彭琳，艾俊濤*，廖彬，劉雁鳴（. 湖南省醫(yī)療器械檢驗檢測所，長沙 4004；. 湖南省藥品檢驗研究院，長沙400）

磺芐西林鈉（sulbenicillin sodium）為半合成廣譜青霉素類抗菌藥物，應(yīng)用于銅綠假單胞菌、腸桿菌屬、變形菌和其他敏感菌所致的系統(tǒng)感染[1-3]；1972年由日本武田藥品公司研究所研發(fā)，20世紀(jì)80年代在我國開始使用；《中國藥典》于1990年版起收錄本品。現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2020年版二部[4]。標(biāo)準(zhǔn)中采用HPLC自身對照法測定有關(guān)物質(zhì)，要求單個雜質(zhì)峰面積不得大于對照溶液主峰與相對保留時間0.9處的色譜峰面積和的2倍（2.0%），各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰相對保留時間0.9處的色譜峰面積和的4倍（4.0%），供試品溶液色譜圖中小于對照溶液主峰與相對保留時間0.9處的色譜峰面積和的0.05倍的峰忽略不計。標(biāo)準(zhǔn)中未規(guī)定雜質(zhì)的具體種類。分析磺芐西林鈉的合成路線（見圖1）[5-7]，其采用的主要原料有：6-氨基青霉烷酸（6-APA）、磺苯乙酰氯，合成工藝見圖1。本研究對合成工藝過程中可能引入的多種特定雜質(zhì)進(jìn)行方法學(xué)驗證及定量研究，以用于本品質(zhì)量控制和工藝穩(wěn)定性考察。

圖1 磺芐西林鈉合成工藝路線圖Fig 1 Synthesis route of sulbenicillin sodium

1 儀器與試藥

LC-30A島津高效液相色譜儀，SPD-M20A二極管陣列檢測器（島津公司），Labsolution色譜數(shù)據(jù)工作站（島津公司），NewClassic電子天平（Mettler toledo公司，精度：0.1 mg）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），甲醇（色譜純，TEDIA公司）。對照品信息見表1。自制樣品[編號1、2、3，含量：每1 mg的效價為1140磺芐西林單位（抗生素微生物檢定法）]，對照樣品[編號4，來源：某制藥企業(yè)已上市產(chǎn)品，含量：每1 mg的效價為1140磺芐西林單位（抗生素微生物檢定法）]。

表1 對照品信息Tab 1 Reference information

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 取樣品，精密稱定，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL中約含0.2 mg的溶液。

2.1.2 對照溶液 精密量取上述供試品溶液1 mL，置50 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 混合對照品儲備液 分別取6-APA、磺苯乙酰氯及左旋磺苯乙酸適量，加流動相溶解并定量稀釋制成每1 mL含以上雜質(zhì)約為10 μg的混合對照品儲備液。

2.1.4 線性溶液 分別精密量取“2.1.3”項下混合對照品儲備液適量，加流動相定量稀釋，配成系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，作為線性測定溶液。

2.1.5 破壞試驗用溶液

①酸破壞：取樣品（編號1）10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加0.05 mol·L－1鹽酸溶液1.5 mL溶解，放置0.5 h，用0.05 mol·L－1氫氧化鈉溶液中和，用流動相稀釋至刻度，作為酸破壞供試品溶液。

②堿破壞：取樣品（編號1）10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加0.1 mol·L－1氫氧化鈉溶液1.5 mL溶解，放置2 min，用0.1 mol·L－1鹽酸溶液中和，用流動相稀釋至刻度，作為堿破壞供試品溶液。

③氧化破壞：取樣品（編號1）10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相5 mL溶解后，加30%過氧化氫溶液2滴，放置0.5 h，用流動相稀釋至刻度，作為氧化破壞供試品溶液。

④熱破壞：取在120℃烤箱中加熱3 h后冷卻至室溫的樣品（編號1），用流動相溶解并稀釋至刻度，作為熱破壞供試品溶液。

⑤光破壞：取樣品（編號1），在光強(qiáng)度4500 Lx下照射 48 h后，稀釋劑稀釋至刻度，作為光破壞供試品溶液。

2.2 色譜方法

磺芐西林鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2020年版二部及JP17，某制藥公司生產(chǎn)的本品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)YBH06232010。各標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)物質(zhì)方法存在以下差別，見表2。

表2 各質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)方法比較Tab 2 Related substance in different standards

本次自制產(chǎn)品為技術(shù)轉(zhuǎn)化，合成工藝完全與該制藥公司合成工藝一致，未作修改，故按照YBH06232010標(biāo)準(zhǔn)方法對有關(guān)物質(zhì)方法進(jìn)行驗證：色譜柱為Acclaim 120 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：20 μL；流動相：0.02 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液-甲醇（80∶20）。

2.3 專屬性試驗

精密量取流動相20 μL，進(jìn)樣測定，結(jié)果溶劑空白僅在2 min左右出現(xiàn)溶劑峰，但在主峰與雜質(zhì)峰位置處不顯示色譜峰，結(jié)果表明空白溶劑不干擾有關(guān)物質(zhì)測定，見圖2A。

2.4 破壞試驗

按照“2.2”項下色譜條件，分別測定“2.1.5”項下的不同酸、堿、氧化、熱與光破壞條件下制備的各種相應(yīng)供試品溶液，結(jié)果分別與未經(jīng)破壞的樣品進(jìn)行比較，分析雜質(zhì)譜的變化情況，結(jié)果見圖2，樣品雜質(zhì)情況見表3。

表3 破壞試驗雜質(zhì)譜Tab 3 Impurity profiling of destruction test

圖2 專屬性實驗色譜圖Fig 2 Chromatograms of specificity test

結(jié)果，①酸破壞：經(jīng)酸破壞0.5 h出現(xiàn)多個未知的明顯的雜質(zhì)，主峰下降11.1%。②堿破壞：經(jīng)堿破壞2 min即出現(xiàn)多個未知的明顯的雜質(zhì)，主峰下降39.7%；破壞1.5 h主成分已被完全破壞。③氧化破壞：樣品對氧化劑不穩(wěn)定，經(jīng)氧化破壞0.5 h出現(xiàn)多個未知的明顯的雜質(zhì)，主峰下降50.2%。④熱破壞和光破壞使樣品的總雜質(zhì)略為增加。在該色譜條件下，樣品經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光降解所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均能與主峰完全分離，該系統(tǒng)適合檢測本品有關(guān)物質(zhì)。同時說明樣品具備一定的熱和光穩(wěn)定性，但在酸、堿、氧化條件下均不穩(wěn)定。

2.5 雜質(zhì)線性關(guān)系考察

按“2.1”項下的制備方法和“2.2”項下色譜條件，分別測定6-APA、左旋磺苯乙酸及磺苯乙酰氯的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，記錄色譜圖，以質(zhì)量濃度為x軸，峰面積為y軸，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果6-APA回歸方程為：y＝7688.3x－208.87，r＝1.000；左旋磺苯乙酸回歸方程為：y＝4118.9x＋448.33，r＝0.9998；磺苯乙酰氯回歸方程為：y＝1892.6x＋673.78，r＝0.9991。結(jié) 果6-APA在1.113～11.130 μg·mL－1、左旋磺苯乙酸在1.217～12.170 μg·mL－1與峰面積呈良好的線性關(guān)系；磺苯乙酰氯在1.284～12.840μg·mL－1與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 檢測限與定量限

取各雜質(zhì)線性最低點(diǎn)，對其色譜圖中數(shù)據(jù)計算方法檢測限與定量限，結(jié)果6-APA、左旋磺苯乙酸、磺苯乙酰氯的檢測限分別為0.009、0.014、0.035 μg，定量限分別為0.029、0.046、0.116 μg。

2.7 回收試驗

取樣品（編號1）約20 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，共9份，加流動相溶解并稀釋至刻度，各分別取1 mL置10 mL量瓶中，分別精密加入混合對照品儲備液4.8、4.0、3.2 mL，各3份，加流動相稀釋并定容至刻度，作為回收供試品溶液，測定并計算回收率。結(jié)果6-APA高、中、低濃度的平均回收率分別為94.5%、93.1%、94.3%，RSD分別為0.82%、0.63%、0.83%（n＝3）；左旋磺苯乙酸高、中、低濃度的平均回收率分別為101.4%、102.4%、102.2%，RSD分別為0.42%、0.84%、1.1%（n＝3）；磺苯乙酰氯高、中、低濃度的平均回收率為102.2%、101.9%、103.4%，RSD分別為1.1%、1.2%、1.8%（n＝3），說明本法準(zhǔn)確可行。

2.8 穩(wěn)定性考察

按照“2.2”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、16、24 h測定同一供試品溶液，以雜質(zhì)含量為考察指標(biāo)，結(jié)果最大單雜及總雜質(zhì)分別在0.41%～0.46%、0.89%～1.01%，相應(yīng)的RSD分別為5.3%、5.1%，說明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

按照 “2.2”項下色譜條件，連續(xù)測定6份供試品溶液及對照品溶液，以雜質(zhì)含量為考察指標(biāo)，結(jié)果最大單雜及總雜質(zhì)的平均含量分別為0.43%、0.89%，RSD分別為3.8%、2.0%，說明方法重復(fù)性結(jié)果好。

2.10 耐用性試驗

取樣品（編號1），按“2.1”項下方法制備，分別考察流動相比例變化20%、檢測波長變化±5 nm、柱溫變化±5℃、流速變化20%及不同品牌的色譜柱，結(jié)果見表4。以上結(jié)果表明變換波長、柱溫、流速、流動相比例及色譜柱，測試結(jié)果變化均在很小的范圍內(nèi)，說明上述5種條件的微小變化對測試結(jié)果無影響。

表4 耐用性試驗結(jié)果Tab 4 Different condition

2.11 樣品測定

按“2.1”項下的制備方法和“2.2”項下色譜條件，測定自制3批樣品及1批對照樣品，列表比較自制樣品與對照樣品雜質(zhì)檢出情況，結(jié)果見表5。自制樣品雜質(zhì)譜與對照樣品的雜質(zhì)譜略有差別，對照樣品雜質(zhì)峰的數(shù)量比自制樣品多1個，自制樣品最大單雜及總雜質(zhì)的量與對照樣品相當(dāng)。

表5 雜質(zhì)譜對比Tab 5 Impurity profile

3 討論

3.1 色譜方法的選擇

磺芐西林鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2020年版二部及JP17，各質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)物質(zhì)方法比較見表2。本研究按照某制藥公司批準(zhǔn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)YBH06232010的有關(guān)物質(zhì)測定方法，該方法在流動相的組成、檢測波長、色譜圖記錄時長、限度要求等方面與藥典標(biāo)準(zhǔn)略有差異。因本次自制產(chǎn)品為技術(shù)轉(zhuǎn)化，合成工藝與該制藥公司一致，未作修改，故按照YBH06232010標(biāo)準(zhǔn)方法對有關(guān)物質(zhì)方法進(jìn)行驗證，以便于自制產(chǎn)品與原研產(chǎn)品測定結(jié)果的對比分析。

同時，《中國藥典》2015年版二部中規(guī)定記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4.5倍，本研究給出的色譜圖顯示記錄至40 min，未達(dá)到4.5倍，在方法建立過程中已進(jìn)行過考察，能確保將所有雜質(zhì)成分都能洗脫出來，故仍按照YBH06232010方法，采用檢測時間40 min進(jìn)行驗證。

3.2 有關(guān)物質(zhì)特定雜質(zhì)的控制

磺芐西林鈉的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)《中國藥典》2015年版二部中對單雜及總雜質(zhì)量有控制，未對具體的單個雜質(zhì)量進(jìn)行限量規(guī)定。根據(jù)本產(chǎn)品的有關(guān)物質(zhì)考察結(jié)果，成品中含有未反應(yīng)完全的起始物料6-APA，經(jīng)一定程度破壞還會產(chǎn)生其他雜質(zhì)，如左旋磺苯乙酸（原料磺苯乙酰氯帶入），因此建議根據(jù)產(chǎn)品的工藝特性增加特定雜質(zhì)的限度要求。

3.3 破壞試驗結(jié)果分析

強(qiáng)制降解試驗顯示，磺芐西林鈉在氧化破壞及酸破壞試驗中產(chǎn)生的雜質(zhì)較多，根據(jù)青霉素類抗菌藥物降解反應(yīng)的特點(diǎn)[8]，推測其主要是β-內(nèi)酰胺抗菌藥物的水解產(chǎn)物，其具體雜質(zhì)結(jié)構(gòu)有待于進(jìn)一步研究。研究提示本品與酸性藥物存在配伍禁忌，且易被氧化分解，同時熱和光破壞也會使雜質(zhì)量略微增加，因此建議本品的儲存、運(yùn)輸過程中避光、避熱、密封保存。

3.4 小結(jié)

綜上，有關(guān)物質(zhì)[9-13]是與生產(chǎn)工藝、生產(chǎn)過程控制水平密切相關(guān)的項目，對藥品安全性影響較大，目前雜質(zhì)水平已經(jīng)成為藥品質(zhì)量控制中至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)。運(yùn)用各項檢測技術(shù)及知識，建立磺芐西林鈉中雜質(zhì)的測定方法，靈敏度高，分離效果好，可準(zhǔn)確定性，為其工藝生產(chǎn)及儲存運(yùn)輸提供有效的信息，為磺芐西林鈉原料及其注射液質(zhì)量控制提供一定的參考依據(jù)。