食品中金剛烷胺殘留檢測方法新進(jìn)展

彭 娟，賴科洋

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330031）

金剛烷胺是一種抑制流感病毒的抗病毒藥物，其分子式為C10H17N，結(jié)構(gòu)如圖1所示，相對分子質(zhì)量為151，易溶于有機(jī)溶劑，不溶于水，無嗅無味。金剛烷胺具有良好的抗病毒能力，曾經(jīng)大量用于預(yù)防和治療豬傳染性胃腸炎和禽流感[1]。近年來的研究表明，A型流感病毒對金剛烷胺的耐藥性逐漸凸顯[2-3]。盧桂蘭等[4]分析了2008—2011年連續(xù)3 個(gè)流感監(jiān)測季80 株兒童甲型H3N2流感毒株金剛烷胺類耐藥情況，結(jié)果顯示甲型H3N2流感毒株耐藥率分別為88%、100%和100%。周妍等[5]對2009—2012年上海地區(qū)兒童甲型H3N2流感病毒的耐藥性進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果表明，測序的病毒株對金剛烷胺耐藥率達(dá)到100%。長期濫用金剛烷胺會提高流感病毒株的耐藥性，進(jìn)而危害人類健康。因此，2005年農(nóng)業(yè)部發(fā)布第560號公告，金剛烷胺類等人用抗病毒藥物移植獸用，缺乏科學(xué)規(guī)范、安全有效的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用于動(dòng)物病毒性疫病不但給動(dòng)物疫病控制帶來不良后果，而且影響國家動(dòng)物疫病防控政策的實(shí)施，禁止金剛烷胺在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的銷售和流通。然而，近年來食品中金剛烷胺檢出事件仍時(shí)有發(fā)生。長沙河馬市集商貿(mào)有限公司銷售的農(nóng)家雞[6]、湖南牧勝飛農(nóng)副產(chǎn)品貿(mào)易有限公司生產(chǎn)的農(nóng)家雞蛋[7]、重慶明品福冷鏈物流公司的凍雞大腿[8]、拉薩堆龍德盛普惠農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司銷售的公雞[9]和山東的粉殼雞蛋[10]被檢出含有禁用藥物金剛烷胺。楊琳芬等[11]隨機(jī)檢測了606 批次禽蛋和278 批次禽肉，檢出3 批金剛烷胺陽性樣品。齊剛等[12]對12 批雞蛋樣品進(jìn)行了檢測，檢出2 批金剛烷胺陽性樣品。程靜等[13]2017—2018年在內(nèi)蒙古地區(qū)采集雞蛋60 份、雞肉60 份，總共檢出26 份金剛烷胺陽性樣品，檢出率達(dá)21.7%。由此可見，目前食品中金剛烷胺仍在非法使用，需要嚴(yán)格管控。為了更有效地監(jiān)管金剛烷胺，保障食品安全，近年來我國先后制定了食品中金剛烷胺檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

圖1 金剛烷胺結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formula of AMD

表1 食品中金剛烷胺檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)Table1 National standard, industrial standard, and local standards for the detection of AMD in foods

由此可見，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中金剛烷胺殘留的確證方法是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，快速篩選方法可以選擇酶聯(lián)免疫吸附法。近年來，金剛烷胺殘留檢測方法的研究得到了學(xué)者們的關(guān)注，張穎穎等[20]介紹了食品中多種抗病毒類藥物殘留檢測方法的研究進(jìn)展，如采用酶聯(lián)免疫吸附測定法、色譜法、光譜法、電化學(xué)傳感器檢測法和芯片法檢測金剛烷胺和金剛乙胺等，其中重點(diǎn)介紹了色譜檢測法。本文專注于金剛烷胺殘留檢測，在簡要介紹傳統(tǒng)檢測方法的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)對基于抗原抗體反應(yīng)的新型免疫分析法和基于金剛烷胺分子印跡的檢測新方法進(jìn)行了論述和分析。

1 金剛烷胺殘留檢測的傳統(tǒng)方法

1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是利用液體作流動(dòng)相的分析方法。液體樣本被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動(dòng)，不同物質(zhì)與色譜柱中固定相的作用力不同，導(dǎo)致從色譜柱中流出時(shí)間不同而進(jìn)行分離。根據(jù)出峰時(shí)間可對化合物進(jìn)行定性分析；根據(jù)峰面積可對化合物進(jìn)行定量分析。高效液相色譜法適用于分析不易揮發(fā)、不同極性的有機(jī)化合物。

Zhang Jinzhen等[21]建立了高效液相色譜法檢測蜂蜜中的金剛烷胺。蜂蜜先用固相萃取小柱凈化，再用4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑衍生，用C18色譜柱分離后用熒光檢測器檢測（激發(fā)波長470 nm、發(fā)射波長530 nm）。優(yōu)化參數(shù)后高效液相色譜法最低檢測限是0.008 μg/g，線性范圍是0.025～1.000 μg/mL，回收率在90%以上，批內(nèi)相對偏差和批間相對偏差范圍是3.4%～5.1%。

1.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是一種將液相色譜法和質(zhì)譜法有機(jī)整合的分析方法。液體樣本經(jīng)過液相色譜分離后進(jìn)入質(zhì)譜儀，液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜作為檢測系統(tǒng)。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢的互補(bǔ)，將色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力，與質(zhì)譜具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來，是一種應(yīng)用最廣的確證方法。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是一種靈敏準(zhǔn)確的確證法，大量應(yīng)用于雞蛋[22-23]、禽肉[24-30]、豬肉[31]、牛奶[32]、蜂蜜[33]和水產(chǎn)品[34-35]中金剛烷胺的檢測。

Tsuruoka等[36]建立了檢測油炸雞、煎鵪鶉蛋、烤雞、雞肝、雞肫和雞蛋中金剛烷胺的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法。該方法對這些樣本的定量檢測限均為1.0 μg/kg，回收率為79.9%～91.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～3.6%。

Tumipseed等[37]建立了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測雞肉干、雞肉塊和雞肉球中的金剛烷胺，2.5～50 μg/kg水平的添加回收率為76%～123%（氘標(biāo)記內(nèi)標(biāo)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于12%），實(shí)際樣本的檢測發(fā)現(xiàn)，金剛烷胺含量有的小于2.5 μg/kg，有的大于600 μg/kg。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法是利用酶（通常為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶）標(biāo)記抗體或抗原以檢測相應(yīng)抗原或抗體的一種免疫學(xué)分析方法。首先將抗原或抗體結(jié)合到酶標(biāo)板的固相表面，再加入相對應(yīng)酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原。酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原可以與固相表面的抗原或抗體結(jié)合，加入底物后，底物被酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)抗原上的酶催化為有色產(chǎn)物，有色產(chǎn)物的吸光度與受檢抗體或抗原的量成比例，故可根據(jù)吸光度來定性或定量分析。酶聯(lián)免疫吸附法具有靈敏性強(qiáng)、特異性高、重復(fù)性好、檢測速度快的特點(diǎn)。

要建立高靈敏度的酶聯(lián)免疫吸附法需要制備合格的檢測抗原和抗體。范素菊等[38]對金剛烷胺進(jìn)行改造，合成了免疫抗原，用免疫抗原免疫小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合，獲得金剛烷胺雜交瘤，將細(xì)胞株注射小鼠腹腔得到腹水，腹水對金剛烷胺的半抑制濃度（the half maximal inhibitory concentration，IC50）為1.02 μg/L，只與金剛乙胺有9.82%的交叉反應(yīng)率。

譚庶等[39]自主制備了檢測抗原和抗體，建立了一種傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法檢測雞肉中的金剛烷胺，方法的檢出限為0.21 μg/L，線性范圍為0.07～6.15 μg/L，實(shí)際雞肉樣本的添加回收率為101.69%～108.71%，批間和批內(nèi)變異系數(shù)均低于15%。除金剛乙胺外，與其余結(jié)構(gòu)及功能類似物均無交叉反應(yīng)，方法特異性好；實(shí)際樣品檢測中，酶聯(lián)免疫吸附法與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測結(jié)果符合，整個(gè)檢測反應(yīng)時(shí)間需60 min左右。實(shí)驗(yàn)建立的金剛烷胺酶聯(lián)免疫吸附法的準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度較高，可用于雞肉中金剛烷胺殘留的快速定量檢測。

崔乃元等[40]建立了一種同時(shí)檢測雞肉、鴨肉中金剛烷胺等結(jié)構(gòu)類似物的酶聯(lián)免疫吸附法。金剛烷胺的最低檢測限分別為0.57 μg/kg（雞肉）和0.59 μg/kg（鴨肉）；最低定量限分別為0.85 μg/kg（雞肉）和0.94 μg/kg（鴨肉），添加回收率為87%～98%。

Xie Sanlei等[41]選擇了抗金剛烷胺的單鏈抗體，通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)介導(dǎo)與辣根過氧化物酶偶聯(lián)，再與金剛烷胺功能化磁珠結(jié)合形成免疫復(fù)合物，借助于生物素-鏈霉親和素放大體系和免疫磁富集體系，相比傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附法的最低檢測限（8.4 ng/mL），靈敏度有了明顯提高（最低檢測限0.64 ng/mL）。

1.4 免疫層析法

免疫層析法是一種以硝酸纖維素膜為固相載體的分析方法，以膠體金（或其他顯色材料）為標(biāo)記物與抗體結(jié)合，加樣后在硝酸纖維素膜毛細(xì)管作用下泳動(dòng)，在硝酸纖維素膜的檢測線和質(zhì)控線上發(fā)生高度特異性抗原抗體反應(yīng)，顯示肉眼可見的紅色條帶（或其他色帶），從而實(shí)現(xiàn)對待測物的定性或定量分析。免疫層析法具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)適用、方便基層的優(yōu)勢，適用于金剛烷胺的快速檢測[42-43]。

Wu Songsong等[44]制備了膠體金免疫層析試紙條檢測雞肉中的金剛烷胺，檢測時(shí)間只需要12 min?；诒銛y式膠體金讀取儀，方法的最低檢測限為1.8 ng/mL，線性范圍為2.5～25 ng/mL，平均回收率為81%～120%，批內(nèi)、批間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差都小于15%，膠體金免疫層析試紙條的檢測結(jié)果和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的檢測結(jié)果符合。

1.5 化學(xué)發(fā)光免疫分析法

化學(xué)發(fā)光免疫分析法是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合的分析方法，具有靈敏度高、檢測范圍寬、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。

崔廷婷等[45]將金剛烷胺單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)形成金剛烷胺免疫磁珠，然后加入待測樣品和辣根過氧化物酶標(biāo)記的金剛烷胺抗原。待測樣品中的金剛烷胺和辣根過氧化物酶標(biāo)記的金剛烷胺抗原競爭結(jié)合金剛烷胺免疫磁珠上的抗體，磁分離后加入化學(xué)發(fā)光底物A液和B液，辣根過氧化物酶催化發(fā)光底物液產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，發(fā)光強(qiáng)度與待測樣品中的金剛烷胺含量成反比?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法的線性范圍是0.085～2.729 μg/L。金剛烷胺在豬肉中的檢測限為0.1 μg/kg，平均添加回收率為80.2%～94.5%，批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。

許小炫等[46]建立了同時(shí)檢測雞肉、鴨肉、鴿肉中金剛烷胺等兩種獸藥的化學(xué)發(fā)光免疫分析法，采用碳酸鉀和乙酸乙酯同時(shí)提取，檢測金剛烷胺時(shí)，方法的最低定量限為0.06 μg/L，線性范圍為0.06～1.77 μg/L，添加回收率為92.55%～105.14%，變異系數(shù)均低于10.48%。

2 新型檢測方法

2.1 基于免疫學(xué)反應(yīng)的檢測新方法

基于特異性抗原抗體反應(yīng)，最近出現(xiàn)了多種多樣的新型免疫分析法。Zhu Fangfei等[47]基于DNA堿基互補(bǔ)配對和非共價(jià)交聯(lián)膠體金建立了一種新型免疫分析法檢測金剛烷胺。如圖2所示，首先將金剛烷胺人工抗原包被在酶標(biāo)孔內(nèi)，將金剛烷胺抗體和引物1偶聯(lián)在膠體金表面形成抗體-膠體金-引物1免疫復(fù)合物，將此免疫復(fù)合物和金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品（或待檢樣本）同時(shí)加入酶標(biāo)孔，包被在酶標(biāo)孔內(nèi)的人工抗原和金剛烷胺共同競爭免疫復(fù)合物中有限的抗體，經(jīng)過洗板，再加入與引物1互補(bǔ)的引物2進(jìn)行雜交配對。隨后吸取上清中游離的引物2，先后向其中加入膠體金和NaCl溶液，根據(jù)膠體金溶液顏色變化檢測金剛烷胺的濃度。單鏈DNA（引物2）能提高膠體金對鹽離子的耐受能力，膠體金表面的單鏈DNA含量越高，膠體金對鹽離子的耐受能力越強(qiáng)。樣本中金剛烷胺濃度的提高將減少與包被在酶標(biāo)孔內(nèi)人工抗原結(jié)合的免疫復(fù)合物的量，從而導(dǎo)致引物1的量減少，與引物1結(jié)合的引物2的量也隨之減少，因此游離的引物2的量將提高，使得膠體金對鹽離子的耐受能力增強(qiáng)，使膠體金保持紅色，反之膠體金溶液聚集變藍(lán)。此方法檢測金剛烷胺的靈敏度可以達(dá)到0.033 μmol/L。

圖2 基于DNA堿基互補(bǔ)配對和膠體金聚集檢測金剛烷胺示意圖[47]Fig. 2 Schematic illustration of the method based on DNA hybridization reaction and AuNPs aggregation for the detection of AMD[47]

Pan Mingfei等[48]基于抗原抗體反應(yīng)，建立了新型表面等離子共振免疫抑制芯片法檢測牛奶、雞蛋、雞肉和鴨肉中的金剛烷胺。如圖3所示，表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）是一種物理光學(xué)現(xiàn)象，在發(fā)生全反射的芯片上涂上薄層金膜，由于金膜中有自由電子，它們不停在平衡位置附近振動(dòng)，并具有一定的頻率。檢測抗原包被在芯片表面，當(dāng)抗體和待檢物質(zhì)注射到微流孔中，在芯片表面會發(fā)生抗原-抗體反應(yīng)，利用芯片表面的折射率的改變引起共振角的變化，來推斷芯片表面的變化。檢測器能跟蹤檢測溶液中的抗體與芯片表面上檢測抗原的結(jié)合、解離整個(gè)過程的變化，最終確定金剛烷胺的濃度。方法的檢測時(shí)間是6 min，最低檢測限是1.3 ng/mL。每個(gè)芯片可以重復(fù)使用60 次，加標(biāo)回收率為80.2%～102.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.2%，與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測結(jié)果的相關(guān)系數(shù)為0.98。

圖3 等離子體共振免疫抑制芯片法檢測金剛烷胺示意圖[48]Fig. 3 Schematic illustration of the surface plasmon resonance immunosuppression chip for the detection of AMD[48]

Yun Yaguang等[49]設(shè)計(jì)了一種壓電免疫傳感器檢測雞蛋、雞肉、鴨肉和豬肉中的金剛烷胺。這種壓電免疫傳感器基于免疫抑制原理，使用便攜式石英晶體微天平芯片進(jìn)行檢測（圖4）。石英晶片首先進(jìn)行清洗和表面修飾，通過碳二亞胺法介導(dǎo)偶聯(lián)檢測抗原，加入抗體和待檢物質(zhì)后用石英晶體微天平可以獲得物質(zhì)吸附過程中頻率的變化，頻率的變化可以轉(zhuǎn)化為質(zhì)量的變化從而檢測出金剛烷胺的質(zhì)量濃度。方法的檢測時(shí)間是5 min，最低檢測限是1.3 ng/mL。每個(gè)芯片可重復(fù)使用20 次，加標(biāo)回收率為83.2%～93.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～4.5%。

圖4 壓電免疫傳感器法檢測金剛烷胺示意圖[49]Fig. 4 Schematic illustration of the quartz crystal microbalance immunosensor for AMD detection[49]

Ma Mingfang等[50]基于金花-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸)-金剛烷基乙二胺-牛血清白蛋白納米探針，結(jié)合磁分離，建立了超靈敏表面增強(qiáng)拉曼散射免疫傳感器均相檢測方法（圖5），可以一步完成雞肉中金剛烷胺的檢測。方法的最低檢測限是0.005 ng/mL，加標(biāo)回收率為74.76%～89.34%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15.04%，方法的靈敏度比傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附法（應(yīng)用同樣的抗原和抗體）提高了兩個(gè)數(shù)量級。

圖5 表面增強(qiáng)拉曼散射方法檢測金剛烷胺示意圖[50]Fig. 5 Schematic illustration of the surface-enhanced Raman scattering for the detection of AMD[50]

Yu Wenbo等[51]建立了一種基于芬頓反應(yīng)的可視化方法現(xiàn)場檢測雞肉中的金剛烷胺。在酶標(biāo)孔中包被金剛烷胺檢測抗原，加入金剛烷胺抗體和樣本，完成競爭抑制免疫學(xué)反應(yīng)后洗板，再分別加入葡萄糖氧化酶-二抗復(fù)合物、葡萄糖溶液、二價(jià)鐵離子溶液、半胱氨酸溶液和紅色的膠體金溶液。如果樣本中沒有金剛烷胺，金剛烷胺抗體將與酶標(biāo)孔中包被的金剛烷胺檢測抗原結(jié)合，葡萄糖氧化酶-二抗復(fù)合物將與金剛烷胺抗體結(jié)合而存在于酶標(biāo)孔，葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖后產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫與二價(jià)鐵離子的混合溶液具有強(qiáng)氧化性，可以將半胱氨酸氧化，從而保護(hù)膠體金不聚集，膠體金保持紅色。如果樣本中金剛烷胺的量達(dá)到或超過最低檢測限，葡萄糖氧化酶-二抗復(fù)合物將不能存在于酶標(biāo)孔中，因此半胱氨酸不被葡萄糖氧化酶氧化，就能使紅色的膠體金聚集并成為深紫色（圖6）。經(jīng)過3 輪信號放大，采用此方法裸眼判斷的最低檢測限是0.3 ng/mL。

圖6 基于芬頓反應(yīng)可視化檢測金剛烷胺示意圖[51]Fig. 6 Schematic illustration of colorimetric detection of AMD by Fenton reaction[51]

Dong Baolei等[52]基于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法的競爭抑制原理，建立了一系列巧妙轉(zhuǎn)換成熒光信號的新型免疫學(xué)方法。如圖7所示，利用碳量子點(diǎn)的熒光內(nèi)濾效應(yīng)建立了一種檢測雞肉中的金剛烷胺的方法。辣根過氧化物酶可以催化無色的四甲基聯(lián)苯胺變成藍(lán)色的氧化產(chǎn)物。氧化產(chǎn)物的吸收峰與碳量子點(diǎn)的吸收峰重疊，通過內(nèi)濾效應(yīng)可以猝滅碳量子點(diǎn)的熒光信號，將傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法中氧化產(chǎn)物的發(fā)光信號轉(zhuǎn)化成碳量子點(diǎn)的熒光信號，最低檢測限達(dá)到0.02 ng/mL，從而提高了檢測靈敏度。

圖7 熒光酶聯(lián)免疫吸附法檢測金剛烷胺示意圖[52]Fig. 7 Schematic illustration of fluorescent ELISA for the detection of AMD[52]

Dong Baolei等[53]將堿性磷酸酶催化底物變色的功能轉(zhuǎn)化為控制碳量子點(diǎn)熒光猝滅，從而建立了另一種新型免疫學(xué)方法。通過自組裝，碳量子點(diǎn)首先吸附在二氧化錳納米片的表面（圖8），碳量子點(diǎn)熒光被猝滅。堿性磷酸酶可催化2-磷酸抗壞血酸水解成抗壞血酸，并將二氧化錳納米片還原分解，因此，吸附在二氧化錳納米片的表面碳量子點(diǎn)游離出來而恢復(fù)熒光，熒光強(qiáng)度的變化與溶液中的金剛烷胺的濃度相關(guān)。這種熒光酶聯(lián)免疫吸附法的最低檢測限是0.035 ng/mL，線性范圍是0.048～1.1 ng/mL。

圖8 碳量子點(diǎn)熒光猝滅法檢測金剛烷胺示意圖[53]Fig. 8 Schematic illustration of carbon quantum dot fluorescent quenching for the detection of AMD[53]

Dong Baolei等[54]還建立了同時(shí)在雞胸肉中檢測兩種禁用獸藥的均相熒光酶聯(lián)免疫吸附法。作者合成了具有豐富氨基的藍(lán)色和綠色熒光碳量子點(diǎn)，將金剛烷胺檢測抗原和氯霉素檢測抗原偶聯(lián)到碳量子點(diǎn)上形成熒光免疫探針，作為能量共振轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的能量供體。兩維分別偶聯(lián)金剛烷胺抗體和氯霉素抗體的二硫化鎢納米片具有較高的猝滅能力，是一種能量受體，如果樣本中沒有金剛烷胺或氯霉素存在，碳量子點(diǎn)上的金剛烷胺檢測抗原或氯霉素檢測抗原就會與二硫化鎢納米片上的金剛烷胺抗體或氯霉素抗體結(jié)合，碳量子點(diǎn)通過能量共振轉(zhuǎn)移，將能量傳給二硫化鎢納米片，熒光發(fā)生猝滅。如果樣本中有金剛烷胺或氯霉素存在，金剛烷胺或氯霉素會先與二硫化鎢納米片上的金剛烷胺抗體或氯霉素抗體結(jié)合，碳量子點(diǎn)上的金剛烷胺檢測抗原或氯霉素檢測抗原就不能再與二硫化鎢納米片上的金剛烷胺抗體或氯霉素抗體結(jié)合，碳量子點(diǎn)因此和二硫化鎢納米片保持較遠(yuǎn)距離，不發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，熒光沒有猝滅，從而保留較強(qiáng)的熒光信號（圖9）。這種新型免疫學(xué)分析方法檢測雞胸肉中金剛烷胺時(shí)，最低檢測限可以達(dá)到0.1 ng/g。

圖9 基于熒光能量共振轉(zhuǎn)移的均相免疫法檢測金剛烷胺示意圖[54]Fig. 9 Schematic illustration of homogeneous immunoassay based on fluorescence resonance energy transfer for the detection of AMD[54]

2.2 基于金剛烷胺分子印跡的檢測新方法

近年來模擬抗體-抗原之間的相互作用，對金剛烷胺（印跡分子）進(jìn)行專一識別，并利用熒光或電流等的變化進(jìn)行檢測的技術(shù)發(fā)展較快[55-58]。

Li Yan等[59]利用羅丹明6G與金剛烷胺的結(jié)構(gòu)相似性，以羅丹明6G與金剛烷胺之間的競爭性主客體相互作用替代競爭性抗原抗體反應(yīng)。作者合成了單[6-(2-氨基乙基)氨基-6-去氧]-β-環(huán)糊精（mono-[6-(2-aminoethylamino)-6-deoxy]-cyclodextin，EDA-CD）和氧化石墨烯，通過EDA-CD表面的氨基和氧化石墨烯表面的羧基共價(jià)偶聯(lián)成EDA-CD-氧化石墨烯復(fù)合物，熒光材料羅丹明6G進(jìn)入EDA-CD內(nèi)部空穴后，由于羅丹明6G和EDA-CD-氧化石墨烯復(fù)合物之間的熒光能量共振轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致羅丹明6G熒光猝滅。當(dāng)金剛烷胺加入到羅丹明6G-EDA-CD-氧化石墨烯復(fù)合物之中，會將羅丹明6G從EDA-CD內(nèi)部空穴中競爭出來，可以重新檢測到羅丹明6G的熒光信號（圖10），根據(jù)熒光信號的強(qiáng)度可以確定金剛烷胺的濃度，方法最低檢測限是0.005 mmol/L，線性范圍是0.012 5～0.750 0 mmol/L。

圖10 基于氧化石墨烯-環(huán)糊精復(fù)合物通過競爭性主客體相互作用檢測金剛烷胺示意圖[59]Fig. 10 Schematic illustration of the AMD fluorescence probing system based on graphene oxide-cyclodextin complex via competitive host-guest interaction for AMD detection[59]

Yun Yaguang等[60]成功設(shè)計(jì)了一種新型分子印跡電化學(xué)傳感器檢測雞肉、雞肝、豬肉、牛肉和羊肉中的金剛烷胺殘留。通過循環(huán)伏安法在金電極表面上電沉積鄰氨基硫酚而形成分子印跡膜（圖11），分子印跡膜對金剛烷胺的印跡因子達(dá)到2.33，對其他3 種結(jié)構(gòu)類似物的印跡因子分別是6.20、5.29和3.95。根據(jù)電流響應(yīng)值可以測定金剛烷胺的濃度，方法的最低檢測限是3.06×10－9mmol/L，線性范圍是4.0×10－7～8.0×10－6mmol/L，真實(shí)樣本的測量值與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法高度一致（R2＞0.99）。

圖11 金電極表面金剛烷胺分子印跡膜制備過程示意圖[60]Fig. 11 Schematic illustration of the preparation process for AMDimprinted film on Au electrode surface[60]

Bardajee等[61]通過將谷胱甘肽修飾的量子點(diǎn)（CdTe/ZnS）嵌入海藻酸鈉生物聚合物而合成了一種新型的有熒光的納米復(fù)合材料（圖12）。當(dāng)一定濃度的金剛烷胺溶液加入到這種納米復(fù)合材料后，納米復(fù)合材料的熒光被有效猝滅。金剛烷胺是一種非熒光物質(zhì)，它對熒光信號的猝滅可能是靜態(tài)猝滅或動(dòng)態(tài)猝滅。通過Stern-Volmer方程式的計(jì)算發(fā)現(xiàn)，熒光猝滅常數(shù)值隨著溫度的升高而升高，意味著量子點(diǎn)熒光信號被金剛烷胺猝滅是一種動(dòng)態(tài)猝滅。研究證明在線性范圍內(nèi)，猝滅的程度與金剛烷胺的濃度成正比?；谶@個(gè)原理建立了金剛烷胺的檢測方法，方法的最低檢測限是0.09×10－6mol/L，線性范圍是3.1×10－6～27.9×10－6mol/L，方法的測量值與高效液相色譜法高度一致（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.3%）。

圖12 谷胱甘肽修飾-量子點(diǎn)復(fù)合物制備示意圖[61]Fig. 12 Schematic illustration for the preparation of sodium alginate/quantum dots nanocomposites[61]

Pozo等[62]發(fā)現(xiàn)硫堇染料和金剛烷胺可以在流動(dòng)注射分析系統(tǒng)中共同競爭葫蘆[8]脲中的空穴（圖13），流動(dòng)注射分析系統(tǒng)根據(jù)硫堇染料熒光強(qiáng)度的變化從而間接檢測金剛烷胺的濃度（圖14）。方法的最低檢測限是0.16 μmol/L，線性范圍是0.5～2.4 μmol/L。每小時(shí)可以檢測68 份樣本，對真實(shí)樣本進(jìn)行檢測時(shí)，方法的回收率為83%～98%。

圖13 金剛烷胺、硫堇、葫蘆[7]脲和葫蘆[8]脲結(jié)構(gòu)示意圖[62]Fig. 13 Structures of AMD, thionine, cucurbit[7]uril, and cucurbit[8]uril[62]

圖14 流動(dòng)注射分析系統(tǒng)檢測金剛烷胺示意圖[62]Fig. 14 Schematic illustration for the detection of AMD by flow injection analysis system[62]

Xie Zhipeng等[63]建立了一種錐形納米通道傳感器定量檢測金剛烷胺，通過自組裝，作者構(gòu)建了葫蘆[7]脲-對甲苯胺復(fù)合膜。加入金剛烷胺溶液后，金剛烷胺會搶占復(fù)合膜的空穴，葫蘆[7]脲將從葫蘆[7]脲-對甲苯胺復(fù)合膜中游離出來，從而使納米通道的疏水性有明顯改變，進(jìn)而影響離子電流，通過檢測電流變化確定金剛烷胺溶液的濃度（圖15）。方法的最低檢測限是4.54 nmol/L，線性范圍是10～1 000 nmol/L。采用這種檢測方法，雞肉樣本的添加回收率為93.1%～107.8%（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.89%～7.99%），液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的添加回收率為92.3%～102.6%（相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～2.72%）。

圖15 納米通道傳感器法檢測金剛烷胺示意圖[63]Fig. 15 Schematic illustration for the detection of AMD by a nanochannel sensor[63]

3 結(jié) 語

盡管2005年農(nóng)業(yè)部發(fā)布第560號公告，禁止金剛烷胺在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中的銷售和流通。但是近年來食品中金剛烷胺被檢出的事件仍時(shí)有發(fā)生。快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測方法是監(jiān)管金剛烷胺的重要技術(shù)手段。本文對廣泛使用的傳統(tǒng)金剛烷胺檢測方法進(jìn)行了介紹，同時(shí)，也對多種新型檢測方法進(jìn)行了重點(diǎn)闡述。采用酶聯(lián)免疫分析法、免疫層析法或化學(xué)發(fā)光免疫分析法等快速檢測方法對樣本進(jìn)行初篩，再用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行確證是目前效率較高的方法。在檢測經(jīng)費(fèi)有限的條件下，可檢測更多的樣本，擴(kuò)大食品安全監(jiān)管范圍，及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題，從源頭保障食品安全。然而，酶聯(lián)免疫吸附法等傳統(tǒng)的快速檢測方法存在靈敏度偏低的問題。因此，近年來快速、靈敏檢測金剛烷胺的新方法不斷涌現(xiàn)。基于免疫學(xué)反應(yīng)的檢測新方法，其利用了抗原抗體結(jié)合的免疫學(xué)反應(yīng)，不同于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法依賴于辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶催化無色底物為有色產(chǎn)物的信號模式，而是采用包括熒光猝滅在內(nèi)的新的信號模式，提高了檢測方法的靈敏度。基于金剛烷胺分子印跡的檢測新方法模擬抗體-抗原之間的相互作用，對金剛烷胺（印跡分子）進(jìn)行專一識別，利用熒光或電流等的變化進(jìn)行檢測，避免了費(fèi)時(shí)耗力的高親和力高競爭性配對抗原抗體的篩選。如何進(jìn)一步提高這些新方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性，是今后研究工作的重點(diǎn)。