萬紅才，羅洪蓮，劉曉艷，段萍，徐作剛，安軍，曾琦（黔南州檢驗檢測院，貴州 都勻 558000）

留蘭香Mentha spicataL.為唇形科植物，全草入藥，夏、秋兩季采收，除去雜質(zhì)，鮮用或陰干；留蘭香具有疏風清熱、解表和中、里氣止痛之功效；用于感冒頭痛、胃痛、咳嗽、腹脹、吐瀉、痛經(jīng)、肢麻、跌撲腫痛[1]。同時留蘭香被人們作為食品廣泛食用，還應用于食品化工不同行業(yè)，說明留蘭香藥用及食用保健的價值均得到廣泛認同[2]。留蘭香藥材中香芹酮、檸檬烯是活性成分也是主要成分，本文擬建立氣相色譜法對留蘭香藥材及其提取物中香芹酮、檸檬烯進行定量分析，并制訂合理的限度，嚴格控制其質(zhì)量；采用管碟法對留蘭香藥材提取物的抑菌活性進行探索，采用稀釋倍數(shù)法[3]測定留蘭香不同提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌的最低抑菌濃度（MIC），為留蘭香藥用機制及食用領(lǐng)域的拓展開發(fā)提供實驗依據(jù)，為留蘭香藥材的臨床使用劑量提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

氣相色譜儀（Aglient 7890B），紫外分光光度計（島津2600），高壓滅菌鍋（LMQC-80E），超聲波清洗儀（SK250LHC），電子天平（梅特勒托利多AG135，感量：0.01 mg），生化培養(yǎng)箱（SPX-250BⅢ），游標卡尺。

1.2 試藥

香芹酮對照品（批號：c11052000，含量：99.0%）、正十一烷對照品（批號：c17896300，含量：99.6%）（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH），檸檬烯對照品（批號：100470-201302，含量：96.0%）、枯草芽孢桿菌[批號：63501，每顆（1.0～2.0）×103cfu]、金黃色葡萄球菌[批號：33301，每顆（1.0～2.0）×103cfu]、藤黃微球菌[批號：28001-8a6-2，每顆（1.0～2.0）×103cfu]、菌株復溶液（批號：181105）（中國食品藥品檢定研究院）；鏈霉素（批號：130308-201514，含量：726 U·mg－1）、新霉素（批號：130309-201512，含量：652 U·mg－1）、土霉素（批號：130305-201321，含量：872 U·mg－1）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；其他試劑均為化學分析純，無菌室及其他常用微生物測定器皿由藥品檢驗微生物檢測室提供。

1.3 樣品

留蘭香共10批次，經(jīng)貴州省食品藥品檢驗所李揚教授鑒定，均屬于唇形科植物留蘭香[4]，樣品信息見表1。

表1 樣品信息Tab 1 Sample information

2 方法

2.1 香芹酮、檸檬烯含量測定氣相色譜分析[5]

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱HP-5彈性石英毛細管柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm），檢測器氫火焰離子化檢測器（FID），載氣為高純氮氣≥0.9999，柱流量線速度5 mL·min－1；程序升溫條件初始溫度50℃，以2℃·min－1升溫至115℃，以5℃·min－1升溫至150℃，氣化室溫度250℃，檢測室溫度280℃，分流比30∶1，尾吹20 mL，空氣400 mL，氫氣40 mL，進樣量1 μL。在上述色譜條件下，樣品中檸檬烯、內(nèi)標物正十一烷、香芹酮成分的分離度、理論板數(shù)、拖尾因子、對稱性均符合《中國藥典》2020年版要求[6]，空白樣品無干擾（見圖1）。

圖1 混合對照品、供試品及內(nèi)標溶液氣相色譜圖Fig 1 Gas chromatogram of mixed reference substance，test substance and internal standard solution

2.1.2 內(nèi)標溶液的制備 取正十一烷對照品適量，精密稱定，用正己烷稀釋制成0.2 mg·mL－1的溶液作為內(nèi)標溶液[6]。

2.1.3 對照品溶液的制備 取檸檬烯對照品10.44 mg，置于10 mL量瓶中，用內(nèi)標溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為檸檬烯對照品儲備液；另取香芹酮對照品20.36 mg，置于100 mL量瓶中，加檸檬烯對照品儲備液5.00 mL，用內(nèi)標溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液。

2.1.4 留蘭香樣品的制備 留蘭香揮發(fā)油的制備參照《中國藥典》2020年版四部通則2204揮發(fā)油測定法，準確稱量干燥留蘭香藥材100 g，加入300 mL蒸餾水，連接至揮發(fā)油提取裝置，采用常壓水蒸氣蒸餾法提取，得到淡黃色有特殊香味的油狀物作為供試品揮發(fā)油[6]；稱取經(jīng)粉碎的留蘭香藥材50 g，加乙醇400 mL，水浴加熱回流提取1 h，濾過，重復提取2次，合并提取液，蒸干得供試品醇提浸膏；稱取經(jīng)粉碎的留蘭香藥材50 g，加水400 mL，熱回流提取1 h，濾過，重復提取2次，合并提取液，蒸干得供試品水提浸膏。精密稱取供試品揮發(fā)油、供試品醇提取浸膏、供試品水提取浸膏約0.5 g和干燥藥材粉末約1.3 g，精密稱定，分別置于50 mL量瓶中，加入適量內(nèi)標溶液超聲使溶解，放冷，用內(nèi)標溶液稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得各供試品溶液。

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密稱取20.40 mg香芹酮對照品與10.23 mg檸檬烯對照品置10 mL量瓶中，用內(nèi)標溶液溶解并稀釋至刻度，作為混合對照溶液；分別精密量取混合對照溶液1.00 mL置于10、25、50、100、200 mL量瓶中，用內(nèi)標溶液稀釋至刻度，搖勻，得香芹酮0.204、0.0816、0.0408、0.0204、0.0102 mg·mL－1和檸檬烯0.1023、0.0409、0.0205、0.0102、0.0051 mg·mL－1的混合對照品溶液。取上述混合對照品溶液及“2.1.3”項下混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，用內(nèi)標法校正，分別以香芹酮、檸檬烯對照品溶液峰面積與內(nèi)標溶液峰面積的校正值f（f＝A樣/A內(nèi)）為縱坐標（Y），以香芹酮、檸檬烯對照品質(zhì)量濃度C（mg·mL－1）為橫坐標（X）分別繪制標準曲線，并進行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.1.6 精密度試驗 取同一對照品溶液重復進樣6次，結(jié)果f（f＝A樣/A內(nèi)）統(tǒng)計值符合《中國藥典》2020年版四部通則9101藥品質(zhì)量標準分析方法驗證指導原則精密度要求[6]（RSD≤2.0%），見表2。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 分別于0、4、8、12、16、20 h精密吸取編號201701留蘭香藥材揮發(fā)油樣品，按“2.1.4”項下方法制備供試品，按“2.1.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見表2，說明各成分在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復性試驗 精密稱取編號201701留蘭香藥材提取揮發(fā)油樣品6份，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，取供試品溶液及“2.1.3”項下對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，按內(nèi)標法以峰面積計算，結(jié)果見表2。

表2 香芹酮、檸檬烯方法學考察(n＝6)Tab 2 Methodology for determination of carvone and limonene (n＝6)

2.1.9 回收試驗 稱取編號201701原藥材粉末約0.25 g，置10 mL量瓶中，精密量取混合對照品溶液（取檸檬烯、香芹酮對照品適量，加內(nèi)標溶液制成每毫升含檸檬烯0.001 947 mg、香芹酮0.045 58 mg的混合對照品溶液）1.00、2.00、3.00 mL制成低、中、高質(zhì)量濃度供試品溶液（各平行3份），分別用含內(nèi)標物的正己烷溶解超聲30 min，冷卻后稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品，按“2.1.1”項下方法測定，計算得香芹酮低、中、高質(zhì)量濃度的平均回收率在96.2%～97.5%，檸檬烯低、中、高質(zhì)量濃度的平均回收率在95.9%～99.8%，RSD均小于3%，符合2020年版《中國藥典》要求。

2.1.10 香芹酮、檸檬烯含量測定結(jié)果 取采集的10個批次留蘭香樣品，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取“2.1.3”項下對照品溶液和上述供試品溶液1 μL進樣測定，記錄色譜圖，按內(nèi)標法以峰面積計算，結(jié)果見表3。

表3 留蘭香不同提取方法香芹酮、檸檬烯含量測定(mg·g－1)Tab 3 Determination of carvone and limonene content with different extraction methods of Mentha spicata extract (mg·g－1)

2.2 留蘭香藥材抑菌活性測定

2.2.1 供試菌懸液制備 取枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌分別加菌株復溶液復活，再加2%的蛋白胨稀釋液稀釋含菌量為106～109 cfu·mL－1的菌懸液作為供試菌懸液[7]。

2.2.2 培養(yǎng)皿制備 取經(jīng)高壓蒸汽滅菌冷卻至45℃的瓊脂培養(yǎng)基15 mL至無菌培養(yǎng)皿中，加供試菌懸液0.05 mL制成各菌種培養(yǎng)皿，每組平行制備3個。

2.2.3 標準品溶液的制備 精密稱取鏈霉素、新霉素、土霉素標準品適量，分別加滅菌水稀釋至約0.002、0.02、0.02 mg·mL－1的標準溶液[6]。

2.2.4 供試品溶液的制備 取“2.1.4”項下201701樣品制備的供試品揮發(fā)油0.5 g，加滅菌水稀釋至1.0 mg·mL－1的溶液，供試品醇提浸膏1.0 g加滅菌水稀釋至10.0 mg·mL－1、供試品水提浸膏1.0 g加滅菌水稀釋至10.0 mg·mL－1的溶液。

2.2.5 方法 參照《中國藥典》2020年版四部通則1201抗生素微生物檢定法管碟法測定。取各供試品溶液至枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌培養(yǎng)皿中，每皿4碟，皿中1、3接種供試品溶液，2、4接種標準溶液，于37℃恒溫箱培養(yǎng)16 h，測定抑菌圈直徑[6]，結(jié)果見表4。

表4 供試品及標準溶液抑菌圈直徑(mm)Tab 4 Antibacterial circle diameter of test product and standard solution (mm)

2.3 最低抑菌濃度測定

用稀釋倍數(shù)法測定最低抑菌濃度，取“2.1.4”項下201701樣品提取的供試品揮發(fā)油0.5 g、醇提浸膏1.0 g及水提浸膏1.0 g，分別加滅菌的2%蛋白胨滅菌稀釋液稀釋至50 mL為供試品揮發(fā)油溶液、供試品醇提浸膏溶液、供試品水提浸膏溶液，分別用微孔濾膜濾過裝入無菌試管中備用。取試管38支，每支裝9 mL胰酪蛋白培養(yǎng)基溶液，加壓滅菌后，冷卻備用，用滅菌的2%蛋白胨為稀釋液，制備供試品揮發(fā)油質(zhì)量濃度分別約為5、0.5、0.05 mg·mL－1和供試品醇提浸膏、供試品水提浸膏質(zhì)量濃度分別約為10、1.0、0.01 mg·mL－1的溶液，同法制備0.01 mg·mL－1的羅紅霉素對照品溶液，制備陽性對照管（加對照品溶液）與空白管。分別接種各實驗菌液0.05 mL，于37℃恒溫箱培養(yǎng)18 h后，取出，加5%的甲醛溶液抑制細菌再生長，在600 nm波長處測定吸光度[8]，結(jié)果見表5。

表5 培養(yǎng)管吸光度值表Tab 5 Absorbance of culture tubes

3 結(jié)果

3.1 香芹酮、檸檬烯氣相分析結(jié)果

各樣品中香芹酮、檸檬烯含量相對穩(wěn)定，原藥材中香芹酮達到0.38%以上、檸檬烯0.02%；揮發(fā)油中含量較高，香芹酮達到58.1%、檸檬烯2.7%；醇提浸膏以干燥浸膏計香芹酮18.5%、檸檬烯0.9%；水提浸膏以干燥浸膏計香芹酮12.2%、檸檬烯0.6%；該方法適用于留蘭香藥材各形態(tài)樣品中香芹酮、檸檬烯測定。

3.2 抑菌活性與最低抑菌濃度分析結(jié)果

參照2020年版《中國藥典》抗生素效價測定法及中藥生物活性測定指導原則，對留蘭香藥材提取物進行抑菌活性實驗，從表4中數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，該樣品在不同菌株培養(yǎng)皿中均產(chǎn)生一定的抑菌效果，各抑菌圈直徑與標準溶液一致；其中藤黃微球菌培養(yǎng)基靈敏度高，可作為該藥材抑菌效價研究首選，同時對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑菌活性，說明留蘭香藥材有廣譜抑菌作用，可為臨床用藥提供依據(jù)。用稀釋倍數(shù)法測定最低抑菌濃度，根據(jù)培養(yǎng)后觀察菌群生長濁度及表5測定吸光度值（A）分析，留蘭香藥材各組供試品溶液的濁度及吸光度均不同，根據(jù)菌群生長濁度觀察及吸光度數(shù)據(jù)分析，將A≤0.30定為有抑菌作用的樣品濃度，得到供試品揮發(fā)油的MIC為0.05 mg·mL－1，供試品醇提浸膏和水提浸膏的MIC均為0.1 mg·mL－1。

4 討論

4.1 色譜條件與樣品處理的優(yōu)化

根據(jù)文獻對測定留蘭香樣品中香芹酮、檸檬烯成分的氣相色譜條件進行優(yōu)化，采用超聲提取法作為樣品前處理方法，耗時短（耗時30 min），操作簡便；比較甲醇、乙醇、乙酸乙酯、正己烷等提取溶劑，從色譜圖的干擾背景及待測成分回收率結(jié)果分析，選擇用正己烷為提取溶劑效果最佳；內(nèi)標法是減少氣相色譜進樣誤差，選正十一烷作內(nèi)標物，保留時間在被測物香芹酮、檸檬烯之間，并與兩成分的分離度符合2020年版《中國藥典》要求，并將內(nèi)標物配制成0.2 mg·mL－1的溶液作為內(nèi)標溶液，該濃度時色譜峰與待測組分一致，用內(nèi)標溶液作溶劑，確保對照品與供試品溶液制備過程中內(nèi)標物含量的穩(wěn)定，減少分次加入內(nèi)標物的濃度變化誤差[9]。該分析方法系統(tǒng)適用性試驗中，檸檬烯、內(nèi)標物正十一烷、香芹酮成分的分離度、理論板數(shù)、拖尾因子、對稱性均等參數(shù)均符合2020年版《中國藥典》要求，優(yōu)化的分析方法靈敏度高，易普及，可為留蘭香藥材及成品的質(zhì)量控制提供參考。

4.2 抑菌活性與抑菌濃度研究意義

根據(jù)抑菌圈測定數(shù)據(jù)及最低抑菌濃度分析，留蘭香藥材對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌都有一定的抑制作用，結(jié)合氣相色譜分析數(shù)據(jù)，提取方法不同各供試品溶液中香芹酮、檸檬烯成分含量不同，但提取方法與抑菌活性無顯著關(guān)系，進一步證明單一的分析方法控制藥材質(zhì)量存在缺陷，用中藥生物活性測定方法綜合評價藥材質(zhì)量具有科學性。