馬鳴 丁雅雯 焦文靜 何京 崔雯瑄 邵俊國 于浩淼 張金艷

作者單位：河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗科(石家莊市050011)

胃癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，位居世界惡性腫瘤發(fā)病率的第4 位，患者5年生存率僅50%左右[1-2]。中國胃癌新發(fā)病例超過全球患者總數(shù)的40%，發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平[3]。中國胃癌患者的病理類型以腺癌為主，胃腺癌細胞侵襲性較強，易發(fā)生淋巴結(jié)及遠處轉(zhuǎn)移。目前，臨床評估包括胃癌在內(nèi)的實體腫瘤侵犯主要依賴于影像學(xué)技術(shù)，而腫瘤細胞累及骨髓的發(fā)生通常比較隱匿，且常規(guī)影像學(xué)檢查難以完全確診。因此，影響臨床準(zhǔn)確分期和治療方案的選擇，是造成患者復(fù)發(fā)和治療失敗的重要因素之一[4]。

骨髓涂片細胞學(xué)檢查或骨髓活檢是確診腫瘤細胞累及骨髓的主要手段，目前臨床上患者進行骨髓檢查的主要指征為與治療無關(guān)且難以糾正的嚴(yán)重血細胞減少或影像學(xué)顯示多發(fā)骨質(zhì)破壞等。因此，血常規(guī)檢測結(jié)果正?；蜉p度異常且影像學(xué)未見明顯異常的患者較易漏診[4-6]。同時，由于骨髓檢查為有創(chuàng)檢查，臨床腫瘤相關(guān)科室難以完全普及，故總結(jié)分析胃癌細胞侵犯骨髓患者各項實驗室檢測結(jié)果的特點，對于提示骨髓檢查以及早發(fā)現(xiàn)骨髓侵犯尤為重要?；诖?，本研究總結(jié)分析于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院就診的30 例胃癌細胞侵犯骨髓患者各項實驗室指標(biāo)檢測結(jié)果及其特點，并以50 例骨髓未侵犯Ⅳ期患者為對照，以期發(fā)現(xiàn)提示骨髓侵犯的實驗室檢測指標(biāo)，為胃癌的臨床診療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

回顧性分析2013年1月至2021年3月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院就診，進行各項檢查且資料較為完善的胃癌初診患者，所有病例均經(jīng)腫瘤組織病理檢測確診為胃腺癌，且均經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學(xué)或骨髓活檢明確是否發(fā)生骨髓侵犯。同時，所有患者均經(jīng)影像學(xué)或病理學(xué)檢測明確是否發(fā)生淋巴結(jié)及其他部位遠處轉(zhuǎn)移，患者臨床分期參考2017年國際抗癌聯(lián)盟/美國癌癥聯(lián)合委員會（UICC/AJCC）TNM 分期（第8 版）標(biāo)準(zhǔn)。自2013年1月至2021年3月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗科進行骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢測的胃腺癌患者305 例，其中有30 例患者明確發(fā)生骨髓侵犯，總檢出率為9.84%。

1.2 方法

1.2.1 骨髓涂片及骨髓活檢分析 標(biāo)本制備：骨髓標(biāo)本取材部位為髂前或髂后上棘。骨髓涂片行瑞氏-吉姆薩染色處理。骨髓活檢標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定后，石蠟包埋組織，并切成4 μm 厚的石蠟切片、H&E染色后進行形態(tài)學(xué)觀察。骨髓組織切片的網(wǎng)狀纖維染色評級參考四級法[7]。同時，骨髓切片按SP 免疫組織化學(xué)的方法，切片經(jīng)脫蠟與水化后，用3%H2O2去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性15 min，1%山羊血清抗體封閉后分別滴加廣譜CK 一抗37℃孵育3 h，再分別滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗和鏈霉親和素-生物素-辣根過氧化物酶復(fù)合物。根據(jù)陽性細胞百分比和染色強度觀察和分析骨髓組織CK 的表達情況。

1.2.2 常規(guī)實驗室檢查 所有患者均于骨髓組織采集時間前后1 周以內(nèi)進行各項常規(guī)實驗室檢查，晨檢空腹采血，進行血常規(guī)[白細胞計數(shù)（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板（Plt）、中性粒細胞比例（NE%）及淋巴細胞比例（LY%）等]、凝血功能[凝血酶原時間（PT）、部分活化凝血酶原時間（APTT）、凝血酶時間（TT）、纖維蛋白原（FIB）、D 二聚體（D-DIMER）及纖維蛋白原降解產(chǎn)物（FDP）等]、腫瘤標(biāo)記物（CEA、CA19-9及CA72-4）及其他生化免疫指標(biāo)[乳酸脫氫酶（LDH）、C 反應(yīng)蛋白（CRP）及降鈣素原（PCT）]檢測并計算中性粒細胞/淋巴細胞比值（NLR），分析骨髓侵犯組與骨髓未侵犯組各項檢測指標(biāo)結(jié)果的異常檢出率及均值差異。各項檢測結(jié)果參考區(qū)間均按照該項目衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或檢測試劑盒說明書。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以±s表示，組間比較采用兩組獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線分析各實驗室檢測指標(biāo)對胃癌細胞侵犯骨髓的預(yù)測價值。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細胞骨髓侵犯患者骨髓象、血象及骨髓病理學(xué)特點

骨髓侵犯組患者30 例，其中男性23 例，女性7 例，年齡29～73 歲，中位年齡53 歲，所有患者均明確發(fā)生骨髓侵犯，臨床分期均為Ⅳ期。同期骨髓未侵犯組患者50 例作為對照組，其中男性33 例，女性17 例，年齡26～86 歲，中位年齡63 歲，所有患者均明確未發(fā)生骨髓侵犯同時臨床分期為Ⅳ期。兩組患者年齡、性別、臨床分期及病理類型的構(gòu)成差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

30 例骨髓侵犯組患者骨髓象分析結(jié)果顯示，1 例（3.33%）為極度活躍；7 例（23.33%）為明顯活躍；16 例（53.33%）為增生活躍；6 例患者（20.00%）骨髓取材不佳，其中2 例（6.67%）發(fā)生骨髓壞死。50 例骨髓未侵犯組患者骨髓象分析結(jié)果顯示，18 例（36.00%）為明顯活躍；2 例患者（4.00%）骨髓取材不佳；30 例（60.00%）為增生活躍，未見骨髓壞死；兩組之間骨髓取材不佳的檢出率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。發(fā)生骨髓侵犯的胃癌患者骨髓涂片內(nèi)均可見瘤細胞成團分布（圖1A），胃癌細胞個體差異較大，細胞通常較大且核型不規(guī)則；核染色質(zhì)疏松、核仁清晰2～4 個；胞質(zhì)豐富染藍-深藍色、可見粉紅色顆粒，細胞多融合成團，部分細胞可見巨大空泡（圖1B）；可見巨大多核瘤細胞（圖1C）及瘤細胞分裂像（圖1D）；伴骨髓壞死者，可見部分有核細胞呈溶解狀態(tài)（圖1E）。

外周血形態(tài)學(xué)分析結(jié)果顯示，30 例骨髓侵犯組患者，其中16 例（53.33%）外周血可見幼粒細胞[ 中位值為3%（1%～28%）]，20 例患者（66.67%）可見幼紅細胞中位值為[4%（1%～41%）]；50 例骨髓未侵犯組患者，其中3 例患者（6.00%）外周血可見幼粒（2 例為1%、1 例為2%）、1 例患者（2.00%）可見幼紅細胞（2%）。兩組患者外周血幼紅、幼粒細胞檢出率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

本組有8 例發(fā)生骨髓侵犯的患者行骨髓活檢，結(jié)果顯示：6 例患者骨小梁間區(qū)瘤細胞彌漫分布，粒、紅兩系明顯減少或缺乏，巨核細胞少見；2 例患者瘤細胞呈灶性或片狀分布，粒、紅兩系增生，巨核細胞不少。網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果顯示：8 例患者均伴有不同程度骨髓纖維組織增生，網(wǎng)狀纖維染色結(jié)果5 例為2～3 級，3 例為1 級。骨髓組織切片中瘤細胞的形態(tài)特點：胞體較大，瘤細胞質(zhì)量豐富，核形不規(guī)則，染色質(zhì)較細致，可見核仁，部分區(qū)域可見瘤細胞呈腺體樣排列（圖1F）。免疫組織化學(xué)染色（圖1G）顯示異常細胞廣譜CK 染色為陽性。

圖1 胃癌骨髓侵犯細胞形態(tài)學(xué)及病理學(xué)特點

2.2 患者相關(guān)實驗室檢查結(jié)果分析

血常規(guī)檢測結(jié)果示，與骨髓未侵犯組患者比較，骨髓侵犯組患者，其WBC、NE（%）、LY（%）及NLR結(jié)果異常檢出率及均值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。但骨髓侵犯組患者外周血Plt 計數(shù)異常的檢出率明顯高于骨髓未侵犯組患者，且Hb 及Plt 檢測結(jié)果均值明顯低于骨髓未侵犯組患者（P＜0.01）。見表1，2。

表1 兩組胃癌患者實驗室檢查結(jié)果分析

表1 兩組胃癌患者實驗室檢查結(jié)果分析（續(xù)表1）

表2 骨髓侵犯組與骨髓未侵犯組患者的血常規(guī)檢測結(jié)果對比

凝血功能檢測結(jié)果顯示，與骨髓未侵犯組患者相比，骨髓侵犯組患者，其PT、D-DIMER 及FDP 結(jié)果異常檢出率及檢測結(jié)果均值均明顯增高（P＜0.01），F(xiàn)IB 含量則明顯低于骨髓未侵犯組患者（P＜0.01），而APTT 及TT 兩組結(jié)果異常檢出率及均值差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1，3。

表3 骨髓侵犯組與未侵犯組患者的凝血功能檢測結(jié)果對比

腫瘤標(biāo)記物檢測結(jié)果顯示，骨髓侵犯組患者CEA 及CA72-4 血清含量異常檢出率均明顯高于骨髓未侵犯組患者（P＜0.05），同時CEA、CA19-9 及CA72-4 血清含量檢測值均明顯高于骨髓未侵犯組患者（P＜0.05）。LDH 血清含量異常檢出率及檢測值亦明顯高于骨髓未侵犯組患者（P＜0.01），而CRP 及PCT 結(jié)果異常檢出率及血清含量的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1，4。

表4 骨髓侵犯組與未侵犯組患者免疫生化檢測結(jié)果對比

2.3 患者實驗室檢查結(jié)果的ROC 分析

對提示胃癌細胞可能骨髓侵犯的指標(biāo)分別繪制ROC 曲線（圖2）。ROC 面積比較顯示FDP、DDIMER、CEA、CA72-4、LDH、PT、FIB、LDH 及Plt，骨髓侵犯組與骨髓未侵犯組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），且AUC 分別均在0.7 以上，診斷價值較高，其中FDP 的ROC 曲線下面積最大（AUC=0.988），且陽性似然比最高，最佳截斷值為8.05，此時提示胃癌細胞骨髓侵犯的敏感度為95.20%，特異性為95.00%。見表5。

圖2 胃癌患者骨髓侵犯各指標(biāo)的ROC 分析

3 討論

本研究分析了近8年在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院進行骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢查的胃癌患者骨髓象特點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)約9.84%的患者發(fā)生癌細胞累及骨髓。綜合上述患者的實驗室檢測結(jié)果，篩選出可能發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移的提示性指標(biāo)應(yīng)用于患者臨床監(jiān)測具有重要意義。

骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢查是評價腫瘤細胞累及骨髓的首選檢測項目。胃癌細胞通常個體較大伴形態(tài)不規(guī)則，易見多核巨細胞及細胞分裂像。骨髓涂片中發(fā)現(xiàn)異常細胞異常細胞成團而聚，并結(jié)合患者病史，判斷胃癌細胞骨髓侵犯并不困難，但應(yīng)注意與惡性組織細胞、淋巴瘤細胞、巨大骨髓瘤細胞等造血系統(tǒng)惡性腫瘤細胞的鑒別，造血系統(tǒng)惡性腫瘤細胞雖然異型性也較為明顯，但主要為散在分布。

本研究有8 例患者進行骨髓活檢檢查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤細胞侵犯的方式以彌漫分布為主，少數(shù)為灶性或片狀分布，同時患者均伴有不同程度的骨髓纖維組織增生，這也是造成骨髓涂片細胞學(xué)檢查中取材不佳的重要原因。由于骨髓活檢避免了骨髓纖維化造成的取材稀釋，H&E 染色并結(jié)合免疫組織化學(xué)檢測陽性率明顯高于單純骨髓涂片細胞學(xué)檢測，且易于發(fā)現(xiàn)局灶性或散在分布的瘤細胞。因此，是骨髓細胞形態(tài)學(xué)檢查的有力補充[4]。

腫瘤患者與治療無關(guān)的血常規(guī)檢測結(jié)果明顯異常是提示可能發(fā)生腫瘤細胞累及骨髓的重要指標(biāo)。但胃癌患者由于營養(yǎng)物質(zhì)吸收代謝障礙，多數(shù)患者會出現(xiàn)貧血、白細胞計數(shù)減低等異常。因此，胃癌患者骨髓侵犯更易出現(xiàn)漏診。本研究患者中，骨髓侵犯組與骨髓未侵犯組患者血紅蛋白含量及白細胞計數(shù)的異常檢出率均無顯著性差異，但骨髓侵犯組胃癌患者更易發(fā)生Plt 減少，且貧血程度及Plt 減少程度更為明顯，提示Plt 計數(shù)的明顯減少可能是胃癌細胞骨髓侵犯的重要指標(biāo)之一。同時，由于骨髓侵犯破壞了血竇結(jié)構(gòu)，患者外周血更易出現(xiàn)幼紅及幼粒細胞。本研究的結(jié)果與相關(guān)研究報道的結(jié)論一致[4,8]。因此，當(dāng)胃癌患者出現(xiàn)難以糾正的嚴(yán)重貧血或Plt 明顯減少，伴外周血出現(xiàn)幼稚細胞明顯增多時，提示患者應(yīng)進行骨髓檢查以明確是否骨髓轉(zhuǎn)移。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，NLR 值作為全身炎癥反應(yīng)指標(biāo)，與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這可能與中性粒細胞釋放的IL-6、IL-8 及VGFR 等可顯著促進腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)，NLR 值越高，提示腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的可能性越大[9-10]。但腫瘤細胞侵犯不同臟器之間NLR 值的變化缺乏特異性。本研究發(fā)現(xiàn)，骨髓侵犯組胃癌患者與骨髓未侵犯組Ⅳ期患者相比，NLR 值無顯著差異，說明在胃癌中NLR 值對于骨髓侵犯無特殊提示意義。

晚期胃癌患者可出現(xiàn)不同程度的凝血功能異常，以PT、FIB、D-DIMER 及FDP 異常最為常見，APTT及TT 出現(xiàn)異常相對較少。FIB 是血栓形成的前體物質(zhì)，也是具有代表性的急性時相期蛋白，其增高往往預(yù)示患者凝血活性增強[11-12]。腫瘤患者早期FIB 常有增高的趨勢，這與患者在治療前通常存在內(nèi)皮組織的活化及應(yīng)激狀態(tài)有關(guān)，由此可導(dǎo)致繼發(fā)性血栓的形成，而晚期患者體內(nèi)通常存在纖溶亢進的狀態(tài)，造成FIB 的降解增加，因此發(fā)生繼發(fā)性纖溶的患者會出現(xiàn)FIB 明顯減低。D-DIMER 及FDP 均為交聯(lián)纖維蛋白的特異性降解產(chǎn)物，其中D-DIMER 為繼發(fā)性纖溶的特有代謝物，兩者水平同時增高可反映體內(nèi)繼發(fā)性纖溶亢進。有研究顯示，Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者常出現(xiàn)D-DIMER與FDP 同時增高，而發(fā)生骨髓侵犯的胃癌患者更易發(fā)生DIC[4,13]。本研究也發(fā)現(xiàn)，骨髓侵犯組胃癌患者其血漿中D-DIMER 及FDP 的水平明顯高于骨髓未侵犯組，而FIB 水平則明顯低于骨髓未侵犯組，提示發(fā)生骨髓侵犯的胃癌患者更易發(fā)生凝血機制的異常及纖溶亢進的狀態(tài)。本研究的結(jié)果同時也說明凝血功能指標(biāo)的明顯異常，特別是D-DIMER 及FDP 水平的明顯增高是提示胃癌細胞骨髓侵犯的可能指標(biāo)。

本研究還檢測了胃癌患者外周血清中腫瘤標(biāo)記物CEA、CA19-9、CA72-4 及LDH 的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨髓侵犯組患者血清中CEA、CA19-9、CA72-4及LDH 水平明顯高于骨髓未侵犯組Ⅳ期患者。血清中上述腫瘤標(biāo)記物及LDH 均主要由腫瘤細胞分泌，是反映機體瘤細胞負荷的重要指標(biāo)，腫瘤患者血清中上述各指標(biāo)水平增高，通常預(yù)示著病情惡化或預(yù)后較差，而有效治療后各腫瘤標(biāo)記物及LDH 含量的減低則提示病情趨于穩(wěn)定[14-15]。因此，骨髓侵犯組患者血清中CEA、CA19-9、CA72-4 及LDH 水平明顯高于骨髓未侵犯組，提示胃癌患者骨髓侵犯往往發(fā)生在腫瘤負荷較大的情況下。血清CEA、CA19-9、CA72-4及LDH 含量明顯增高的患者如果同時伴血常規(guī)或凝血功能明顯異常則有必要進行骨髓檢查。

CRP 及PCT 是重要的急性時相反應(yīng)蛋白，進展期特別是伴有遠處轉(zhuǎn)移的腫瘤患者可見兩者明顯增高，但其含量增高同樣缺乏組織特異性，本研究也發(fā)現(xiàn)骨髓侵犯組患者外周血清中CRP 及PCT 含量較骨髓未侵犯組無顯著性差異。

ROC 曲線分析結(jié)果顯示，在骨髓侵犯組與骨髓未侵犯組相比差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義的各指標(biāo)中，PT、D-DMER、FDP 及FIB 均為凝血相關(guān)指標(biāo)，提示發(fā)生骨髓侵犯的胃癌患者更易發(fā)生繼發(fā)性纖溶亢進，且FDP 的ROC 曲線下面積最大，陽性似然比最高。因此，F(xiàn)DP 值的異常在胃癌患者骨髓侵犯中的提示意義最大，當(dāng)胃癌患者伴有凝血功能明顯異常，尤其是FDP 及D-DMER 二聚體含量顯著增高時，應(yīng)進行骨髓檢查以明確是否發(fā)生骨髓侵犯。

綜上所述，本研究分析了30 例胃癌侵犯骨髓患者的多項常規(guī)實驗室檢測結(jié)果，初步篩選出了對癌細胞骨髓侵犯具有提示意義的實驗室指標(biāo)，特別是發(fā)現(xiàn)部分凝血功能等實驗室指標(biāo)的變化對于提示胃癌細胞累及骨髓具有較大意義，因此為胃癌患者的臨床診療提供了科學(xué)依據(jù)。