張譯豐，郭城釬，柳 彬，沈玉棟，王 弘，陳子鍵，羅 林，徐振林*

（1. 廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東 廣州 510640；2. 中國(guó)生物蘭州生物制品研究有限責(zé)任公司，甘肅 蘭州 730046；3. 福建省東山海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，福建 漳州 363400）

擬除蟲菊酯類農(nóng)藥是模擬天然擬除蟲菊酯合成的，含有苯氧烷基的環(huán)丙烷酯類化合物［1］。此類農(nóng)藥具有神經(jīng)毒性、生殖毒性、免疫系統(tǒng)毒性與腫瘤毒性等［2－5］，對(duì)人畜健康有一定危害。3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）是擬除蟲菊酯類農(nóng)藥最主要的代謝產(chǎn)物，也是其重要的風(fēng)險(xiǎn)暴露評(píng)估指標(biāo)。除蟲菊酯類農(nóng)藥可通過(guò)環(huán)境接觸和食物鏈進(jìn)入機(jī)體內(nèi)，在人體中能被迅速吸收并代謝成極性更高的3-PBA，主要存在于血液和尿液中［6］。研究發(fā)現(xiàn)，成人尿液樣本中檢測(cè)到3-PBA的占比高達(dá)91.3%，中位數(shù)水平范圍為0.30～18.3 ng/mL［7－9］。調(diào)查顯示，男性不育癥患者尿液中的3-PBA 濃度與精子質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)［10］，同時(shí)研究表明3-PBA 具有抗雌激素的特性，會(huì)使生物體內(nèi)分泌代謝紊亂［11］。目前3-PBA 作為尿液分析物已被美國(guó)、加拿大等國(guó)家納入衛(wèi)生監(jiān)測(cè)的研究對(duì)象［12］。3-PBA 的半衰期比菊酯類農(nóng)藥更長(zhǎng)（180 d），生物毒性更大，在土壤中的遷移速率也較快，人們有可能通過(guò)環(huán)境接觸3-PBA。因此開(kāi)展3-PBA 的檢測(cè)方法研究，對(duì)實(shí)現(xiàn)對(duì)3-PBA及擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的監(jiān)控和風(fēng)險(xiǎn)暴露評(píng)估具有重要意義。

儀器檢測(cè)法是檢測(cè)3-PBA的常用方法，主要包括高效液相色譜法（HPLC）［13－14］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC－MS）［15－16］和氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC－MS）［17-18］。色譜法雖結(jié)果準(zhǔn)確，但因操作較復(fù)雜、成本較高，難以用于大量樣品的篩查。免疫分析法是基于抗原－抗體特異性識(shí)別原理的分析技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、檢出限低、檢測(cè)成本低、操作簡(jiǎn)便、便攜等特點(diǎn)，適用于大批量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速篩選。針對(duì)食品、環(huán)境中3-PBA 的免疫分析方法主要有酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）和競(jìng)爭(zhēng)性免疫層析技術(shù)。Chuang 等［19］建立了尿樣中代謝物3-PBA 的ELISA 檢測(cè)方法，并與GC－MS 法進(jìn)行比較，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.95，檢出限為0.1 ng/mL，回收率為92%～100%。Wang 等［20］制備了抗擬除蟲菊酯類單克隆抗體，并建立了icELISA 法用于水樣中多種擬除蟲菊酯類代謝物的檢測(cè)，該方法的IC50為0.8 ng/mL，回收率為74%～108%。Kim 等［21］利用納米抗體建立icELISA 方法用于人尿中3-PBA 的檢測(cè)，IC50為1.4 ng/ mL，LOD 為0.1 ng/mL，同時(shí)通過(guò)使用攜帶噬菌體的納米抗體進(jìn)一步建立Phage－icELISA 方法，回收率為80%～112%，檢出限低至0.01 ng/mL，比LC－MS/MS法的靈敏度更高。Liu等［22］獲得了抗3-PBA 的單克隆抗體，并制備出相應(yīng)的試紙條用于河水中3-PBA的檢測(cè)，檢出限為1 μg/mL，反應(yīng)時(shí)間僅10 min。

有關(guān)納米抗體的報(bào)道多為蛋白質(zhì)等大分子，且納米抗體存在體內(nèi)半衰期短等缺點(diǎn)［23］。針對(duì)小分子的駱駝源納米抗體在實(shí)際應(yīng)用中靈敏度較低的情況，Kim等［21］首次用3-PBA半抗原偶聯(lián)甲狀腺球蛋白免疫羊駝，制備得到特異性較好的陽(yáng)性克隆并用于icELISA法檢測(cè)人尿中的3-PBA。本研究在Kim等［21］獲得的3-PBA納米抗體的基礎(chǔ)上，建立了生物素化納米抗體的icELISA方法，從而為3-PBA的快速靈敏檢測(cè)提供了思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

3-PBA 質(zhì)粒為加州大學(xué)戴維斯分校Bruce Hammock 教授饋贈(zèng)；3-PBA（98%，Alfa Aesar 公司）；聚丙烯酰胺溶液（30%，Bio－Rad 公司）；甘油（≥99%，Biosharp 公司）；多聚辣根過(guò)氧化物（HRP）酶標(biāo)記的鏈霉親和素（2～4 μg/mL，polyHRP－SA，Thermo 公司）；HRP 酶標(biāo)記His 標(biāo)簽多克隆抗體（1 mg/mL，上海艾博抗貿(mào)易有限公司）；酵母提取物、胰蛋白胨（分析純，英國(guó)OXOID 公司）；考馬斯亮藍(lán)R－250（≥85%）、吐溫－20（96%）購(gòu)自廣州速研生物公司；咪唑（≥99%）、卵清蛋白（OVA，98%）、牛血清蛋白（BSA，98.6%）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；酶標(biāo)板、96 孔白色發(fā)光板（深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司）；N，N，N，N-四甲基乙烯二胺（98%）、十二烷基磺酸鈉（95%）、過(guò)硫酸銨（≥98%）、甘氨酸（≥99%）購(gòu)自廣州健陽(yáng)生物科技有限公司；葡萄糖（≥99.8%，上海博奧公司）；四環(huán)素（95%）、氨芐青霉素（≥85%）、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG≥99%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；生物素－NHS（85%，天津希恩思生化科技有限公司）。

1.2 3-PBA納米抗體的表達(dá)純化

挑取攜帶pComb3x－3-PBA 納米抗體表達(dá)載體的TOP 10F’大腸桿菌單菌落，接種到10 mL含氨芐青霉素（100 μg/mL）和鹽酸四環(huán)素（100 μg/mL）的LB 培養(yǎng)基（LB－Amp－TC）中搖菌（下文搖菌條件均為37 ℃，250 r/min）過(guò)夜。將過(guò)夜菌擴(kuò)大培養(yǎng)到1 L 的LB－Amp－TC 中，搖菌至OD600nm值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG 溶液（1 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)12 h。菌液離心，棄去上清，加入5 mL TES 溶液（12.1 g Tris，0.093 g EDTA，85.575 g 蔗糖，500 mL 水，鹽酸調(diào)至pH 8.0），攪拌至沉淀完全分散，～80 ℃凍結(jié)，37 ℃解凍，反復(fù)凍融3次。最后一次解凍后加入12 mL純水和3 mL TES溶液，放入搖床10 ℃，180 r/min搖30 min，離心取上清液。上清液加入咪唑－磷酸鹽緩沖溶液（PBS）使咪唑終濃度為10 mmol/L，再加入1 mL Ni－NAT 填料充分混勻后轉(zhuǎn)移到層析柱中，使未與填料結(jié)合的非特異成分流穿。分別用10、20 mmol/L咪唑－PBS洗去未結(jié)合的非特異性成分，再用濃度為50、100、200 mmol/L的咪唑－PBS分別洗脫納米抗體并收集洗脫液。取適量流穿液及不同濃度咪唑洗脫液進(jìn)行SDS－PAGE檢測(cè)。用0.01 mol/L PBS透析納米抗體洗脫液將咪唑除去，超濾管將蛋白溶液濃縮至1 mg/mL以上，-80°C保存。

1.3 3-PBA納米抗體生物素化

稱取5 mg 生物素－NHS 溶于200 μL DMSO，逐滴加入到5 mg 溶于pH 8.0 PBS 緩沖液的納米抗體（生物素與納米抗體的摩爾比為50∶1）中，4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，次日用PBS 透析未反應(yīng)的生物素－NHS。透析結(jié)束后，進(jìn)行icELISA驗(yàn)證生物素化后抗體活性。其余分裝放置－80 ℃冰箱備用。

1.4 基于生物素化納米抗體的icELISA程序

將包被原用碳酸緩沖液稀釋至所需濃度，以100 μL/孔加入酶標(biāo)板中，37 ℃水浴箱靜置過(guò)夜。次日洗滌2 次（每次用300 μL 含吐溫-20 體積分?jǐn)?shù)為0.005%的PBS（PBST）），然后在吸水紙上拍干酶標(biāo)板。加入120 μL/孔蛋白封閉液，37 ℃靜置3 h，然后倒掉孔中液體，在吸水紙上拍干，37 ℃烘干后使用或4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

用PBS將3-PBA納米抗體和3-PBA標(biāo)準(zhǔn)藥物稀釋至所需濃度，酶標(biāo)板中每孔加入50 μL抗體稀釋液以及50 μL 3-PBA標(biāo)準(zhǔn)溶液，37 ℃孵育40 min，洗板5次，拍干。用PBST將polyHRP-SA 稀釋至合適濃度，每孔加100 μL，37 ℃孵育30 min，洗板5 次，拍干。TMB 顯色液A 液和B 液等體積混勻后，每孔加100 μL，37 ℃反應(yīng)10 min，然后每孔加入50 μL終止液（10%H2SO4），用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔的吸光值（A450nm）。

1.5 icELISA條件的優(yōu)化

采用棋盤滴定法，分別對(duì)包被原和抗體進(jìn)行稀釋（包被原質(zhì)量濃度為500、250、125、62.5 ng/mL；抗體稀釋倍數(shù)為1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000，體積比），用icELISA 法測(cè)定3-PBA 質(zhì)量濃度為0的條件下各抗原抗體濃度組合的A450nm，選擇A450nm在1～1.5之間的抗原抗體稀釋組合，用icELISA 檢測(cè)不同3-PBA 濃度下的A450nm，用Logistics 函數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出各個(gè)不同抗原抗體濃度組合下的IC50和最大吸光值A(chǔ)max。

配制不同pH 值（5.4、6.4、7.4、8.4、9.4），不同PO3-4濃度（10、20、40、60、80 mmol/L），不同吐溫（Tween－20）體積分?jǐn)?shù)（0.005%、0.01%、0.025%、0.05%）的PBS用于稀釋納米抗體和3-PBA標(biāo)準(zhǔn)藥物。在優(yōu)化的緩沖液條件下，將polyHRP－SA稀釋不同倍數(shù)（1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000、1∶7 000，體積比），用icELISA 法檢測(cè)不同濃度3-PBA 下的A450nm，用Logistics 函數(shù)擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出各不同抗原抗體濃度組合下的IC50和最大吸光值A(chǔ)max。

綜合考慮Amax/IC50值較大且曲線擬合度較好的條件為優(yōu)化條件。

1.6 樣品前處理

將環(huán)境水樣品（湖水、水庫(kù)水、自來(lái)水、飲用水）以8 000 r/min離心20 min，0.22 μm水系濾膜過(guò)濾后直接用于測(cè)定。

2 mL人尿液樣品用0.22 μm濾膜過(guò)濾后加400 μL 6 mol/L HCl，100 ℃水解1 h；加入4 mL pH 4.5的0.2 mol/L醋酸鈉緩沖液進(jìn)行中和，再加入6 mol/L NaOH調(diào)至pH 4.0左右。用C8固相萃?。⊿PE）柱純化水解后的尿液樣品，具體操作如下：空柱依次加入2 mL 甲醇、2 mL ddH2O 以及2 mL 醋酸鈉緩沖液（0.2 mol/L，pH 4.0）活化SPE柱；向SPE柱中加入2 mL水解后的尿樣；向SPE柱中依次加入3 mL ddH2O、3 mL甲醇洗滌雜質(zhì)，真空干燥10 min；用正己烷－乙酸乙酯（7∶3）加1%醋酸配成洗脫液，用3 mL洗脫液洗脫SEP柱上的3-PBA。洗脫液氮吹至近干后，用2 mL含10%甲醇的PBS復(fù)溶，－20°C保存。

2 結(jié)果與討論

2.1 3-PBA納米抗體制備及生物素化后活性表征

3-PBA 納米抗體經(jīng)Ni-NAT 純化后的SDS－PAGE 結(jié)果如圖1 所示，控制上樣體積一致時(shí)，200 mmol/L 咪唑洗脫液的條帶明顯深于50 mmol/L和100 mmol/L時(shí)，說(shuō)明用200 mmol/L 咪唑洗脫納米抗體的效果最佳；同時(shí)，由于抗3-PBA 納米抗體的等電點(diǎn)在8.1 附近，為避免納米抗體在純化過(guò)程中沉淀，需將洗脫液pH值調(diào)至遠(yuǎn)離等電點(diǎn)。因此選擇pH 7.4的200 mmol/L咪唑溶液為洗脫液。

圖1 經(jīng)Ni－NAT純化后3-PBA納米抗體的SDS－PAGEFig.1 SDS－PAGE image of 3-PBA nanobody purified by Ni－NAT

生物素化后的納米抗體用polyHRP-SA作為酶標(biāo)物進(jìn)行icELISA 檢測(cè)，當(dāng)包被質(zhì)量濃度為125 ng/mL，納米抗體的工作質(zhì)量濃度為500 ng/mL 時(shí)，在1 μg/mL 3-PBA 標(biāo)準(zhǔn)溶液中的抑制率為92.2%，說(shuō)明3-PBA 納米抗體生物素化成功。

2.2 icELISA反應(yīng)條件的優(yōu)化及優(yōu)化條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線

本研究所建立的方法示意圖如圖2A 所示?？乖粷舛取⒕彌_液離子濃度、pH 值、吐溫濃度、二抗稀釋倍數(shù)等條件是icELISA 方法的穩(wěn)定性與靈敏度的重要影響因素，因此需優(yōu)化上述因素以確定最佳的icELISA實(shí)驗(yàn)條件。

2.2.1 icELISA 抗原、抗體濃度組合的優(yōu)化 選定的包被原和抗體濃度范圍內(nèi)，當(dāng)包被原濃度越高，A450nm達(dá)到1.0～1.5時(shí)所需的抗體稀釋倍數(shù)越小，反之亦然。一方面，減少包被原濃度有利于3-PBA 與包被原競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)；另一方面，減少抗體濃度有利于抗體與相對(duì)低濃度的3-PBA充分結(jié)合，從而提高檢測(cè)靈敏度。但由于A450nm達(dá)到1.0～1.5之間的抗原、抗體濃度呈此消彼長(zhǎng)的關(guān)系，因此必須進(jìn)一步通過(guò)3-PBA抑制曲線來(lái)選擇最優(yōu)條件。選擇包被原質(zhì)量濃度（ng/mL）－抗體稀釋倍數(shù)為500－1∶4 000，250－1∶3 000，125－1∶2 000，62.5－1∶500的條件測(cè)定3-PBA的抑制曲線。

如圖2B 所示，在包被原質(zhì)量濃度從500 ng/mL 降低到125 ng/mL 的過(guò)程中，IC50值呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，說(shuō)明靈敏度增強(qiáng)；而當(dāng)包被原質(zhì)量濃度降低到62.5 ng/mL后，IC50值突然激增。從Amax/IC50值亦能看出，當(dāng)包被原質(zhì)量濃度為125 ng/mL，抗體稀釋2 000倍時(shí)，其比值最大。

圖2 基于生物素化納米抗體icELISA方法的示意圖及實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化Fig.2 Illustration of the biotinylated nanobody based icELISA for 3-PBA and the optimization for experimental conditions

2.2.2 緩沖液pH 值的優(yōu)化 抗體為具有活性的蛋白因子，pH 值過(guò)高或過(guò)低均會(huì)對(duì)其活性造成影響，也會(huì)影響抗體和藥物的溶解度。本文選定pH 值分別為5.4、6.4、7.4、8.4、9.4的PBS 作為反應(yīng)體系測(cè)定3-PBA抑制曲線，結(jié)果如圖2C所示。在pH 6.4左右，Amax/IC50值達(dá)到最大。

2.2.3 緩沖液離子濃度優(yōu)化 離子濃度對(duì)icELISA 反應(yīng)有重要影響，本實(shí)驗(yàn)分別選定10、20、40、60 mmol/L 等一系列磷酸鹽濃度的PBS 作為反應(yīng)體系測(cè)定3-PBA 的抑制曲線。如圖2D 所示，隨著離子濃度的上升，Amax值呈下降趨勢(shì)，IC50值先降后升，當(dāng)離子濃度為40 mmol/L 時(shí)，Amax/IC50值最高，說(shuō)明此時(shí)icELISA反應(yīng)的靈敏度最大。

2.2.4 吐溫濃度的優(yōu)化 為研究吐溫－20含量對(duì)icELISA 法靈敏度的影響，本實(shí)驗(yàn)在PBS中添加不同體積分?jǐn)?shù)（0.005%、0.01%、0.025%、0.05%）的吐溫－20。結(jié)果顯示，當(dāng)吐溫－20 的體積分?jǐn)?shù)為0.005%時(shí)Amax/IC50值最高。因此，選擇在PBS中添加0.005%吐溫－20。

2.2.5 polyHRP－SA 稀釋倍數(shù)的優(yōu)化 在確定3-PBA 納米抗體的最佳稀釋倍數(shù)和包被濃度后，polyHRP－SA 和前者反應(yīng)的量也需優(yōu)化。用上述確定的最優(yōu)緩沖液條件將polyHRP－SA 分別按照1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000、1∶6 000和1∶7 000倍（體積比）稀釋后進(jìn)行icELISA 檢測(cè)。結(jié)果顯示，當(dāng)稀釋倍數(shù)為1∶4 000時(shí)，Amax/IC50值最高。因此，選擇polyHRP－SA的最佳稀釋倍數(shù)為1∶4 000。

按照上述優(yōu)化條件，得到本實(shí)驗(yàn)的最佳icELISA 反應(yīng)條件：3-PBA－BSA 包被質(zhì)量濃度為125 ng/mL，3-PBA 納米抗體稀釋倍數(shù)為1∶2 000，反應(yīng)緩沖液體系為pH 6.4，離子濃度為40 mmol/L，吐溫－20體積分?jǐn)?shù)為0.005%的PBST溶液，二抗稀釋倍數(shù)為1∶4 000。

2.3 線性范圍及檢出限

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用質(zhì)量濃度分別為200、40、8、1.6、0.32、0.064、0.012 8 ng/mL的3-PBA系列標(biāo)準(zhǔn)溶液建立icELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)擬合得到該標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50為1.7 ng/mL，線性范圍為0.37～7.4 ng/mL（見(jiàn)圖3）。檢出限定義為抑制率10%對(duì)應(yīng)的待測(cè)物濃度（IC10），經(jīng)計(jì)算，得到LOD（即IC10）為0.15 ng/mL。

圖3 優(yōu)化條件下3-PBA的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of 3-PBA under the optimized conditions

2.4 樣品基質(zhì)效應(yīng)的消除

2.4.1 人尿樣品 采集4 個(gè)來(lái)源于不同人的尿液（陰性），過(guò)0.22 μm 濾膜后用pH 6.4 的40 mmol/L PBST 進(jìn)行1、2、4、8 倍稀釋后，分別用于稀釋3-PBA 標(biāo)準(zhǔn)藥物，同時(shí)用PBST稀釋3-PBA 標(biāo)準(zhǔn)藥物作為對(duì)照組，分別進(jìn)行icELISA 測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，人尿液樣品通過(guò)0.22 μm 濾膜過(guò)濾后，需稀釋20 倍才能消除基質(zhì)干擾，方法的靈敏度降低。圖4A為濾膜過(guò)濾后，不同稀釋倍數(shù)對(duì)其中一尿液樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響。

為了優(yōu)化前處理方法，尿樣先經(jīng)過(guò)高溫酸水解，然后用SPE 柱進(jìn)行純化和富集，再進(jìn)行稀釋。由圖4B 可知，經(jīng)過(guò)酸水解和SPE 純化的尿樣僅需稀釋8 倍后的標(biāo)準(zhǔn)曲線與PBST 標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合，即稀釋8 倍可消除基質(zhì)效應(yīng)。與直接過(guò)膜稀釋相比，酸水解和SPE 純化的前處理方法能顯著提高實(shí)際樣品的檢測(cè)靈敏度。

圖4 不同樣品前處理方法對(duì)人尿樣品基質(zhì)效應(yīng)的影響Fig.4 Influence of different sample pretreatment methods on matrix effect of a human urine sample

2.4.2 水樣品 取4 種不同環(huán)境水樣（湖水、水庫(kù)水、自來(lái)水、飲用水）經(jīng)離心、過(guò)濾膜處理后，用pH 6.4的40 mmol/L PBST 進(jìn)行1、2、4倍稀釋后，分別用于稀釋3-PBA 標(biāo)準(zhǔn)藥物，同時(shí)用PBST 稀釋3-PBA 標(biāo)準(zhǔn)藥物作為對(duì)照組，分別進(jìn)行icELISA 測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，環(huán)境水樣品稀釋不同倍數(shù)后，其標(biāo)準(zhǔn)曲線與PBST標(biāo)準(zhǔn)曲線高度重合，說(shuō)明環(huán)境水樣品基質(zhì)效應(yīng)較小，不會(huì)對(duì)樣品檢測(cè)造成干擾。因此，環(huán)境水樣品經(jīng)離心、過(guò)膜處理后，無(wú)需稀釋即可直接用于icELISA檢測(cè)。

2.5 加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

采集人尿、湖水、水庫(kù)水、自來(lái)水和飲用水共8種陰性空白樣品，在本方法的線性范圍內(nèi)選擇低、中、高3 個(gè)加標(biāo)水平，按優(yōu)化方法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每種樣品測(cè)定3 次，取平均值。測(cè)得人尿樣品的加標(biāo)回收率為87.6%～97.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.2%～10%；環(huán)境水樣品的加標(biāo)回收率為78.0%～127%，RSD為0.83%～9.3%（見(jiàn)表1）。

表1 icELISA對(duì)實(shí)際樣品中3-PBA的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recoveries and RSDs of 3-PBA in actual samples by icELISA

3 結(jié) 論

本研究在前期獲得的抗3-PBA 納米抗體的基礎(chǔ)上，以pComb3X－3-PBA 表達(dá)載體制備3-PBA 納米抗體并進(jìn)行生物素化。所得生物素化納米抗體以多聚HRP 標(biāo)記的鏈霉親和素為酶標(biāo)物建立了3-PBA 的icELISA 分析方法，優(yōu)化了包被源濃度、抗體濃度、反應(yīng)緩沖體系中離子濃度、pH 值、多聚HRP標(biāo)記鏈霉親和素稀釋倍數(shù)等參數(shù)。最優(yōu)條件下，3-PBA的檢出限為0.15 ng/mL，IC50為1.7 ng/mL，線性范圍為0.37～7.4 ng/mL。8 種實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率為78.0%～127%，RSD 均不大于10%。該方法的準(zhǔn)確性高、操作簡(jiǎn)便，可作為擬除蟲菊酯類農(nóng)藥使用的暴露評(píng)價(jià)。