李敏英 黃歡 李倩 駱明芬 王曉悅 劉紅芳 曾維英 席麗艷,2

(1.南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，實驗研究中心，廣州 510091；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院皮膚科，廣州 510120)

關(guān)于Fonsecaea黑化的報道顯示，病原體能夠產(chǎn)生分泌型的，以及與細(xì)胞壁相關(guān)的黑色素樣組分[1-3]。這些黑色素是免疫激活劑，參與宿主免疫細(xì)胞的相互作用[4-5]，而且對抗真菌藥物敏感性的影響并不一致[6-8]。Fonsecaeamonophora是近年發(fā)現(xiàn)的新種[9]，是我國南方地區(qū)著色芽生菌病(chromoblastomycosis, CBM)的主要致病菌[10-11]。真菌黑素的主要合成途徑是1，8-二羥基萘(DHN)途徑和二羥苯基丙氨酸(DOPA)途徑，著色霉菌屬主要合成DHN-黑素[12-13]，而聚酮合酶PKS1(polyketide synthases，PKS1)調(diào)控DHN-黑素合成起始，常被作為靶點來獲得黑素缺陷株。因此，敲除F.monophora聚酮合酶PKS1，研究其對各種環(huán)境因素的抵抗力、毒力，對于闡明黑化過程中所涉及的生理過程和疾病的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。

本研究旨在利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對F.monophora進(jìn)行基因編輯，但由于原有的pFC334質(zhì)粒上的篩選基因是鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶基因(argB)，是營養(yǎng)缺陷型篩選，需先獲得argB營養(yǎng)缺陷型菌株，后把進(jìn)行argB基因載體轉(zhuǎn)化，才能在基本培養(yǎng)基中篩選到陽性轉(zhuǎn)化子，實驗過程繁瑣，并且原有g(shù)RNA骨架上缺乏酶切位點，而pFC332質(zhì)粒上無gRNA骨架，所以在原有的兩個載體上進(jìn)行改造，簡化了實驗過程，構(gòu)建PKS1基因的CRISPR-Cas9敲除載體，以期利用原生質(zhì)體法獲得PKS1基因缺陷株，為研究F.monophoraPKS1基因的功能及DHN-黑素的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

pFC334質(zhì)粒和pFC332質(zhì)粒從上?？吕咨锟萍加邢薰举彽谩Ｇ心z回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京天根生化科技有限公司)。Primes TAR?Max DNA Polymerase，DNA Marker, In-Fusion HD Cloning Kit(大連寶生物工程有限公司)。PCR儀(美國伯樂BIO-RAD公司)，限制酶內(nèi)切酶MreⅠ，PstⅠ，BglⅡ，T4連接酶(ThermoFisher Scientific公司)。quick ligationTM kit(NEB公司)所有相關(guān)引物如表1所示。所有引物合成(PAGE純化方式)及測序工作由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

設(shè)計gRNA 在我們前期的研究中，通過對F.monophora轉(zhuǎn)錄組的測序，獲得了PKS1基因的cDNA全長序列，然后利用在線設(shè)計網(wǎng)站(http://crispor.tefor.net/)，選擇物種為F.monophora，獲得可用的gRNA，挑選分?jǐn)?shù)較高的四條gRNA插入到Cas9載體中(見表1)。

構(gòu)建PKS1基因的CRISPR-Cas9敲除載體 ①敏感性檢測：將F.monophora于潮霉素B濃度為0、100、200、300、400 μg/mL的PDA抗性平板上劃線，25℃培養(yǎng)1周后，拍照觀察判斷是否抗性適用于篩選陽性轉(zhuǎn)化子。②構(gòu)建含有潮霉素抗性的pFC334-AarⅠ載體：設(shè)計引物在gRNA骨架前插入兩個AarⅠ酶切位點(見表1)，pFC334質(zhì)粒作為模板，分別擴(kuò)增相對應(yīng)的兩個片段(1號和2號片段)，PCR條件：98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 1 kb/min，30 cycles。切膠回收純化后融合成一個片段(片段1)，利用Touchdown PCR進(jìn)行融合，PCR條件：98℃ 10 s，65～55℃(每個cycles降1℃) 10 s，72℃ 1 kb/min，10cycles，98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 1 kb/min，20cycles。用MreⅠ和PstⅠ對pFC334質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，37℃孵育4～6 h，回收后，使用Takara In-Fusion HD Cloning Kit連接融合片段1和pFC334線性化載體后，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，涂平板后，37℃過夜培養(yǎng)，次日挑取單菌落送擎科公司測序。將測序成功的重組質(zhì)粒命名為pFC334-AarⅠ。③構(gòu)建pFC332-gRNA-AarⅠ載體：用限制性內(nèi)切酶MreⅠ和BglⅡ?qū)FC332質(zhì)粒和pFC334-AarⅠ質(zhì)粒進(jìn)行酶切，獲得線性化的pFC332載體和已經(jīng)插入AarⅠ酶切位點的gRNA骨架片段，對兩者進(jìn)行膠回收純化后，用T4連接酶把片段連到pFC332載體上，轉(zhuǎn)化及涂平板后，37℃過夜培養(yǎng)。次日挑取上述平板中的單菌落，做菌落PCR鑒定，驗證載體是否構(gòu)建成功。pFC332質(zhì)粒和pFC332-gRNA-AarⅠ質(zhì)粒圖譜(質(zhì)粒改造前后圖譜)(見圖1、2)。④連接gRNA：用AarⅠ對pFC334-HygR質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，把設(shè)計好和退火后的gRNA連到載體上。

表1 所用引物Tab.1 Specific primers in this study

(續(xù)表)

圖1 pFC332質(zhì)粒圖譜 圖2 pFC332-gRNA-AarⅠ質(zhì)粒圖譜(被改造后的插入片段指示在紅色框內(nèi))Fig.1 Profile of pFC332 plasmid Fig.2 Profile of pFC332-gRNA-AarⅠ plasmid (The modified insert was indicated in the red box)

2 結(jié) 果

敏感性檢測確證潮霉素可用于F.monophora抗性篩選 在PDA加入不同濃度的潮霉素檢測菌體的敏感性，結(jié)果如圖3顯示該菌對潮霉素敏感，在含有潮霉素的培養(yǎng)基中不能生長，可用潮霉素于F.monophora基因敲除操作中的抗性篩選。

利用高保真酶擴(kuò)增所需片段 以pFC334質(zhì)粒(17327 bp)作為模板，使用AarⅠ-gRNA和PstI amplify引物(見表1)，利用高保真酶分別擴(kuò)增相對應(yīng)的1號(1.5 kb左右)和2號片段(3.5 kb左右)，結(jié)果圖4中的均為目的片段，條帶均單一，可用于下一步膠回收后融合片段。

利用高保真酶獲得所需的融合片段 把上一步擴(kuò)增獲得的片段進(jìn)行融合，1號和2號片段融合成片段1，電泳后，結(jié)果圖5中紅色框內(nèi)的為目的片段(5 kb左右)，切膠回收后用于下一步的實驗。

獲得pFC334-AarI載體 使用PstⅠ和MerⅠ酶對pFC334載體進(jìn)行酶切，跑膠鑒定，結(jié)果如圖6所示，從而結(jié)果可以得出載體已線性化，切膠回收線性化載體后，連接片段1后測序結(jié)果顯示已獲得序列正確的pFC334-AarⅠ載體。

獲得pFC332-gRNA-AarⅠ載體 對pFC334-AarⅠ進(jìn)行雙酶切后，獲得目的片段(2 kb左右)，并使用同樣的酶線性化pFC332載體后，跑膠鑒定，結(jié)果如圖7所示，連接后挑選單菌落，菌落PCR鑒定結(jié)果如圖8所示。選取陽性單菌落測序，獲得測序成功的重組質(zhì)粒，命名為pFC332-gRNA-AarⅠ。

連接靶點和載體 使用NEB的quick ligationTMkit連接退貨后的靶點與使用AarⅠ酶線性化的pFC332-gRNA-AarⅠ載體(結(jié)果如圖9所示)，挑取單菌落測序，并已測序成功，獲得連接各靶點的載體(pFC332-PKS1-T1,2,3,4) 。

圖3 F. monophora潮霉素B抗性檢測. A. PDA培養(yǎng)基；B. 含100 μg/mL潮霉素B的PDA培養(yǎng)基; C. 含200 μg/mL潮霉素B的PDA培養(yǎng)基; D. 含300 μg/mL潮霉素B的PDA培養(yǎng)基; E. 含400 μg/mL潮霉素B的PDA培養(yǎng)基 圖4 擴(kuò)增獲得的1號和2號片段. A. M:15 kb DNA Marker,1-8:1號擴(kuò)增片段(1.5 kb左右)，9:陰性對照(不加模板)；B. M:15 kb DNA Marker,1:陰性對照(不加模板)，2-6:2號擴(kuò)增片段(3.5 kb左右) 圖5 融合后的片段1. M:15 kb DNA Marker, 1:陰性對照(不加模板)；2:目的片段(紅框內(nèi))圖6 pFC334載體雙酶切. M:15 kb DNA Marker, 1: pFC334載體雙酶切前；2: pFC334載體雙酶切后 圖7 pFC332和pFC334-AarⅠ載體雙酶切. M:15 kb DNA Marker, 1: pFC332載體雙酶切后；2: pFC334-AarⅠ載體雙酶切后 圖8 pFC332-gRNA-AarⅠ陽性菌落鑒定. M:15 kb DNA Marker, 1:陰性對照(不加模板)；2: pFC332；2-12:挑取的單菌落 圖9 pFC332-gRNA-AarⅠ載體單酶切. M:15 kb DNA Marker, 1:陰性對照；2: pFC332-gRNA-AarⅠ載體單酶切后Fig.3 Detection of hygromycin B resistance of F. monophora. A. PDA medium; B. PDA medium containing hygromycin B (100 μg/mL); C. PDA medium containing hygromycin B (200 μg/mL); D. PDA medium containing hygromycin B (300 μg/mL); E. PDA medium containing hygromycin B (400 μg/mL) Fig.4 Fragment 1and 2 obtained by amplification. A. M: 15 kb DNA Marker, 1-8: Amplified fragment 1 (about 1.5 kb), 9: Negative control (without template); B. M: 15 kb DNA Marker, 1: Negative control (without template), 2-6: Amplified fragment 2 (about 3.5kb) Fig.5 Fragment 1 after ligation. M: 15 kb DNA Marker, 1: Negative control (without template); 2: Target fragment (in red box) Fig.6 Double enzyme digestion of pFC334 vector. M: 15 kb DNA Marker, 1: pFC334 vector before double enzyme digestion; 2: pFC334 vector after double enzyme digestion Fig.7 Double enzyme digestion of pFC332 vector and pFC334-AarⅠ vector. M: 15 kb DNA Marker, 1: pFC332 vector after double enzyme digestion; 2: pFC334-AarⅠ vector after with double enzyme digestion Fig.8 Identification of PFC332-gRNA-AarⅠ positive colonies. M: 15 kb DNA Marker, 1: negative control (without template); 2: pFC332; 2-12: Single colonies selected Fig.9 Single enzyme digestion of pFC332-gRNA-AarⅠ vector. M: 15 kb DNA Marker, 1: negative control; 2: pFC332-gRNA-AarⅠ vector after single enzyme digestion

3 討 論

國內(nèi)外已有大量研究證實，黑素在病原體的毒力中發(fā)揮重要作用，比如煙曲霉、皮炎外瓶霉、新生隱球菌等。在煙曲霉等感染中，黑素(同為DHN-黑素)可阻斷TLRs免疫活化，影響巨噬細(xì)胞自噬的激活從而影響病原體清除。本課題組前期將臨床分離株SUMS0505多次傳代獲得白化突變株，對F.monophora色素株和白化株進(jìn)行研究，證實了F.monophora黑素能引起巨噬細(xì)胞TLR-2、TLR-4以及Dectin-1等受體的差異性表達(dá)[14]及Th1/Th2細(xì)胞免疫反應(yīng)失衡[15]，證明F.monophora黑素與毒力相關(guān)，可引起巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)失衡來抗衡殺傷作用。但黑素是如何影響宿主對F.monophora的免疫反應(yīng)，是否與慢性感染的形成有關(guān)，這些相關(guān)機(jī)制尚不十分明確。據(jù)文獻(xiàn)報道F.pedrosoi的黑素可引起Th1/Th2 免疫應(yīng)答失衡，Th1反應(yīng)受限致細(xì)胞免疫功能低下，抑制NO產(chǎn)生，直接減弱了對F.pedrosoi的殺傷能力，而Th2反應(yīng)偏倚，促進(jìn)了肉芽腫和纖維化的形成[16]。其次，黑素本身具有一定的免疫活性，能影響細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)類型[17-18]，與真菌的致病性密切相關(guān)，是非常重要的毒力因子。因此，本研究選擇敲除F.monophora黑色素的生物合成途徑中的PKS1基因，對研究黑素在F.monophora中的作用，以及闡明黑素引起的著色芽生菌病的發(fā)病機(jī)制極為重要。

CRISPR/Cas9技術(shù)僅由兩個元件組成，Cas9核酸酶和由兩個小RNA組成的單導(dǎo)RNA(sgRNA)，即可對特異序列的外源DNA進(jìn)行識別、剪切[19-20]，具有特異性強(qiáng)、效率高、多功能性和易操作性等優(yōu)勢，并且有不少報道在真菌生物中成功實現(xiàn)了對靶基因的定向編輯。Fuller等[21]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對煙曲霉(A.fumigatus)中的基因進(jìn)行敲除，并且證明了Cas9本身不影響菌體的生長發(fā)育和毒力，表明了該系統(tǒng)適用于真菌致病機(jī)理及基因功能的研究。目前在絲狀真菌研究領(lǐng)域中，CRISPR/Cas9技術(shù)已得到廣泛應(yīng)用，如在曲霉屬(Aspergillus)[22]、鏈格孢霉(Alternariaalternata)[23]、里氏木霉(Trichodermareesei)[24]、水稻稻瘟病菌(Pyriculariaoryzae)[25]、玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)[26]等，說明CRISPR/Cas9系統(tǒng)對絲狀真菌基因編輯的可操作性。本研究獲得了具有Cas9基因、潮霉素抗性基因和gRNA骨架的雙元載體pFC332-gRNA-AarⅠ，且成功構(gòu)建了由Cas9介導(dǎo)的PKS1基因敲除載體，為研究F.monophora的PKS1基因及DHN-黑素的功能研究奠定了基礎(chǔ)。