胡蘿卜軟腐果膠桿菌lux發(fā)光菌株的構(gòu)建和應(yīng)用

鐘靈坤，徐翠虹，黃澤銘，安千里，梁巖

（浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部作物病蟲分子生物學重點實驗室，杭州 310058）

細菌性軟腐病是世界范圍內(nèi)重要的細菌性病害，其病原物主要是果膠桿菌屬（Pectobacterium）和狄克氏菌屬（Dickeya）的細菌，其中胡蘿卜軟腐果膠桿菌（P. carotovorum）的寄主十分廣泛，包括重要經(jīng)濟作物和一些觀賞性花卉等，還可造成蔬果腐爛，導致嚴重的產(chǎn)后損失[1-2]。在田間及倉儲環(huán)境中，高濕度有利于細菌性軟腐病的發(fā)生。胡蘿卜軟腐果膠桿菌在20～35 ℃之間具有較高的致病力，在50 ℃以上無法存活[3-4]。胡蘿卜軟腐果膠桿菌一般通過傷口和自然孔口侵入寄主，侵染初期能明顯觀察到水漬狀病斑，然后病部迅速擴展，最終導致侵染部位腐爛，整株植物萎蔫[5]。胡蘿卜軟腐果膠桿菌是一種死體營養(yǎng)型細菌，相對于活體和半活體營養(yǎng)型細菌的研究，其致病機制以及植物的抗性機制都不是很清楚，還有待進一步研究。

植物病原細菌的檢測方法包括平板菌落計數(shù)法、生理生化法、血清學和核酸定量法。目前針對胡蘿卜軟腐果膠桿菌，常用的方法是平板菌落計數(shù)法和核酸定量法，但這2 種方法都需要首先獲取植物發(fā)病部位，然后破碎植物組織，稀釋涂板統(tǒng)計菌落數(shù)或提取核酸再擴增。而胡蘿卜軟腐果膠桿菌接種后，通過分泌果膠裂解酶、聚半乳糖醛酸酶和纖維素酶等多種細胞壁降解酶造成葉片快速壞死腐爛，出現(xiàn)癥狀時往往發(fā)病已經(jīng)很重，甚至很多葉片掉落在土壤中，導致取材困難，難以精確定量[6]。

近年來，發(fā)光成像技術(shù)已逐漸應(yīng)用到植物病原細菌的檢測中。生物活體發(fā)光成像主要采用2種發(fā)光系統(tǒng)，即熒光（fluorescence）發(fā)光系統(tǒng)和生物發(fā)光（bioluminescence）系統(tǒng)。熒光發(fā)光是基于熒光蛋白的系統(tǒng)，比如，綠色熒光蛋白（green fluorescence protein,GFP），通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團到達高能量狀態(tài)，從而產(chǎn)生發(fā)射光[7]。生物發(fā)光主要是基于熒光素酶的系統(tǒng)，比如，常用的螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase, FLuc）和海腎熒光素酶（renilla luciferase,Rluc）標記哺乳動物和植物細胞后，當外源添加熒光素底物時，熒光素酶與底物反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象[8]。而lux系統(tǒng)包含了編碼熒光素酶及其底物合成酶的基因，因此，無需外源添加底物，可自主發(fā)光[9]。其中l(wèi)uxCDABE基因操縱子已被應(yīng)用于生物活體發(fā)光成像和生物傳感器等研究領(lǐng)域[10-11]。

luxCDABE基因操縱子通常來自發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）、弧菌屬（Vibrio）以及異短桿菌屬（Xenorhabdus）的細菌[12]，其中l(wèi)uxA與luxB編碼了異質(zhì)二聚體熒光素酶，luxC、luxD和luxE負責合成脂肪醛，作為熒光素酶發(fā)光反應(yīng)的底物[13-14]。熒光素酶催化脂肪醛氧化，產(chǎn)生波長為450～490 nm 的可見藍綠光。luxCDABE基因標記的細菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源添加底物，熒光素酶也不影響細菌的正常功能。另外，luxCDABE產(chǎn)生的光信號壽命較長，靈敏度高，特異性強，其標記的病原菌接種植物后，無需破壞植物組織即可直接觀察，并精確定量[15]，因此，luxCDABE標記病原菌對研究植物與病原菌互作機制提供了便利條件。

為了實現(xiàn)對胡蘿卜軟腐果膠桿菌的實時追蹤和定量分析，本研究構(gòu)建了表達luxCDABE的胡蘿卜軟腐果膠桿菌發(fā)光菌株。研究表明，該發(fā)光菌株在不影響細菌自身特性的前提下能夠穩(wěn)定表達luxCDABE元件，光信號強度與細菌的濃度呈線性相關(guān)，因此，通過光信號量化，可進行統(tǒng)計分析，為細菌性軟腐病的防治以及農(nóng)藥藥效評價等相關(guān)研究提供新的研究工具。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及植物材料

從中國林業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Forestry Culture Collection Center, CFCC）獲得胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum）LMG2404（CFCC 10814）；發(fā)光丁香假單胞菌番茄致病變種（Pseudomonas syringaepv.tomato[Pst]）DC3000-LUX 受贈于美國密蘇里大學Gary Stacey 教授；大腸埃希菌（Escherichia coli）DH5α和農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101為實驗室常用菌株。以上細菌均用LB（Lutia broth）培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。植物材料包括擬南芥（Arabidopsis thaliana）Columbia（Col-0）以及購買于農(nóng)貿(mào)市場的白菜（Brassica rapa）、胡蘿卜（Daucus carota）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）。

1.2 質(zhì)粒及引物信息

質(zhì)粒pBBR1MCS2 受贈于浙江大學連佳長教授。本研究中所用引物信息見表1。

表1 引物序列信息Table 1 Information of primer sequences

1.3 主要試劑和儀器

質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒和細菌DNA提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司；T4 DNA連接酶、BamHⅠ和EcoRⅠ購于寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和高效高保真聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction, PCR）酶（KOD-Plus-Neo）購于東洋紡（上海）生物科技有限公司；GreenTaq混合物購于諾唯贊生物科技（南京）股份有限公司。

離心機購自英國Eppendorf 公司；電穿孔儀和PCR 儀購自美國Bio-Rad 公司；HRPCS5 光學成像儀購自英國Photek公司；體式熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 重組質(zhì)粒pBBR1MCS2-luxCDABE的構(gòu)建

通過NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取luxCDABE序列（GenBank 登錄號為JF420888.1），以PstDC3000-LUX菌株的DNA為模板擴增獲得帶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點的luxCDABE基因片段，將片段與質(zhì)粒進行雙酶切后，使用T4 DNA 連接酶將luxCDABE片段插入到pBBR1MCS2載體中，插入片段經(jīng)測序驗證無突變，該重組質(zhì)粒命名為pBBR1MCS2-luxCDABE。

1.4.2 LMG2404 感受態(tài)的制備及電擊轉(zhuǎn)化

將保存在－80 ℃的LMG2404 菌種于LB 固體培養(yǎng)基上活化，在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h 后，挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)16 h 后，離心收集菌液，清洗后用300 mmol/L 蔗糖溶液重懸，制備成LMG2404 電擊感受態(tài)。pBBR1MCS2-luxCDABE質(zhì)粒通過電擊轉(zhuǎn)化入LMG2404 感受態(tài)，電擊條件設(shè)為電壓2.2 kV、電容25μF、電阻400 Ω，電擊后加入液體培養(yǎng)基復蘇1 h，然后涂布于含有卡那霉素抗性的固體培養(yǎng)基上，在28 ℃條件下培養(yǎng)過夜，獲得含pBBR1MCS2-luxCDABE質(zhì)粒的LMG2404 轉(zhuǎn)化子，命名為LMG2404-LUX。

1.4.3 LMG2404-LUX菌株的分子檢測及信號采集

通過PCR 驗證LMG2404-LUX 菌株是否構(gòu)建成功。PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸5 min，30 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性菌落用50%丙三醇在－80 ℃條件下保存。LMG2404-LUX光信號通過HRPCS5光學成像儀采集。

1.4.4 LMG2404-LUX 菌株的特性分析

1.4.4.1 生長曲線測定

取1 mL 菌液在5 000 r/min 條件下離心5 min，去上清液后用1 mL無菌水重懸，反復清洗3次后調(diào)整為在600 nm波長下的光密度為0.5，按照1%的比例用新鮮液體培養(yǎng)基稀釋后繼續(xù)培養(yǎng)，每半小時測定一次D（600 nm），測定總時長為25 h。

1.4.4.2 生物膜測定

用結(jié)晶紫染色法對細菌生物膜進行測定，取100 μLD（600 nm）=0.5 的菌液加入到96 孔細胞培養(yǎng)板中，于30 ℃條件下靜置孵育3 d后，小心倒掉菌液，用去離子水清洗，然后加入125 μL 0.1%結(jié)晶紫溶液染色1 h，吸出染液后室溫晾干，最后用1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解結(jié)晶紫，通過測定D（570 nm）值定量。

1.4.4.3 游動性測定

吸取5 μLD（600 nm）=0.6 的菌液滴在0.3%的半固體LB 培養(yǎng)基平板中心，在28 ℃條件下培養(yǎng)3 d，然后測量菌落直徑。

1.4.5 LMG2404-LUX 接種寄主后的致病性檢測及光信號觀察

1.4.5.1 LMG2404-LUX接種擬南芥

選取在短光照（8 h 光照/16 h 黑暗）下生長4 周的擬南芥Col-0 生態(tài)型第5、6、7 片葉，用細針扎一小孔，吸取5 μL 1×108CFU/mL LMG2404-LUX 菌液滴于針孔處，繼續(xù)在相同光照、22 ℃、90%相對濕度條件下觀察發(fā)病情況，將無病斑到全葉腐爛分為0～4 個發(fā)病等級：0 級表示沒有癥狀；1 級表示接種部位存在水漬狀病斑；2 級表示病斑已擴散到葉的一半左右；3 級表示病斑已擴散到整個葉片；4 級表示病葉軟爛并且已經(jīng)蔓延到植物的其他部分[6-7]。接種LMG2404-LUX 的擬南芥植株可以直接通過HRPCS5光學成像儀采集光信號。

1.4.5.2 LMG2404-LUX接種白菜、胡蘿卜和馬鈴薯

將白菜葉片分開，胡蘿卜和馬鈴薯切片，經(jīng)75%乙醇消毒后自然晾干，將10 μL 1×106CFU/mL LMG2404-LUX 菌液注射入白菜幫、胡蘿卜和馬鈴薯切片的圓心。接種后病斑觀察條件和光信號采集方法與擬南芥的相同。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

采用HRPCS5光學成像儀配置的Image 32軟件進行光信號強度統(tǒng)計；采用Image J 軟件（https://imagej.nih.gov/ij/）進行傷口面積圖像處理；采用Excel 2016、SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)整理及分析，結(jié)果表示為平均值±標準差；采用GraphPad Prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒pBBR1MCS2-luxCDABE 的構(gòu)建結(jié)果

以菌株P(guān)stDC3000-LUX 基因組為模板，擴增帶有酶切位點EcoRⅠ和BamHⅠ的luxCDABE片段，大小為5 817 bp。通過酶切及質(zhì)粒連接，得到pBBR1MCS2-luxCDABE重組質(zhì)粒（圖1），luxCDABE基因簇位于多克隆位點內(nèi)，可由LacZ 和T3 啟動子起始，質(zhì)粒上攜帶NeoR/KanR抗性基因、復制起始位點oriⅤ和調(diào)節(jié)因子Rep序列（圖1）。瓊脂糖凝膠電泳確認DNA大?。▓D2）后，重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗證無突變。

圖1 重組質(zhì)粒圖譜Fig.1 Recombinant plasmid map

圖2 重組質(zhì)粒的電泳檢測Fig.2 Detection of the recombinant plasmid using agarose gel electrophoresis

2.2 LMG2404-LUX 菌株的分子鑒定結(jié)果

試驗通過快速制備感受態(tài)及電擊轉(zhuǎn)化，將pBBR1MCS2-luxCDABE重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入胡蘿卜軟腐果膠桿菌LMG2404，獲得發(fā)光菌株，命名為LMG2404-LUX。首先通過PCR擴增16S rRNA，測序驗證為胡蘿卜軟腐果膠桿菌；其次通過PCR檢測熒光素基因片段，以luxC基因為模板設(shè)計引物進行擴增，重組質(zhì)粒作為正對照，擴增片段大小為588 bp，凝膠電泳結(jié)果顯示，以LMG2404-LUX 為模板的擴增片段大小與正對照一致（圖3），說明已成功獲得LMG2404-LUX菌株。

圖3 luxC基因的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.3 Detection of the amplified luxC products using agarose gel electrophoresis

2.3 LMG2404-LUX 的菌落形態(tài)及光信號檢測

本研究使用的檢測系統(tǒng)為HRPCS5 光學成像儀，該系統(tǒng)采用高分辨率的照相機采集信號，紅色表示光信號中等，白色表示光信號很強。通過光學成像儀檢測發(fā)現(xiàn)，LMG2404-LUX 的菌落呈現(xiàn)很強的光信號，而相同條件下LMG2404 無光信號（圖4A）。LMG2404-LUX 的菌落形態(tài)與LMG2404 相比無明顯差異，菌落均為白色圓形，表面平滑濕潤且邊緣光滑（圖4B～C）。

圖4 LMG2404-LUX發(fā)光成像及菌落形態(tài)Fig.4 Luminescence imaging and colony morphology of LMG2404-LUX

2.4 LMG2404-LUX 菌株的基礎(chǔ)生物學特性

為了檢測luxCDABE基因表達是否改變了胡蘿卜軟腐果膠桿菌的生物學特性，本研究對比了LMG2404-LUX與LMG2404的生長曲線、生物膜和游動性3個指標。生長曲線測定結(jié)果顯示：2個菌株在5 h 后都能進入對數(shù)生長期，15 h 后達到穩(wěn)定期，因此，luxCDABE基因表達不影響LMG2404 的生長（圖5A）。細菌生物膜是細菌分泌胞外多糖等物質(zhì)黏附于接觸表面而形成的細菌群體，是細菌適應(yīng)環(huán)境的重要機制[16]。通過結(jié)晶紫方法檢測發(fā)現(xiàn)，luxCDABE基因表達不影響LMG2404的生物膜形成（圖5B）。此外，游動性也是細菌生長和致病的指標之一[17]。將相同量的LMG2404-LUX 與LMG2404菌液滴在半固體培養(yǎng)基平板中央并靜置培養(yǎng)3 d，其菌落大小無顯著性差異，說明luxCDABE基因表達不影響LMG2404的游動性（圖5C）。

圖5 LMG2404-LUX生長曲線、生物膜形成以及游動性檢測Fig.5 Detection of growth curve,biofilm formation and motility of LMG2404-LUX

2.5 LMG2404-LUX 菌株的光信號穩(wěn)定性

為了檢測連續(xù)繼代是否影響LMG2404-LUX的光信號，本研究將LMG2404 和LMG2404-LUX連續(xù)繼代培養(yǎng)10次。當菌液生長至濃度約為5×108CFU/mL 時，按照1∶100 繼代至新鮮液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，以此類推，繼代培養(yǎng)10次，每一次繼代后將菌液稀釋至50 CFU/mL涂板，培養(yǎng)24 h后測量光信號。結(jié)果（圖6A）發(fā)現(xiàn)，繼代10 次不影響光信號強度。繼代后有時光信號略微降低，如第2、8、9、10次繼代，這可能是繼代后的菌量差異所致。

另外，本研究也檢測了固體培養(yǎng)基上LMG2404-LUX 的發(fā)光動力學。通過連續(xù)14 d 對固體培養(yǎng)基上生長的細菌光信號進行檢測，發(fā)現(xiàn)在細菌對數(shù)生長期和穩(wěn)定期的光信號強于衰老期，隨著細菌的衰老，光信號逐漸減弱，說明lux光信號與細菌活力呈正相關(guān)（圖6B）。

圖6 連續(xù)繼代培養(yǎng)及LMG2404-LUX衰老對光信號的影響Fig.6 Effects of continuous subculture and the aging of LMG2404-LUX on luminescent signals

胡蘿卜軟腐果膠桿菌在20～35 ℃條件下正常生長，為了檢測此區(qū)間的溫度對luxCDABE基因表達的影響，本研究將50 μL 5×108CFU/mL（pH=6）的LMG2404-LUX 菌液分別在不同溫度條件下靜止培養(yǎng)1 h 后檢測光信號。結(jié)果表明：在正?？諝猸h(huán)境中，25～35 ℃不影響luxCDABE基因表達，甚至在0 ℃條件下，LMG2404-LUX 仍然保留了大部分光信號；但在不利于菌生長的高溫（≥45 ℃）條件下，光信號消失（圖7A）。另外，室溫、正?？諝猸h(huán)境條件下，在5＜pH＜8的范圍內(nèi)luxCDABE基因表達也不受影響，在pH≥9 的堿性條件下，光信號消失（圖7B）。這些結(jié)果說明，在適宜細菌生長的溫度和pH范圍內(nèi)，luxCDABE基因表達不受影響，也進一步證明了lux光信號與細菌活力呈正相關(guān)的結(jié)論。

圖7 溫度和pH對LMG2404-LUX光信號強度的影響Fig.7 Effects of temperature and pH on luminescent signal intensity of LMG2404-LUX

2.6 LMG2404-LUX 光信號強度與菌液濃度的相關(guān)性

為了檢測lux光信號強度與菌液濃度的關(guān)系，本研究將1×108CFU/mL 的菌液以1∶10 依次稀釋5 個濃度梯度，然后同時檢測其光信號（圖8）。將菌液濃度1×104、1×105、1×106、1×107、1×108CFU/mL 和相應(yīng)的光信號值取對數(shù)后做回歸分析，發(fā)現(xiàn)光信號強度與菌液濃度呈線性相關(guān)（R2=0.995 6），在1×104～1×108CFU/mL菌液濃度范圍內(nèi)，lux光信號強度可以反映菌液濃度。

圖8 LMG2404-LUX菌的光信號強度與菌液濃度的相關(guān)性Fig.8 Correlation of luminescent signal intensity of LMG2404-LUX with bacterial concentrations

2.7 LMG2404-LUX侵染擬南芥后的光信號檢測

為了檢測luxCDABE基因表達是否改變LMG2404 的致病性，本研究分別將1×108CFU/mL的LMG2404-LUX 和LMG2404 菌株接種到擬南芥Col-0生態(tài)型上，接種后連續(xù)3 d通過傳統(tǒng)方法統(tǒng)計發(fā)病情況，并同時采集光信號。結(jié)果表明：擬南芥從第1天到第3天發(fā)病逐漸嚴重，第1天大部分葉片出現(xiàn)水漬狀病斑（1級，圖9A），第2天葉片出現(xiàn)壞死（2～4 級，圖9B），第3 天葉片已全部腐爛（圖9C）；LMG2404-LUX 菌株侵染后病情指數(shù)與LMG2404侵染沒有顯著差異（圖9），說明luxCDABE基因表達不影響LMG2404的致病性。

圖9 LMG2404-LUX侵染擬南芥后不同天數(shù)的葉片病情指數(shù)Fig.9 Disease severity of Arabidopsis leaves at different days after infection with LMG2404-LUX

光信號強度分析表明，接種后第1 天和第2 天適宜采集光信號，當葉片腐爛時，光信號減弱。接種后第1 天，lux光信號強度達到5×105（圖10A～B），說明該信號元件不僅可用于快速定量，而且可用于早期病菌侵染檢測。因此，本研究對接種LMG2404-LUX 后的擬南芥葉片進行了早期動態(tài)監(jiān)測。將1×108CFU/mL 的LMG2404-LUX 菌液接種到擬南芥葉片后，每6 h 采集光信號。結(jié)果（圖10C）表明，接種后6～36 h，光信號逐漸增強，說明lux光信號強度與該菌的增殖呈線性相關(guān)，而且在侵染初期可以檢測到光信號，但相比于菌液本身（0點），接種后6 h，光信號強度反而下降，說明即使應(yīng)用高濃度菌液接種，侵入植物體內(nèi)的菌量仍然有限。因此，本研究用相對低濃度的LMG2404-LUX（1×105CFU/mL）接種后進行動態(tài)監(jiān)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種后12 h 開始出現(xiàn)可檢測的光信號，在12～36 h 之間光信號逐漸增強，與使用高濃度菌接種時的增殖速率相當。綜上所述，LMG2404-LUX 菌株可用于該菌侵染擬南芥的動態(tài)監(jiān)測以及擬南芥的抗病性定量分析。

圖10 LMG2404-LUX侵染擬南芥后的光信號強度檢測Fig.10 Detection of luminescent signal intensity in Arabidopsis leaves after infection with LMG2404-LUX

2.8 LMG2404-LUX 侵染白菜、馬鈴薯和胡蘿卜后的光信號檢測

胡蘿卜軟腐果膠桿菌有多種寄主，因此，本研究也檢測了LMG2404-LUX對白菜、馬鈴薯和胡蘿卜的致病性。將1×106CFU/mL 的LMG2404-LUX 和LMG2404菌株分別接種到上述植物，48 h后采集光信號。結(jié)果表明：在這3種寄主上，LMG2404-LUX與LMG2404 的致病性無顯著差異（圖11A～D）；光信號強度為馬鈴薯上最強，然后依次為胡蘿卜和白菜，說明LMG2404-LUX 在馬鈴薯上生長最快，其次是在胡蘿卜上，在白菜上生長最慢（圖11E～G）。

圖11 LMG2404-LUX侵染白菜、胡蘿卜和馬鈴薯后的癥狀及光信號檢測Fig.11 Symptoms and luminescent signal detection of B.rapa,D.carota and S.tuberosum infected by LMG2404-LUX

2.9 luxCDABE 基因在大腸埃希菌DH5α 和農(nóng)桿菌GV3101 菌株上的表達

pBBR1MCS2 質(zhì)粒是一類廣宿主蛋白表達載體，能夠在大多數(shù)細菌中穩(wěn)定表達。本研究嘗試將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到實驗室常用的大腸埃希菌和農(nóng)桿菌中，構(gòu)建了DH5α-LUX 及GV3101-LUX 菌株，并觀察到很強的光信號（圖12），揭示該載體可廣泛用于其他細菌發(fā)光菌株的構(gòu)建。

圖12 luxCDABE在大腸埃希菌和農(nóng)桿菌中的表達Fig.12 Expressions of luxCDABE in E. coli and A.tumefaciens

3 討論

原核生物表達luxCDABE基因通常可通過2 個途徑，一是直接插入基因組[14]，二是通過質(zhì)粒表達luxCDABE。通常質(zhì)粒表達比插入基因組的方式表達量更高，因此，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株表達luxCDABE后光信號更強，易于檢測[12]。雖然外源質(zhì)粒在繼代過程中存在一定比例的丟失，但本研究中通過10次連續(xù)繼代培養(yǎng)，LMG2404-LUX 的光信號依然很強，能穩(wěn)定用于后續(xù)研究。另外，除了luxCDABE核心基因，有研究表明，其他lux元件也可以促進發(fā)光強度增大。比如，BRODL 等發(fā)現(xiàn)，luxF元件可以結(jié)合黃素衍生物產(chǎn)生發(fā)光反應(yīng)的副產(chǎn)物，該類物質(zhì)的存在會加強細菌的發(fā)光強度[18]。NIJVIPAKUL 等發(fā)現(xiàn)，luxG通過編碼黃素還原酶來減少黃素單核苷酸，促進光化學反應(yīng)正向進行[19]。在費氏弧菌（Vibrio fischeri）中還存在luxR，它能與調(diào)控lux基因的啟動子結(jié)合，激活發(fā)光基因的轉(zhuǎn)錄[20]。因此，后續(xù)可以通過添加其他元件提高luxCDABE的發(fā)光強度，從而進一步提高該系統(tǒng)的靈敏度。

目前，植物軟腐病發(fā)病程度的評價仍使用病情指數(shù)或者病斑大小進行描述，易在抗性品種評價中造成人為誤差[21]。本研究結(jié)果顯示，發(fā)光胡蘿卜軟腐果膠桿菌接種后，馬鈴薯的病斑較小，但光信號強度卻比胡蘿卜高，所以通過lux的光信號檢測方法能更準確地反映真實的細菌量。雖然平板稀釋法和核酸定量法可以相對精確定量細菌，但耗時耗力，且因取材部位不同，不能系統(tǒng)、全面地反映整株植物的發(fā)病情況。而luxCDABE標記的胡蘿卜軟腐果膠桿菌，可對其致病程度快速定量，而且可實現(xiàn)實時系統(tǒng)性監(jiān)測，為抗病品種選育提供了有力工具。

luxCDABE元件標記細菌還在致病機制、藥效評價、環(huán)境毒性物質(zhì)檢測等研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。比如：通過luxCDABE標記不動桿菌（Acinetobacter baumannii）可觀察該菌侵染小鼠肺部的動態(tài)過程[12]；通過luxCDABE標記金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）快速檢測羊毛硫和莫匹羅星等抗生素的藥效[22]；luxCDABE標記的大腸埃希菌制成磁珠，可用于定量檢測土壤污染程度[23]。因此，本文luxCDABE標記的胡蘿卜軟腐果膠桿菌也可應(yīng)用于農(nóng)業(yè)相關(guān)領(lǐng)域的研究，比如，評估噻霉酮、葉枯唑、四霉素等化學藥劑的藥效[24]。此外，伴隨著熒光檢測酶標儀的逐漸普及，能夠?qū)Σ煌幚硐碌募毦M行準確評估，實現(xiàn)高通量檢測，也將擴大發(fā)光標記細菌的應(yīng)用范圍[25]。

4 結(jié)論

本文通過采用luxCDABE標記胡蘿卜軟腐果膠桿菌LMG2404，構(gòu)建了LMG2404-LUX 發(fā)光菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，luxCDABE基因表達不影響LMG2404 的生長特性和致病性。侵染植物后，LMG2404-LUX的光信號強度與該菌侵染增殖速率呈線性相關(guān)。因此，LMG2404-LUX 可以用于該菌的快速定量以及在寄主體內(nèi)的活體檢測，為胡蘿卜軟腐果膠桿菌的相關(guān)研究提供了新的工具。