李珊，王曉燕，張紅偉*，李向陽(yáng)，劉菊，黃霞（. 河南省食品藥品檢驗(yàn)所 國(guó)家藥品監(jiān)督管理局中藥材及飲片質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 45008；. 鄭州市中醫(yī)院，鄭州 450007）

貝母為百合科貝母屬多種植物的鱗莖，是常用中藥之一。我國(guó)貝母屬植物資源豐富，主要分布于浙江、四川、新疆、甘肅、湖北、安徽等省[1]。全國(guó)各地用作貝母的原植物種類(lèi)繁多，各地均有代用品[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，貝母具有抑菌[3]、鎮(zhèn)咳[4-7]、平喘[8-11]、抗腫瘤[12-16]等作用。舞陽(yáng)貝母資源主要分布在河南省舞鋼市、駐馬店市、南陽(yáng)市、信陽(yáng)市等地，主要生長(zhǎng)于海拔230～700 m的山坡草叢或疏林草地，舞鋼為其分布中心，有較長(zhǎng)的人工栽培和使用歷史[17]。舞陽(yáng)貝母作為河南省特有的藥材資源，現(xiàn)已收入河南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)，中藥材名為“貝母”，為百合科植物舞陽(yáng)貝母Fritillaria wuyangensisZ.Y.Gao的干燥鱗莖或鱗葉。現(xiàn)有研究多針對(duì)主要活性成分陽(yáng)貝母生物堿類(lèi)進(jìn)行含量測(cè)定[18-25]。生物堿類(lèi)成分具有顯著的鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰、抗炎活性[26-29]，本文首次采用HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定舞陽(yáng)貝母中3種生物堿類(lèi)成分，并考察了不同產(chǎn)地加工方法對(duì)其含量的影響，以期為舞陽(yáng)貝母的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用、產(chǎn)地加工規(guī)范化以及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀、ALLTECH2000 ES ELSD（安捷倫），XPE205萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒托利多），Mili-Q Advantage A 10超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司），KQ-250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。乙腈為色譜純（德國(guó)默克股份兩合公司），三氟乙酸、甲醇、三氯甲烷、氨水為分析純，超純水為自制。12批舞陽(yáng)貝母樣品信息見(jiàn)表1，經(jīng)河南省食品藥品檢驗(yàn)所雷留成主任藥師鑒定為百合科植物舞陽(yáng)貝母Fritillaria wuyangensisZ.Y.Gao的干燥鱗莖或鱗葉。對(duì)照品貝母辛（批號(hào)：111892-201402，含量：100.0%）、貝母素甲（批號(hào)：110750-201913，含量：98.4%）、貝母素乙（批號(hào)：110751-201712，含量：97.7%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

表1 樣品信息Tab 1 Sample information

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為YMC-Triart C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%三氟乙酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，21%A；10～35 min，21%～33%A；35～50 min，33%A）；柱溫為30℃；流速為1.0 mL·min－1；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)器為ELSD，漂移管溫度為105℃，載氣為氮?dú)?，流速?.5 L·min－1，增益值為1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的對(duì)照品各適量，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為0.4092、0.4986、0.4208 mg·mL－1的混合對(duì)照品溶液，于冰箱內(nèi)冷藏保存，備用。

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末約2 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加濃氨試液4 mL浸潤(rùn)1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇（4∶1）的混合溶液40 mL，稱(chēng)定重量，混勻，置80℃水浴中加熱回流2 h，放冷，再稱(chēng)定重量，加上述混合溶液補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，用相應(yīng)的溶劑洗滌錐形瓶和濾紙，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

對(duì)照品及供試品按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，3種生物堿類(lèi)成分色譜峰之間分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)均＞12 000，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品（A）和舞陽(yáng)貝母樣品（B）的HPLC圖Fig 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances（A）and Fritillaria Wuyangensis sample（B）

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液1、2、3、4、5、6、10 mL，分別置于7個(gè)10 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，制成系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄其色譜圖，以峰面積對(duì)數(shù)值（lgA，Y）為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值（lgC，X，mg·mL－1）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，建立回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 3種生物堿類(lèi)成分的線(xiàn)性方程和線(xiàn)性范圍Tab 2 Linear equation and linearity of 3 alkaloids

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的峰面積，計(jì)算得到其RSD分別為1.8%、1.9%、1.6%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取6號(hào)樣品粉末6份，每份約2 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定3個(gè)生物堿類(lèi)成分含量，結(jié)果貝母辛、貝母素甲、貝母素乙RSD分別為0.77%、1.6%、1.7%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（4號(hào)樣品），分別于0、2、4、8、12、24、36 h進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果貝母辛、貝母素甲、貝母素乙峰面積RSD分別為0.66%、0.96%、1.3%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的6號(hào)樣品6份，每份約1 g，精密加入貝母辛對(duì)照品溶液（1.0641 mg·mL－1）、貝母素甲對(duì)照品溶液（1.7152 mg·mL－1）、次貝母素乙對(duì)照品溶液（1.0967 mg·mL－1）各1 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測(cè)定含量，并計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果貝母辛、貝母素甲、次貝母素乙的平均加樣回收率分別為97.6%、96.3%、98.8%，RSD均≤1.9%。

2.9 樣品含量

按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 3種生物堿類(lèi)成分含量測(cè)定結(jié)果(n＝3，%)Tab 3 Content determination of 3 alkaloids (n＝3，%)

3 討論

3.1 提取條件的選擇

本文比較了不同提取溶劑系統(tǒng)（氯仿、甲醇、氯仿-甲醇混合溶液）、不同提取方法（超聲、回流）、不同提取時(shí)間（60、90、120、150 min）等因素對(duì)舞陽(yáng)貝母中3個(gè)生物堿類(lèi)成分提取效果的影響，結(jié)果提取效率氯仿-甲醇混合溶液＞甲醇＞氯仿，生物堿類(lèi)化合物易溶于極性較弱的溶劑，如氯仿等，2020年版《中國(guó)藥典》一部浙貝母含量測(cè)定項(xiàng)下采用了氯仿-甲醇（4∶1）作為提取溶劑，氯仿可以減少水溶性雜質(zhì)的溶出，而甲醇穿透性強(qiáng)，故在氯仿中加入甲醇增強(qiáng)穿透性有利于生物堿類(lèi)成分的溶出?；亓鞣ㄌ崛⌒矢哂诔暦?，選用了回流法。提取時(shí)間以120 min最好，保證了3種生物堿類(lèi)成分充分溶出。最終確定本文所采用的提取方法。

3.2 色譜條件的優(yōu)化

貝母類(lèi)藥材中生物堿類(lèi)成分眾多，且大多是立體異構(gòu)體，難以分離，本文比較了乙腈-水、乙腈-0.1%二乙胺、乙腈-0.1%三氟乙酸3個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，分別考察了等度及梯度洗脫，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%三氟乙酸流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫，對(duì)3個(gè)生物堿成分的分離度、靈敏度及柱效均優(yōu)于其他流動(dòng)相系統(tǒng)，且由于流動(dòng)相系統(tǒng)中存在酸性試劑，在LC-MS中使用時(shí)會(huì)比堿性流動(dòng)相系統(tǒng)更有利于生物堿類(lèi)成分的離子化，檢測(cè)靈敏度提高，有利于舞陽(yáng)貝母藥材中生物堿類(lèi)成分的進(jìn)一步研究，故選用乙腈-0.1%三氟乙酸流動(dòng)相梯度洗脫。

比較了5種不同色譜柱Agela-Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、YMC-Triart C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Waters-Symmetrm C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、JADEPAKRS C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），發(fā)現(xiàn)5種色譜柱均能將貝母中3種生物堿有效分離，最終發(fā)現(xiàn)色譜柱YMC-Triart C18（4.6 mm×250 mm，5μm）不僅對(duì)3種生物堿化合物分離度良好，且在不同的流速（0.5、0.8、1.0 mL·min－1）條件下均具有最優(yōu)的色譜圖基線(xiàn)，出峰數(shù)目及理論塔板數(shù)，故最終選擇此色譜柱，確定流速為1.0 mL·min－1。

3.3 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器條件的選擇

確定流動(dòng)相的種類(lèi)和梯度洗脫條件后，比較不同氮?dú)饬魉?、不同漂移管溫度時(shí)3種生物堿類(lèi)成分的信號(hào)強(qiáng)度和基線(xiàn)噪音，確定了蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的檢測(cè)條件：漂移管溫度為105℃、氮?dú)饬魉贋?.5 L·min－1。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果分析

由含量測(cè)定結(jié)果可知，12批次舞陽(yáng)貝母中貝母辛、貝母素乙含量普遍較低，分別為貝母辛（0.0183%～0.1040%）、貝母素乙（0.0348%～0.1061%），貝母素甲含量普遍較高（0.0933%～0.2048%）。此外，本文采用的12批舞陽(yáng)貝母樣品是由硫熏、傳統(tǒng)炕制和烘箱烘干3種不同的產(chǎn)地加工方法加工而成，由測(cè)定結(jié)果中的3種生物堿類(lèi)成分總量可知，烘箱烘干的樣品含量最高（0.2929%～0.3695%），其次是傳統(tǒng)炕制（0.2252%～0.2659%），硫熏含量最低（0.1504%～0.2058%），可見(jiàn)不同產(chǎn)地加工方法對(duì)3種生物堿類(lèi)成分總量產(chǎn)生較大影響，烘箱烘干損失較小，而硫熏損失較大，有文獻(xiàn)報(bào)道顯示硫磺熏蒸不僅使中藥材及飲片殘留大量的二氧化硫，還伴隨有復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致多種有效成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和含量發(fā)生改變[30]。

舞陽(yáng)貝母作為河南特色藥材，針對(duì)其化學(xué)成分的基礎(chǔ)研究較少，探討舞陽(yáng)貝母的生物堿類(lèi)成分，對(duì)考察舞陽(yáng)貝母質(zhì)量，保證臨床用藥穩(wěn)定性和有效性具有一定的意義。本文首次建立同時(shí)測(cè)定舞陽(yáng)貝母中3種生物堿類(lèi)成分的采用HPLCELSD法，操作簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確度高，專(zhuān)屬性強(qiáng)、可用于舞陽(yáng)貝母中貝母辛、貝母素甲、貝母素乙3種成分的定量分析，為舞陽(yáng)貝母的質(zhì)量研究提供了重要的研究基礎(chǔ)。