陸偉輝， 劉 威， 王 聰， 王正林

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院普外科，上海 201700；

2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院普外科，上海 200032）

CXC類趨化因子受體2（C-X-C motif chemokine receptor，CXCR2）是促炎趨化因子的主要受體，主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及內(nèi)皮細(xì)胞[1-3]。其與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Robinson等[4]研究顯示，CXCR2促進(jìn)腦腫瘤的生長及進(jìn)展。CXCR2活化促進(jìn)乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移[5]。既往研究顯示CXCR2在胃癌組織中高表達(dá)，是胃癌病人的獨(dú)立不良預(yù)后因素[6-8]，但其作用機(jī)制仍不明確。本研究旨在探索CXCR2對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、遷移和凋亡的影響。

材料與方法

一、材料

胎牛血清 （批號(hào)：16000-044）、Trizol試劑 （批號(hào)：15596-026）、Optim-MEM 培養(yǎng)基 （批號(hào)：51985-034）均購自美國Gibco公司。RPMI-1640培養(yǎng)基（批號(hào)：R8758）購自Sigma公司。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8，批號(hào)：C0038）購自 Beyotime公司。 CXCR2 siRNA（批號(hào)：AM16708）和 Lipofectamine 2000 購自Invitrogen公司。膜聯(lián)蛋白Ⅴ（AnnexinⅤ）/碘化丙啶（propidium iodide,PI）凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：556547）購自BD Pharmingen公司。白細(xì)胞介素8（interleukin 8,IL-8）ELISA試劑盒（批號(hào)：D8000C）購自R&D公司。CXCR2抗體（批號(hào)：ab14935）購自Abcam公司。Transwell侵襲小室（批號(hào)：3422）購自美國Costar公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人胃癌細(xì)胞SGC-7901、MGC80-3購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院。所有細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

三、蛋白質(zhì)印跡法

收集細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）分離，恒流300 mA轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride,PVDF）膜。磷酸緩沖鹽溶液（phosphatebuffersaline,PBS）洗滌膜3次，每次5min，加入適當(dāng)比例稀釋的一抗，4℃過夜。去除洗滌液，立即加入稀釋的二抗，搖擺床上室溫培養(yǎng)2 h。結(jié)束后去除洗滌液，PBS中洗滌3次，每次10 min。取電化學(xué)發(fā)光 （electrochemilumine scence,ECL）試劑加膜上，約1 min，使用計(jì)算機(jī)自動(dòng)顯影系統(tǒng)（ImageQuant LAS 4000 mini）進(jìn)行顯影。

四、熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)

取慢病毒感染后的胃癌細(xì)胞培養(yǎng)72 h，待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)收集細(xì)胞。用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，按說明書操作?？俁NA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm與280 nm處吸光度（A）值，A260/A280為1.9～2.1。每份樣品中取3 μg RNA行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取 1 μL cDNA行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）擴(kuò)增。CXCR2上游引物： 5′-CCTACAACCTGGTCCTGCTG-3′, 下游引物： 5′-TGAGGCAGCTGTGAAGGATG-3′；IL-8 上游引物： 5′-ACACTGCGCCAACACAGAAA-3′，下游引物：5′-AACCCTCTGCACCCAGTTT-3′；GAPDH 上游引物： 5′-CCAAAATCAAGTGGGGCGA-3′, 下游引物：5′-TGATGACCCTTTTGGCTCCC-3′。

五、建立CXCR2過表達(dá)細(xì)胞系

CXCR2過表達(dá)的慢病毒購自吉瑪基因公司。轉(zhuǎn)染的前1天，以每孔約2×105個(gè)細(xì)胞預(yù)先將細(xì)胞接種到6孔板中；第2天，用含有聚凝胺（polybrene）的培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入適量的慢病毒懸液，混勻后37℃溫箱培養(yǎng)過夜。第3天，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋polybrene，再次37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。接著第3～4天繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長情況傳代，采用嘌呤霉素篩選，同時(shí)繼續(xù)傳代。篩選出帶有抗性的細(xì)胞為成功轉(zhuǎn)染細(xì)胞。

六、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

CXCR2 siRNA及對(duì)照序列均購自Invitrogen公司，采用Lipofectamine 2000試劑盒。轉(zhuǎn)染前1 d，乙二胺四乙酸 （ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA）消化細(xì)胞后，將細(xì)胞加入6孔板中，轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度90%為宜。無血清、無抗體的Optim-MEM培養(yǎng)基中加入DNA 2 μg。采用該細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋4 μL Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，混勻后室溫放置30 min?；旌仙鲜鰞煞N溶液后，加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)孔中，輕輕搖勻后室溫放置5 min，放入37℃溫箱培養(yǎng)過夜。第2天從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，將培養(yǎng)基換成含血清培養(yǎng)基，保溫24～72 h后準(zhǔn)備蛋白質(zhì)印跡法表型驗(yàn)證。

七、transwell侵襲遷移實(shí)驗(yàn)

將細(xì)胞接種于含人工基質(zhì)Matrigel的transwell小室中。37℃、5% CO2條件下培養(yǎng) 24～48 h后，取出transwell小室。用棉簽擦去Matrigel膠上和上室中的細(xì)胞，使用結(jié)晶紫染色。顯微鏡觀察、拍照。同一實(shí)驗(yàn)處理?xiàng)l件設(shè)置3個(gè)平行孔，每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算染色細(xì)胞數(shù)。

八、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

EDTA消化制備細(xì)胞懸液，以每孔約5 000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板。同一實(shí)驗(yàn)因素設(shè)置3個(gè)平行孔。37℃培養(yǎng)，此時(shí)設(shè)置為基線0 h的細(xì)胞活性，給予相應(yīng)的干擾因素后培養(yǎng)，相應(yīng)時(shí)間節(jié)點(diǎn)行細(xì)胞活性檢測(cè)。每孔加入10 μL CCK8試劑，混勻后培養(yǎng)1 h。測(cè)定450 nm吸光度，結(jié)果設(shè)置為（A），對(duì)照波長設(shè)置為630 nm。計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)增殖活性=（Ax h-A空白對(duì)照）/（A0 h-A空白對(duì)照）。

九、細(xì)胞凋亡檢測(cè)

用EDTA消化胃癌細(xì)胞。用PBS洗滌3次懸浮細(xì)胞。PBS重新懸浮細(xì)胞1次。2 000 r/min（離心半徑9 cm）離心5 min后再次洗滌，調(diào)整細(xì)胞密度為106。取100 μL細(xì)胞懸液進(jìn)行標(biāo)記，加入5 μL的AnnexinⅤ-FITC。充分混勻后，在避光條件室溫下 15 min。流式檢測(cè)前加入5 μL的PI，上機(jī)檢測(cè)前再加200 μL緩沖液。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。根據(jù)細(xì)胞染色情況，確定活細(xì)胞為PI-/FITC AnnexinⅤ-，壞死細(xì)胞為PI+/FITC AnnexinⅤ-，早期凋亡細(xì)胞為PI-/FITC AnnexinⅤ+，晚期凋亡細(xì)胞為PI+/FITC AnnexinⅤ+。

十、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

CXCR2上調(diào)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照組為vector，實(shí)驗(yàn)組為CXCR2；CXCR2下調(diào)實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組使用siRNA來沉默RNA表達(dá)，為siCXCR2，對(duì)照組使用試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照序列，為siScr。數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0軟件。組間均數(shù)比較，Student t檢驗(yàn)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CXCR2促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲，提高增殖活性

在胃癌細(xì)胞穩(wěn)定過表達(dá)或瞬時(shí)下調(diào)CXCR2的表達(dá)后（見圖1），檢測(cè)CXCR2的表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖活力及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

胃癌細(xì)胞上調(diào)CXCR2后 （MGC80-3細(xì)胞系見圖 1A、C，SGC-7901 細(xì)胞系見圖 1B、D），transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力較對(duì)照細(xì)胞顯著增強(qiáng) （MGC80-3 細(xì)胞見圖 2A、B、C，P=0.02；SGC-7901 細(xì)胞見圖 2D、E、F，P=0.01）。相反，筆者以小干擾RNA（siRNA）干擾細(xì)胞CXCR2的表達(dá)，CXCR2蛋白表達(dá)下調(diào) （MGC80-3細(xì)胞系見圖1A、C，SGC-7901細(xì)胞系見圖1B、D）。CXCR2下調(diào)后，胃癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力受到顯著抑制（MGC80-3細(xì)胞見圖 3A、B、C，P=0.01；SGC-7901 細(xì)胞見圖 3D、E、F，P=0.01）。CCK8實(shí)驗(yàn)證實(shí)胃癌細(xì)胞系中CXCR2上調(diào)后增殖活性顯著增強(qiáng)（見圖 4 A、C，P＜0.01），CXCR2 表達(dá)下調(diào)后胃癌細(xì)胞系增殖活性顯著下降（見圖4B、D，P＜0.01）。

圖1 胃癌細(xì)胞穩(wěn)定過表達(dá)CXCR2的構(gòu)建及采用RNA干擾技術(shù)下調(diào)CXCR2表達(dá)

圖2 胃癌細(xì)胞上調(diào)CXCR2表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響

圖3 胃癌細(xì)胞干擾下調(diào)CXCR2表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲、遷移的影響

二、CXCR2過表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞凋亡

通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)過表達(dá)胃癌細(xì)胞CXCR2，通過轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾胃癌細(xì)胞CXCR2的表達(dá)，以流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞在無化療藥物、無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的凋亡情況。結(jié)果顯示，上調(diào)CXCR2表達(dá)后胃癌細(xì)胞的凋亡率顯著低于對(duì)照細(xì)胞（見圖 4 E～H,P＜0.01）；下調(diào) CXCR2 表達(dá)后，細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照細(xì)胞（見圖4 I～L,P=0.02）。上述結(jié)果說明，在無藥物誘導(dǎo)時(shí)，胃癌細(xì)胞CXCR2的表達(dá)可抑制凋亡，維持胃癌細(xì)胞的生存。

圖4 上調(diào)或干擾胃癌細(xì)胞CXCR2表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡的影響

三、胃癌CXCR2增強(qiáng)Akt磷酸化、上調(diào)Bcl-2抑制胃癌細(xì)胞凋亡

檢測(cè)穩(wěn)定過表達(dá)CXCR2細(xì)胞內(nèi)Akt、Erk等與胃癌進(jìn)展密切相關(guān)分子的表達(dá)量及其磷酸化情況。結(jié)果顯示，CXCR2過表達(dá)可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞Akt磷酸化水平顯著上調(diào)，而Erk的磷酸化水平無顯著改變（見圖5A、C）。對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bcl-XL及存活蛋白（survivin）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Akt磷酸化水平與凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)水平一致，而Bcl-XL和存活蛋白表達(dá)量不受CXCR2影響（見圖5B、D）。

圖5 胃癌細(xì)胞CXCR2過表達(dá)抑制凋亡的機(jī)制

討 論

19世紀(jì)，Virchow首次描述炎癥與癌癥之間的關(guān)聯(lián)[9]。多種類型的癌癥起病過程中均有慢性炎癥參與其中，其中趨化因子在將白細(xì)胞誘導(dǎo)至炎癥和腫瘤所在部位的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[10-12]。促炎趨化因子參與慢性炎癥進(jìn)程及腫瘤微環(huán)境的形成。一個(gè)典型的例子是腫瘤部位分泌的IL-8通過趨化表達(dá)CXCR2的中性粒細(xì)胞向腫瘤部位遷移，后者參與腫瘤微環(huán)境分泌一系列生長因子及基質(zhì)金屬蛋白酶類，促使腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移[13]。

趨化因子是細(xì)胞因子中一大類具有化學(xué)趨化作用的蛋白質(zhì)。按照其二級(jí)結(jié)構(gòu)中的N端氨基酸殘基主要分 4大類：C、CC、CXC、CX3C類。 C類 N端僅有1個(gè)半胱氨酸；CC類N端不插入其他氨基酸殘基；CXC類N端2個(gè)半胱氨酸殘基中插入1個(gè)其他氨基酸殘基；CX3C類N端插入3個(gè)其他氨基酸殘基。趨化因子發(fā)揮多種功能，其配體主要結(jié)合相應(yīng)的受體，激活下游信號(hào)通路，發(fā)揮功能。其受體屬于G蛋白偶聯(lián)的7次跨膜受體，根據(jù)其結(jié)合的趨化因子配體類型進(jìn)行分類。目前發(fā)現(xiàn)1種C類趨化因子受體 （XCR1）、11種CC類趨化因子受體（CCR1～11）和6種CXC類趨化因子受體（CXCR1～6）。多項(xiàng)研究顯示，CXC類趨化因子受體在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[14-15]。1991年，CXCR2從人中性粒細(xì)胞系克隆獲得。其與CXCR1都屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，在氨基酸組成水平上CXCR2與CXCR1的同源度達(dá)到78%，兩者均可結(jié)合IL-8發(fā)揮生物學(xué)作用[16-17]。同時(shí)兩者的分布特點(diǎn)類似。但兩者在生物學(xué)功能上仍存在差異。CXCR1的配體主要為IL-8及CXCL6。相比CXCR1，CXCR2 有多個(gè)配體，包括 CXCL 1～3、CXCL 5～8[18]。CXCR2的生物學(xué)功能可能更復(fù)雜。筆者既往研究發(fā)現(xiàn)，CXCR2在胃癌組織中較相應(yīng)正常胃黏膜組織中過表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，CXCR2高表達(dá)與胃癌進(jìn)展呈正相關(guān)，并預(yù)示病人預(yù)后差[8]。在誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞趨化參與血管形成的過程中，CXCR2是發(fā)揮介導(dǎo)作用最主要的趨化因子受體[19]。所有具有ELR基序的CXC趨化因子均可通過結(jié)合CXCR2介導(dǎo)血管形成，而血管形成是腫瘤細(xì)胞增殖的重要條件[20]。Heidemann等[3]研究發(fā)現(xiàn)，CXCL8結(jié)合并激活CXCR2后，內(nèi)皮細(xì)胞的纖維聚合能力、增殖能力以及細(xì)胞內(nèi)下游信號(hào)分子ERK1/2磷酸化能力均顯著增強(qiáng)。在以CXCR2特異性抗體或ERK1/2抑制劑處理細(xì)胞后，上述增強(qiáng)作用消失。通過敲除小鼠CXCR2基因構(gòu)建的角膜微囊袋模型也證實(shí)CXCR2在血管生成過程中的重要作用[20]。胃癌病人中CXCR2的異常表達(dá)及高表達(dá)者生存預(yù)后相對(duì)較差，可能與CXCR2誘導(dǎo)腫瘤血管形成有關(guān)。因此，本研究對(duì)CXCR2在胃癌中的表達(dá)及功能進(jìn)行探索。通過穩(wěn)定上調(diào)胃癌細(xì)胞株中CXCR2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CXCR2高表達(dá)后胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力顯著增強(qiáng)，而下調(diào)CXCR2后胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力被顯著抑制。

本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CXCR2后，胃癌細(xì)胞凋亡顯著減少，而下調(diào)CXCR2后胃癌細(xì)胞的凋亡明顯增強(qiáng)。既往研究發(fā)現(xiàn)凋亡抑制蛋白Bcl-2在胃癌發(fā)生中起著重要作用[21]。通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CXCR2抑制胃癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制在于CXCR2使細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化水平升高，繼而使抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)上調(diào)。研究顯示，在卵巢癌中CXCR2通過抑制p53的磷酸化激活Bcl-XL及Bcl-2，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡[22]。本研究發(fā)現(xiàn)CXCR2過表達(dá)是通過增強(qiáng)Akt磷酸化進(jìn)而激活Bcl-2高表達(dá)從而抑制凋亡。這可能與不同腫瘤、不同細(xì)胞系有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)CXCR2表達(dá)增強(qiáng)胃癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和抗凋亡能力。胃癌細(xì)胞中CXCR2的抗凋亡能力與CXCR2/Akt/Bcl-2通路相關(guān)。