牛乳中乳過氧化物酶活性的影響因素

花榜清

（乳業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，上海 200436）

乳過氧化物酶是哺乳動(dòng)物血紅素過氧化物酶家族的一員[1]，存在于哺乳動(dòng)物的分泌液中，如乳汁、唾液、淚液等[2]。乳過氧化物酶是一種分子質(zhì)量約80 kDa的單體糖蛋白[3]，主要通過過氧化氫催化硫氰酸根離子的氧化，從而生成具有廣泛抗菌活性的反應(yīng)產(chǎn)物[4-6]，不同哺乳動(dòng)物乳汁中的乳過氧化物酶含量不同。乳過氧化物酶還參與機(jī)體免疫防御[7-9]，降低某些癌癥風(fēng)險(xiǎn)[10-11]，在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用上具有較大潛力。

乳過氧化物酶是牛乳中天然存在的酶，對(duì)熱的敏感性使其成為牛乳和乳制品熱處理是否過度的重要指標(biāo)。原料乳中含有很多致病微生物，通過合適、有效的熱處理確保牛乳在保質(zhì)期內(nèi)沒有病原微生物至關(guān)重要[12]。 合適的巴氏殺菌工藝應(yīng)在有效殺滅病原性微生物的同時(shí)，產(chǎn)生最低程度的化學(xué)、物理及感官變化，最大程度保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不被破壞。過強(qiáng)的熱處理往往會(huì)使牛乳中活性營(yíng)養(yǎng)素失活，降低牛乳本身的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[13]。乳過氧化物酶是牛乳中熱穩(wěn)定性相對(duì)較強(qiáng)的酶，在巴氏殺菌（72 ℃、15 s）條件下，耐熱球菌、結(jié)核桿菌和大腸桿菌等病原性微生物被滅活的同時(shí)，乳過氧化物酶只會(huì)損失20%～30%的活性，并不會(huì)完全失活[14]。因此，乳過氧化物酶活性可以體現(xiàn)巴氏殺菌過程中是否存在過度熱加工、熱處理等現(xiàn)象，是乳品加工業(yè)一個(gè)非常重要的指標(biāo)。

除了熱處理能有效殺滅病原菌外，早在1987年， Piot等[15]就將無機(jī)膜用于全脂牛乳的過濾除菌，并取得了良好的效果。由于牛乳中脂肪粒徑與細(xì)菌大小較接近，單用膜過濾進(jìn)行除菌不能滿足商業(yè)化生產(chǎn)，因此目前采用的技術(shù)是先將乳脂肪分離出來，將脫脂乳進(jìn)行膜過濾除菌，分離后的稀奶油單獨(dú)進(jìn)行熱處理殺菌，最后將二者混合，該工藝的除菌率可以達(dá)到99.8%～99.9%，同時(shí)能保留更多的熱敏感性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[16]。

本研究采用ISO/TS 17193：2011《乳過氧化物酶活性測(cè)定 光度法》[17]測(cè)定不同殺菌工藝的牛乳中乳過氧化物酶活性，并探究牛乳中乳過氧化物酶活性在不同貯藏溫度、時(shí)間下的變化，為乳品行業(yè)中更高品質(zhì)的鮮乳加工開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛乳樣品 光明牧業(yè)申豐牧場(chǎng)。

二水磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%過氧化氫溶液（分析純） 天津市天力化學(xué)試劑有限公司； 2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）（生物技術(shù)級(jí)） 上海麥克林生化科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

GNP-9270隔水式恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TE612-L電子天平 美國Sartorius公司；Avanti J-301高效離心機(jī) 美國Beckman Coulter有限公司； pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；Specord 205紫外分光光度計(jì) 德國耶拿公司。

1.3 方法

1.3.1 緩沖溶液的配制

將0.72 g二水磷酸氫二鈉和3.99 g磷酸二氫鉀置于燒杯中，加入約450 mL去離子水溶解，調(diào)節(jié)溶液pH值至6.00±0.03，將溶液轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，加去離子水定容。

1.3.2 過氧化氫溶液的配制

吸取100 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的過氧化氫溶液至100 mL容量瓶中，定容。

1.3.3 ABTS溶液的配制

稱取55 mg ABTS于50 mL容量瓶中，加入約30 mL上述緩沖溶液溶解，再添加1.0 mL上述過氧化氫溶液，用上述緩沖溶液定容。

1.3.4 不同殺菌工藝對(duì)牛乳中乳過氧化物酶活性的影響

取原料乳，分別經(jīng)75、85、125 ℃加熱15 s的殺菌工藝以及低溫陶瓷膜過濾工藝處理，冷卻后冷藏備用。分別測(cè)定原料乳和經(jīng)不同殺菌工藝處理后樣品的乳過氧化物酶活性。

1.3.5 濃縮或脫脂工藝對(duì)牛乳中乳過氧化物酶活性的影響

取原料乳進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，再經(jīng)75 ℃、15 s熱處理，冷卻后冷藏備用；取原料乳進(jìn)行離心脫脂，再經(jīng)75 ℃、15 s熱處理，冷卻后冷藏備用。分別測(cè)定原料乳和經(jīng)不同濃縮或脫脂工藝處理后樣品的乳過氧化物酶活性。

1.3.6 貯藏溫度和時(shí)間對(duì)牛乳中乳過氧化物酶活性的影響

分別取3 份原料乳，經(jīng)75 ℃、15 s熱處理后分別放置于5、20、30 ℃條件下，再分別取不同溫度下放置0、6、12、24、48、72、96、168、240 h的樣品，測(cè)定乳過氧化物酶活性。

1.3.7 牛乳樣品稀釋液的制備

將待測(cè)牛乳樣品恢復(fù)至室溫，加入一定比例的水稀釋。其中將原料乳用水稀釋40 倍，鮮牛乳稀釋20 倍，高溫滅菌乳和超高溫滅菌乳不稀釋。

1.3.8 牛乳中乳過氧化物酶活力的測(cè)定

取2 mL 2 mmol/L ABTS溶液至塑料比色皿中，蓋上蓋子，置于25 ℃水浴鍋中，添加50 μL稀釋后的牛乳樣品，立即蓋上比色皿并混合，快速放入已經(jīng)預(yù)熱至25 ℃的分光光度計(jì)中，15 s內(nèi)測(cè)定420 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A1），2 min后再次記錄吸光度（A2）。牛乳中乳過氧化物酶活力按式（1）計(jì)算。

式中：V1為總待測(cè)體積（2.05 mL）；V2為牛乳樣品體積（0.05 mL）；ε為摩爾吸光系數(shù)（ε=43.2 L/（mol·cm））； d為比色皿的路徑長(zhǎng)度（1.0 cm）；n為稀釋倍數(shù)；1 000為換算系數(shù)；2為化學(xué)計(jì)量系數(shù)。

1.3.9 牛乳中乳過氧化物酶活性損失率計(jì)算

牛乳中乳過氧化物酶活性損失率按式（2）計(jì)算。

式中：a1為生乳中乳過氧化物酶活力/（U/L）； a2為經(jīng)過不同工藝處理后樣品中乳過氧化物酶活力/（U/L）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同殺菌工藝牛乳中乳過氧化物酶活性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，原料乳經(jīng)85 ℃或125 ℃加熱15 s后幾乎檢測(cè)不到乳過氧化物酶活性，而經(jīng)75 ℃加熱15 s以及低溫陶瓷膜過濾處理后的牛乳均能檢測(cè)出較強(qiáng)的乳過氧化物酶活性。

由圖1可知，經(jīng)低溫陶瓷膜過濾處理的牛乳乳過氧化物酶活性損失率明顯小于經(jīng)75 ℃、15 s巴氏殺菌處理的牛乳，能保留更多的熱敏感性物質(zhì)。

2.2 經(jīng)濃縮或脫脂工藝后牛乳中乳過氧化物酶活性

由圖2可知，直接進(jìn)行75 ℃、15 s巴氏殺菌后的全脂牛乳中乳過氧化物酶活性損失率集中在61%～65%，原料乳經(jīng)降膜濃縮再進(jìn)行75 ℃、15 s巴氏殺菌后的濃縮牛乳的乳過氧化物酶活性損失率集中在61%～65%和66%～70%，原料乳經(jīng)部分脫脂或全部脫脂再進(jìn)行75 ℃、15 s巴氏殺菌后的減脂牛乳的乳過氧化物酶活性損失率更多集中在71%～75%，可能過多的工藝流程會(huì)增加牛乳中乳過氧化物酶的損失。另外，零脂牛乳的乳過氧化物酶活性損失率在71%～75%的樣品數(shù)更多，這可能是由于乳脂離心過程中有部分乳過氧化物酶處于脂肪層，表明同樣的熱處理?xiàng)l件下，隨著工藝步驟增多，乳過氧化物酶的活性會(huì)有所降低。

圖2 經(jīng)濃縮或脫脂工藝處理后牛乳中乳過氧化物酶活性損失率變化Fig. 2 Change of lactoperoxidase activity in milk after concentration or defatting

2.3 貯藏溫度和時(shí)間對(duì)牛乳中乳過氧化物酶活性的影響

經(jīng)過對(duì)樣品的氣味和外觀觀察發(fā)現(xiàn)：巴氏殺菌乳5 ℃條件下貯藏10 d未出現(xiàn)明顯的氣味和性狀改變；20 ℃條件下貯藏5 d時(shí)有輕微異味，未發(fā)現(xiàn)明顯結(jié)塊；30 ℃條件下貯藏5 d時(shí)有輕微異味和少量結(jié)塊。原料乳在5 ℃條件下貯藏10 d時(shí)出現(xiàn)輕微異味，部分結(jié)塊；20 ℃條件下貯藏3 d時(shí)就出現(xiàn)了輕微異味，同時(shí)有白色絮狀懸浮物，貯藏5 d時(shí)，則有較強(qiáng)烈的異味同時(shí)結(jié)塊變多，甚至有凝固現(xiàn)象；30 ℃條件下貯藏2 d時(shí)就出現(xiàn)了輕微異味同時(shí)伴有少量結(jié)塊。

圖4 貯藏溫度和時(shí)間對(duì)巴氏殺菌乳中乳過氧化物酶活力的影響Fig. 4 Effect of storage temperature and time on the activity of lactoperoxidase in pasteurized milk

由圖3～4可知，牛乳在不同貯藏溫度下，乳過氧化物酶活力變化較大，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，乳過氧化物酶活力逐漸降低，牛乳中的微生物逐漸繁殖直至牛乳發(fā)生變質(zhì)，無法食用。由于原料乳本身含有較多的微生物，因此在相同貯藏溫度下更容易變質(zhì)，同時(shí)乳過氧化物酶活力降低也更快。因此，乳過氧化物酶的活性也能間接反映牛乳中微生物的生長(zhǎng)狀況。原料乳和巴氏殺菌乳乳過氧化物酶活力在貯藏24 h內(nèi)都出現(xiàn)了下降后上升的現(xiàn)象，這與Fonteh等[18]的研究結(jié)果一致，但具體的原因尚未明確，可能與乳過氧化物酶同工酶的存在有關(guān)系。

圖3 貯藏溫度和時(shí)間對(duì)原料乳中乳過氧化物酶活力的影響Fig. 3 Effect of storage temperature and time on the activity of lactoperoxidase in raw milk

3 結(jié) 論

近年來，隨著我國現(xiàn)代物流業(yè)的迅速發(fā)展及冷鏈的逐漸完善，人們的生活水平與消費(fèi)水平也在不斷提高，從最初追求牛乳的香濃與口味再到現(xiàn)在逐漸回歸牛乳的自然屬性而更加傾向于選擇風(fēng)味新鮮和奶味純正的巴氏殺菌乳。巴氏殺菌乳是采用低溫巴氏殺菌法加工而成的產(chǎn)品，既能夠達(dá)到安全的飲用標(biāo)準(zhǔn)，又能較好保留原料乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng)味，從而廣受消費(fèi)者的喜愛[19-21]。

通過研究不同工藝下乳過氧化物酶的活性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)85 ℃或125 ℃加熱15 s后的牛乳幾乎檢測(cè)不到乳過氧化物酶活性，而經(jīng)75 ℃加熱15 s以及低溫陶瓷膜過濾處理后的牛乳均能檢測(cè)出較強(qiáng)的乳過氧化物酶活性，經(jīng)低溫陶瓷膜過濾處理后的牛乳中乳過氧化物酶活性損失率更低。原料乳經(jīng)部分脫脂或全部脫脂再進(jìn)行75 ℃、15 s巴氏殺菌后樣品中的乳過氧化物酶活性損失率比未經(jīng)過脫脂的樣品更高；經(jīng)巴氏殺菌處理后的牛乳中乳過氧化物酶活性在低溫貯藏條件下更易保留。

本研究通過測(cè)定不同工藝及不同貯藏條件下牛乳中乳過氧化物酶活性變化，為巴氏殺菌乳的品質(zhì)提升提供一定的參考，從而為消費(fèi)者帶來更好的產(chǎn)品。