大，相較于AFP擁有更多的應(yīng)用優(yōu)勢[56]。抗凍肽在食品工業(yè)中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在減少低溫冷鏈?zhǔn)称返钠焚|(zhì)劣變，能夠有效降低冷凍損傷，抑制冰晶形成、生長和重結(jié)晶。通過合理地開發(fā)利用海洋生物中豐富的蛋白質(zhì)資源開發(fā)抗凍肽，替代現(xiàn)有高鹽、高糖的食品抗凍劑或保水劑是一種新趨勢。

4 金屬離子螯合肽

4.1 肽-金屬離子螯合的構(gòu)效關(guān)系

金屬元素對人體具有明顯的生理功能和營養(yǎng)作用，它們的需求量小，卻與機體生長代謝密切相關(guān)[63]。人體內(nèi)對金屬礦物元素吸收利用率較低，其缺乏會引起多種疾病，因此膳食金屬元素補充劑的開發(fā)受到廣泛關(guān)注。肽-金屬離子螯合物可以利用機體對肽的吸收而使金屬離子在消化道中更容易被吸收，具備優(yōu)于無機態(tài)金屬離子的生理生化特性。

影響金屬螯合活性的結(jié)構(gòu)特征包括肽的分子大小、氨基酸組成和特定的氨基酸序列，有研究指出海洋源金屬離子螯合肽的羧基、氨基以及側(cè)鏈中含孤對電子的氮、氧、硫原子，與金屬陽離子通過化學(xué)鍵結(jié)合形成肽-金屬離子螯合物[12,64]。Bao Xiaolan等[65]研究表明，某些特定氨基酸序列，如Asn-Cys-Ser被認(rèn)為具有較高的螯合活性，特定氨基酸也能顯著影響金屬離子螯合肽的螯合作用，如天冬氨酸、谷氨酸和組氨酸，這些氨基酸上的羧基可能是螯合作用的結(jié)合位點，從而顯著影響螯合反應(yīng)。Zhang Lingtuo等[66]從裂殖壺菌粕蛋白水解產(chǎn)物中分離純化出一種鈣螯合肽，鑒定氨基酸序列為Ser-Ser-Val（SSV），分子質(zhì)量為291.15 Da，具有良好的肽鈣結(jié)合能力。利用傅里葉變換紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)該肽的螯合位點主要為羰基上的氧原子和氨基或亞氨基上的氮原子，SSV-Ca螯合物在酸堿條件下均表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性和溶解性，有利于人體胃腸道對鈣的吸收和利用。Bouhallab等[67]研究發(fā)現(xiàn)，肽螯合金屬離子的能力還與肽和金屬離子結(jié)合的相對親和常數(shù)、穩(wěn)定常數(shù)等有關(guān)。此外，蛋白的磷酸化位點會影響肽-金屬離子螯合反應(yīng)，Wang Jiaxin等[68]發(fā)現(xiàn)酪蛋白的去磷酸化降低了酪蛋白磷酸肽與鋅離子的螯合作用。多肽分子可以通過N端氨基、C端羧基、氨基酸側(cè)鏈以及肽鏈中的羰基和亞氨基螯合金屬離子，使其具有更高的配合率和穩(wěn)定性，并且相較于其他類型的金屬離子補充劑具有無毒副作用、制備成本低、操作便捷等優(yōu)點[63]。

4.2 肽-金屬離子螯合物的吸收作用機制

肽-金屬離子螯合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，肽對金屬離子的保護(hù)可以避免金屬離子受食物中的植酸和草酸的沉淀，從而提高其生物利用度[69]。

目前出現(xiàn)了兩種被人們較為接受的肽-金屬離子螯合物吸收機制的假說。1）完整吸收假說。即肽作為有機外殼將金屬陽離子包裹起來，肽-金屬離子螯合物以肽的形式被完整吸收進(jìn)入小腸，通過肽的吸收通道，在小腸中進(jìn)行轉(zhuǎn)運[70]，以完整的結(jié)構(gòu)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。2）競爭吸收假說。即多肽金屬螯合物中的金屬元素通過競爭方式被吸收利用，螯合物整體進(jìn)入消化道后，金屬元素受肽的包裹保護(hù)到達(dá)小腸黏膜的刷狀緣，在吸收位點處肽-金屬離子螯合物發(fā)生水解，膳食金屬礦物元素分離出來，以離子形式進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，通過金屬離子通道進(jìn)入體內(nèi)消化。Feng Yinuo等[71]發(fā)現(xiàn)酪蛋白水解物能夠防止鋅離子與磷酸鈣發(fā)生聚沉，提高小鼠腸道對鋅的吸收，推斷Zn/CaP-納米復(fù)合物一部分在細(xì)胞溶酶體中降解釋放Zn2＋到細(xì)胞質(zhì)中；另一部分經(jīng)內(nèi)吞作用進(jìn)入基底外側(cè)（圖7）。Ferraretto等[72]的研究進(jìn)一步說明，螯合物的作用方式可能是肽直接嵌入到細(xì)胞膜中形成特殊的Ca2＋選擇性通道，作為一種鈣載體活性肽經(jīng)過細(xì)胞膜內(nèi)吞作用使Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞溶質(zhì)中。憑借機體對肽類的吸收通路機制，肽與金屬離子的螯合物具有作為一類新式金屬離子增補劑的潛質(zhì)，用于提升金屬離子在機體的生物利用度和生物利用速度。

圖7 Zn/CaP納米復(fù)合物的腸吸收[71]Fig. 7 Intestinal absorption of Zn/CaP nanocomplexes[71]

目前，研究者們通過各種方式制備分離得到海洋源金屬離子螯合肽，在與各類金屬離子發(fā)生螯合作用后可以作為抑菌劑[73]、抗氧化劑[74]和人體金屬離子補充劑[75]等產(chǎn)品應(yīng)用到工業(yè)化生產(chǎn)中，具有無毒副作用、生物利用率更高、制備成本更為低廉、流程更為簡便等優(yōu)點，有著廣泛的商業(yè)價值潛力和研究前景。

5 免疫調(diào)節(jié)肽

5.1 肽與免疫調(diào)節(jié)的構(gòu)效關(guān)系

免疫力降低是人體代謝失常的根本原因，免疫系統(tǒng)是抵御病原體的第一道防線，能夠在身體機能受損之前提供保護(hù)。因此，機體免疫功能的強化是疾病防控及診療的關(guān)鍵。海洋生物成為新型免疫調(diào)節(jié)肽提取的重要來源。Chalamaiah等[76]對不同酶水解產(chǎn)生的魚卵蛋白水解物的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)潛力進(jìn)行了評估。在45 d內(nèi)，對不同濃度的魚卵蛋白水解物進(jìn)行了處理。胃蛋白酶水解產(chǎn)物增加了脾巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性和吞噬活性以及血清中免疫球蛋白A的水平。同時，胃蛋白酶和堿性蛋白酶水解物增強腸道內(nèi)黏膜免疫，而胰蛋白酶水解產(chǎn)物增加了脾臟中CD4＋、CD8＋細(xì)胞數(shù)量。這些研究表明，水解產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)作用與蛋白酶的類型有關(guān)，酶的特異性決定了生物活性肽的片段大小和序列分布。有研究報道，阿拉斯加鱈魚的蛋白水解物能夠刺激小鼠脾臟細(xì)胞的淋巴細(xì)胞增殖，與此活性相關(guān)的多肽的序列為NGMTY、NGLAP、WT[77]。免疫效應(yīng)可能與氨基酸的物理化學(xué)特性相關(guān)，如正電荷數(shù)量、疏水性和鏈長。帶正電荷的肽類似于趨化因子，可以結(jié)合免疫細(xì)胞上的受體，激活免疫反應(yīng)。Yang Ruiyue等[78]在鮭魚酶解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)其氨基酸組成主要為Asp、Glu、Lys和Leu，得到的寡肽可以顯著提高刀豆蛋白的活性、刺激淋巴細(xì)胞增殖、促進(jìn)分泌細(xì)胞因子、調(diào)節(jié)自然殺傷細(xì)胞活性等。Merly等[79]在對鯊魚軟骨酶解產(chǎn)物的研究中發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物中Ⅱ型膠原蛋白α-1鏈和糖肽可進(jìn)一步誘導(dǎo)機體的免疫反應(yīng)。Wang Yukai等[80]對牡蠣水解多肽的免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了研究，經(jīng)牡蠣水解多肽處理的小鼠，體內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯增多，同時發(fā)現(xiàn)自然殺傷細(xì)胞的活性也顯著提高，血清中白細(xì)胞介素2分泌水平也有所提高。蛋白質(zhì)被人體攝入后經(jīng)過消化道酶解作用，多以小肽的形式通過小腸絨毛上皮細(xì)胞消化吸收。根據(jù)體內(nèi)外的研究證據(jù)表明，免疫調(diào)節(jié)肽被認(rèn)為是一種具有潛力的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)策略物質(zhì)，能夠增強對感染因子的反應(yīng)并減少組織損傷，對減輕自身免疫性疾病、炎癥發(fā)生或與免疫系統(tǒng)相關(guān)的其他過程有著重要作用。

5.2 肽-特定細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的作用機制

免疫調(diào)節(jié)肽可通過調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞等刺激機體的免疫功能，關(guān)于免疫活性肽的調(diào)節(jié)機制一直是研究者們關(guān)注的熱點[81]。外源性免疫調(diào)節(jié)肽可以通過直接作用于免疫系統(tǒng)的特定細(xì)胞發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，其作用途徑主要通過刺激特定細(xì)胞的細(xì)胞因子的分泌，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分化或激活免疫相關(guān)的細(xì)胞通路等[82-83]。

目前，研究者對免疫調(diào)節(jié)肽與免疫系統(tǒng)特定細(xì)胞之間的相互作用假說猜測與抗高血壓和阿片肽系統(tǒng)有關(guān)[82-83]。如圖8所示，相關(guān)研究表明免疫調(diào)節(jié)肽能夠與位于免疫細(xì)胞表面的δ、μ型或κ型阿片受體相互作用，中樞阿片受體的激活可以調(diào)節(jié)周圍的免疫系統(tǒng)[84-85]。酪啡肽在與阿片受體相互作用時，抑制了伴刀豆球蛋白刺激的淋巴細(xì)胞DNA合成和淋巴細(xì)胞中鳥氨酸脫羧酶的活性，從而抑制了體外固有層淋巴細(xì)胞增殖，影響人體黏膜免疫系統(tǒng)。肽序列決定了免疫細(xì)胞的反應(yīng)活性，免疫調(diào)節(jié)肽的作用可歸因于N端或C端區(qū)域的精氨酸、色氨酸或磷酸化的絲氨酸殘基，以及谷氨酰胺的存在，這些氨基酸能夠被免疫細(xì)胞表面的阿片受體識別[83]。

圖8 肽與免疫細(xì)胞相互作用的相關(guān)機制[84]Fig. 8 Mechanism associated with peptides and their interactions with immune cells[84]

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽是高活性酪蛋白血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽，對于高血壓有很好的治療效果。免疫調(diào)節(jié)作用也與ACE抑制肽的作用機制相關(guān)。在ACE抑制肽發(fā)揮功效時形成的緩激肽是一種免疫調(diào)節(jié)肽，因此ACE抑制肽也具有免疫調(diào)節(jié)活性。緩激肽能夠與靶細(xì)胞上的激肽受體結(jié)合，通過刺激巨噬細(xì)胞促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并誘導(dǎo)淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[86]。免疫調(diào)節(jié)肽的N端或C端區(qū)域內(nèi)有精氨酸可以被T細(xì)胞的膜結(jié)合受體識別，這些T細(xì)胞是淋巴因子的產(chǎn)生者。因此，C端精氨酸的存在是ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)特點，并且與免疫調(diào)節(jié)活性相關(guān)。

目前，許多藥物在臨床上用于控制人體免疫功能，包括左旋咪唑、咪喹莫特、匹多莫德等。但大多數(shù)合成的免疫調(diào)節(jié)藥物都有一定的毒性和副作用，而天然來源的免疫調(diào)節(jié)蛋白或肽安全可靠且成本較低，現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)人類攝食蛋白質(zhì)經(jīng)消化道的酶解作用后，大多是以小肽的形式通過腸壁轉(zhuǎn)運消化吸收，海洋源免疫調(diào)節(jié)肽可從多層面廣泛地調(diào)節(jié)機體的免疫功能，對提高機體免疫力、確保機體健康具有重要的意義[87]。

6 結(jié) 語

此外，科研工作者發(fā)現(xiàn)海洋生物活性肽還具有抗衰老[88]、降血糖[89]、抗高血壓[90]、ACE抑制活性[91]、抗炎[92]等功效，為此研究者還在不斷地發(fā)現(xiàn)、分離、純化新的海洋源功能肽類物質(zhì)[1]。海洋源生物活性肽分子質(zhì)量小，易被人體吸收和滲透到組織中；同時其毒副作用小、穩(wěn)定性高，具有食療效果等優(yōu)點[93]，這啟發(fā)了研究者，海洋生物酶解提取物有望向功能食品的研發(fā)方向發(fā)展，同時充分利用海洋生物加工副產(chǎn)物，經(jīng)過活性肽提取能夠帶來巨大的收益，提升商業(yè)價值。由于海洋資源的富饒，海洋環(huán)境的特殊和多樣化，現(xiàn)有的活性功能肽作用機制有待深究，新型的海洋源生物活性肽也待科學(xué)家們?nèi)グl(fā)現(xiàn)。

海洋源生物活性肽的開發(fā)仍然存在較大的局限性。酶解法是目前制備活性肽最為高效、普遍的方法，可以通過開發(fā)新型蛋白酶試劑、多種蛋白酶聯(lián)合反應(yīng)、采用多技術(shù)結(jié)合對酶解法獲得海洋源生物活性肽進(jìn)行深入優(yōu)化，推進(jìn)酶工程在海洋源生物活性肽領(lǐng)域的應(yīng)用[9]。目前對海洋生物活性肽研究大部分仍處于實驗室階段，可以通過開發(fā)適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的活性肽分離設(shè)備，使得海洋生物活性肽能夠從實驗室科研水平進(jìn)入產(chǎn)業(yè)規(guī)?；纳a(chǎn)。

海洋生物活性肽作為功能性食品及藥品具有廣闊的應(yīng)用前景，但是在體內(nèi)的研究還相對較少，在投入市場前，須對其活性進(jìn)行檢測和安全性評估[9]。此外，已有研究證明蛋白或肽的構(gòu)象對這些分子的生物活性起到了決定性作用，因此，更加深入的構(gòu)效關(guān)系分析極其必要，可以考慮對已經(jīng)獲得的海洋生物活性肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾，從而提高其活性和性能，有利于市場開發(fā)利用。