相關巨噬細胞對肝癌SMCC-7721 細胞遷移侵襲的影響及其機制研究

李琳 李建東 高志康 徐浩 崔艷峰

原發(fā)性肝細胞癌(HCC)是人類最具侵襲性的高度惡性腫瘤,因為它的侵襲、轉移能力,被列為癌癥相關死亡的最常見原因之一［1,2］。伴隨免疫學、分子生物學的發(fā)展,肝癌在免疫治療方面已經(jīng)取得了很大的進展,但高復發(fā)率仍然是延長生存期的一個主要障礙。HCC 是一種與慢性炎癥相關的腫瘤。在肝細胞癌的炎癥微環(huán)境中,入侵的炎癥細胞主要是腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages,TAMs)［3］。研究表明,巨噬細胞的去除可以抑制腫瘤的進展和轉移［4-6］。在腫瘤微環(huán)境下,研究巨噬細胞在腫瘤細胞侵襲轉移中的分子機制［7］,將為治療HCC 提供新的策略。為此,本研究通過分化巨噬細胞作用肝癌SMCC-7721 細胞,探究相關巨噬細胞與SMCC-7721 細胞增殖、遷移、侵襲的生物學關系,為揭示HCC 的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 人單核巨噬細胞(THP-1)獲自中國科學院細胞庫。人肝癌細胞SMCC-7721 細胞為本室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)單核巨噬細胞 THP-1 在RPMI-1640 培養(yǎng)基(Sangon Biotech)中培養(yǎng),該培養(yǎng)基含10%胎牛血清(FBS,Sangon Biotech)和1%青霉素/鏈霉素。細胞在37℃和5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.2 巨噬細胞的極化 取處于對數(shù)生長期、生長狀態(tài)良好的THP-1,按2×104/孔接種于24 孔板共培小室上室中。50 mg/ml 的MCSF 作用24 h 后誘導THP-1分化為M0 巨噬細胞；100 ng/ml 脂多糖(LPS)和γ-干擾素(IFN-γ)處理24 h,誘導THP-1 向M1 型巨噬細胞分化。THP-1 與IL-4(20 mg/ml)共孵育24 h 分化為M2 型巨噬細胞。THP-1 在含50% HepG2 細胞上清液和10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d,誘導分化為TAMs。

1.2.3 細胞培養(yǎng) SMCC-7721 細胞接種于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基,37℃和5% CO2的環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2.4 免疫印跡 使用組總蛋白提取試劑盒(Sangon Biotech)從細胞中提取總蛋白。通過蛋白質電泳分離不同樣品中的等效蛋白,然后轉化到硝酸纖維素膜(NC)上。用一抗于4℃孵育過夜,浸泡于封閉緩沖液中。用TBST 洗膜數(shù)次后,用標記有辣根過氧化物酶的二抗與膜共孵育。用ImageJ 軟件檢測蛋白條帶的灰度值。

1.2.5 MTT 分析 SMCC-7721 細胞與1.2.2 極化的巨噬細胞的上清孵育。隨后,將SMCC-7721 細胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基中,調整細胞密度至10 ml。將細胞懸浮液接種于96 孔板中,每孔懸浮液100 μl,培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μl MTT(5 mg/ml),37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。然后,去除細胞上清,加入DMSO(100 μl)混勻于每孔中。采用酶標儀在490 nm 波長下檢測樣品的吸光度。

1.2.6 Transwell 分析 SMCC-7721 細胞與1.2.2 極化的巨噬細胞上清孵育24 h。隨后,使用孔徑為8 μm 的聚碳酸酯膜(Corning)24 孔Boyden 室進行實驗。用無血清培養(yǎng)基將基質稀釋至1 mg/ml,蓋于Boyden chambers上腔室。然后將SMCC-7721 細胞懸液(5×104)接種到上室；下腔中加入含10%胎牛血清的600 μl 新鮮培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h 后,取出小室,4%多聚甲醛固定30 min,0.5%結晶紫染色20 min。用干凈的棉球將上室一側的未遷移的細胞擦干凈,晾干,在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)細胞。細胞遷移實驗除Transwell 小室不包被基質膠外,其余操作同侵襲實驗。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標準差()表示,采用t檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 四種巨噬細胞對SMCC-7721 細胞增殖能力的影響 四種巨噬細胞上清液與SMCC-7721 細胞共培養(yǎng)12 h、24 h 進行MTT 實驗結果如圖1 所示,相較于M0組,M1 組的SMCC-7721 細胞減少,M2 和TAMs 組的SMCC-7721 細胞增殖能力明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明,M1 巨噬細胞抑制SMCC-7721 細胞增殖,M2 巨噬細胞和TAMs 促進SMCC-7721 細胞增殖。

圖1 四種巨噬細胞對SMCC-7721 細胞增殖能力的影響

2.2 四種巨噬細胞上清液對SMCC-7721 細胞遷移能力的影響 四種巨噬細胞上清液與SMCC-7721 細胞共培養(yǎng)后進行Transwell 實驗。結果如圖2(A)所示,相較于M0 組,M1 組的SMCC-7721 細胞遷移能力減弱,M2 和TAMs 組的SMCC-7721 細胞遷移能力明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明,M1 巨噬細胞可抑制SMCC-7721 細胞遷移能力,M2 巨噬細胞和TAMs 促進SMCC-7721 細胞遷移能力。

圖2 四種巨噬細胞對SMCC-7721 細胞遷移能力的影響

2.3 四種巨噬細胞上清液對SMCC-7721 細胞侵襲能力的影響 Transwell 實驗結果如圖3(A)所示,相較于M0 組,M1 組的SMCC-7721 細胞侵襲能力減弱,M2 和TAMs 組的SMCC-7721 細胞侵襲能力明顯增強,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由此表明,M1 巨噬細胞可抑制SMCC-7721 細胞侵襲能力,M2 巨噬細胞和TAMs促進SMCC-7721 細胞侵襲能力。

圖3 四種巨噬細胞對SMCC-7721 細胞侵襲能力的影響

2.4 Western blot 檢測四種巨噬細胞上清液對上皮間質轉化EMT 標記蛋白表達的影響 Western blot 檢測結果顯示,與M0 組相比,M1 組的E-cadherin 表達升高,N-cadherin 和Vimentin 表達下降；M2 和TAMs 組的E-cadherin 表達下降,N-cadherin 和Vimentin 表達升高。這說明M1 巨噬細胞抑制SMCC-7721 細胞發(fā)生EMT,M2 巨噬細胞和TAMs 能夠誘導SMCC-7721 細胞發(fā)生EMT。見圖4。

圖4 Western blot 檢測四種巨噬細胞與SMCC-7721 細胞對EMT 標記蛋白E-cadherin、N-cadherin 和Vimentin 的表達

4 討論

肝癌是全球第五大常見癌癥,是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大惡性腫瘤［8］。盡管近年來肝癌的診斷和治療均取得極大進展,但肝癌患者的預后仍然很差。肝內復發(fā)和轉移是肝癌治療的主要挑戰(zhàn),也是導致肝癌患者的預后不良主要原因［9,10］。因此,尋找新的治療肝癌復發(fā)和轉移方案是至關重要的。

HCC 是一種與慢性炎癥相關的腫瘤。在肝細胞癌的炎癥微環(huán)境中,入侵的炎癥細胞主要是TAMs。免疫學研究表明,巨噬細胞有兩種表型：M1 和M2。在腫瘤微環(huán)境中,巨噬菌體可以通過各種細胞因子(如IL-4 和IL-10)的刺激極化成M2 巨噬細胞。M1 巨噬細胞具有病原體清除和抗腫瘤活性的特點。相比之下,M2 巨噬細胞的主要功能是免疫抑制和促進腫瘤進展、新生血管和組織基質重構［11］。此外,TAMs 通過釋放生長因子、細胞因子、趨化因子和蛋白酶在HCC 的各個階段發(fā)揮著重要作用［12］。動物實驗表明,巨噬細胞的去除可以抑制腫瘤的進展和轉移。在我們的前期研究發(fā)現(xiàn),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素M1 巨噬細胞中高度表達,白介素-10(IL-10)的表達和白介素-13(IL-13)在M2 巨噬細胞明顯上調。M0 巨噬細胞為非極化巨噬細胞,各種細胞因子的表達不會像極化巨噬細胞那樣有明顯的偏置。M1 型巨噬細胞產(chǎn)生大量的細胞因子,如白介素-12(IL-12)和TNF-α。M1 巨噬細胞IL-10 表達降低,表現(xiàn)出明顯的促炎活性［13］。然而,M2 巨噬細胞高表達IL-10,而IL-12 下調,賦予了強大的抗炎特性［14］。因此,與M0 巨噬細胞相比,M2巨噬細胞和TAMs 中IL-12 和TNF-α 的表達降低［15］,TAMs 表現(xiàn)出M2 樣表型。

本研究發(fā)現(xiàn),M1 巨噬細胞對SMCC-7721 細胞的增殖、遷移和侵襲有明顯的抑制作用,而M2 巨噬細胞和TAMs 對SMCC-7721 細胞的增殖、遷移和侵襲有明顯的促進作用。M2 巨噬細胞和TAMs 能夠誘導SMCC-7721 細胞發(fā)生上皮間質轉化相關蛋白標志物改變,E-cadherin 表達下降,N-cadherin 和Vimentin 表達升高。這些結果提示我們,巨噬細胞通過極化為M1 巨噬細胞抑制肝癌細胞增殖、遷徙和侵襲；M2 巨噬細胞和TAMs 促進肝癌細胞發(fā)生EMT 樣改變,從而促進肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲等生物學行為的改變。有研究發(fā)現(xiàn),隨著肝癌進展,腫瘤相關巨噬細胞參與腫瘤微環(huán)境的建立并促進腫瘤的浸潤和轉移［16］,導致宿主細胞免疫紊亂及免疫沉默,刺激腫瘤生長因子生成,誘導炎性反應［17］。由此我們推測,在肝癌疾病的發(fā)展過程中,M2 巨噬細胞和TAMs 的促腫瘤效應超出M1 巨噬細胞抗腫瘤效應,造成機體免疫系統(tǒng)的紊亂,促進腫瘤的發(fā)展進程。

肝癌是發(fā)病進程多步驟、分階段的疾病,EMT 是反映細胞侵襲、遷移能力的重要指標,抑制EMT 可減弱肝癌的轉移,從而提高肝癌的臨床治療效果,降低肝癌復發(fā)率［18］。在肝癌細胞SMCC-7721 中,腫瘤巨噬細胞可以通過EMT 過程影響細胞侵襲,但在其他肝癌細胞系中是否有相同的意義,仍需我們進一步探究。