姜黃素緩解毒死蜱對大口黑鱸氧化脅迫的分子機制

趙柳蘭，唐 鋼，熊 陳，韓帥帥，楊春平，羅 偉，李志瓊，楊 淞*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都 611130）

水體徑流中農(nóng)藥引起的水污染問題受到廣泛關注[1]，特別是廣譜有機磷農(nóng)藥的使用。毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）是最普遍的有機磷農(nóng)藥之一，在水稻、小麥、大豆和棉花等大田作物的病蟲害防治中經(jīng)常使用，被世界衛(wèi)生組織列為Ⅱ類中度危害農(nóng)藥[2]。施用后，其可以通過徑流、河流、水渠、池塘等水域途徑進入養(yǎng)殖水體[3]。除了對農(nóng)業(yè)水體本身造成殘留污染外，毒死蜱對污染水域內(nèi)的魚類也表現(xiàn)出高度毒性[4]。大口黑鱸是我國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一，然而在養(yǎng)殖過程中極易遭受環(huán)境中毒死蜱等有毒物質(zhì)的危害，導致品質(zhì)下降甚至減產(chǎn)。因此，解析慢性毒死蜱脅迫影響大口黑鱸抗氧化和免疫功能的分子機制，對培育大口黑鱸優(yōu)良品種，促進大口黑鱸產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

在飲食中添加抗氧化藥物可以在一定程度上減輕毒死蜱造成的氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素具有廣泛的藥理作用，多種藥理活性被發(fā)現(xiàn)與抗氧化、抗炎、抗病毒、抗菌和抗癌作用有關，對各種慢性疾病、糖尿病、過敏、關節(jié)炎、阿爾茨海默病和其他慢性疾病具有潛在的治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，長期暴露于毒死蜱可誘導炎癥反應，促進細胞凋亡并引起慢性應激癥狀或疾病，如肥胖、阿爾茨海默病和帕金森病[5-7]。因此，如何改善由毒死蜱引起的氧化脅迫，并降低水產(chǎn)品魚肉中的殘留，具有重要的產(chǎn)業(yè)價值。盡管姜黃素已被證明是一種安全的飼料添加劑，可以用于改善水產(chǎn)養(yǎng)殖中魚類的生長[8]，但姜黃素對慢性毒死蜱暴露的改善作用尚未見報道。

為了探索低濃度毒死蜱長期脅迫對大口黑鱸的影響以及姜黃素在慢性脅迫中的改善效果，筆者通過實時熒光定量技術檢測了慢性毒死蜱脅迫下大口黑鱸鰓、腸和肝組織免疫及抗氧化功能中主要基因（抗氧化、緊密連接、免疫和凋亡）的表達量，并通過蛋白印跡技術進一步驗證了肝臟中部分基因的表達。我們的研究結果顯示，與對照組相比，毒死蜱脅迫導致MDA含量增加了一倍。丙二醛是脂質(zhì)過氧化過程中的主要終產(chǎn)物，是評價細胞過氧化損傷的重要指標，其水平的顯著增加表明慢性毒死蜱暴露引起了機體氧化應激的發(fā)生。此外，鰓、腸和肝組織中SOD活性的增強以及CAT、GSH-Px活性的降低與鯉研究一致[9]，這說明抗氧化酶系統(tǒng)在應對外源性污染物脅迫時發(fā)揮了重要作用。

轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）是抗氧化系統(tǒng)的關鍵組成部分，與Keap1結合，并在生理條件下與肌動蛋白細胞骨架結合[10]。當機體出現(xiàn)氧化損傷時，過量的ROS可激活與抗氧化作用元件（antioxidant response element，ARE）結合的 Nrf2，從而調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和Ⅱ期解毒酶的表達[11]。但是，Nrf2在毒死蜱慢性脅迫中是否有效促進了抗氧化功能和免疫功能尚不清楚。通過長達60 d的慢性脅迫，我們的結果發(fā)現(xiàn)長期慢性脅迫，上調(diào)了大口黑鱸幼魚鰓、腸道Keap1的表達，但下調(diào)了Nrf2基因的表達。在酶活層面和蛋白層面證明，解離的Nrf2基因進一步與ARE結合，啟動抗氧化應激系統(tǒng)從而增強腸道的抗氧化能力。然而，肝臟中Nrf2和Keap1先升高后降低，這可能與組織抗氧化能力的差異以及毒死蜱殘留水平有關。此外，毒死蜱促進了大口黑鱸鰓、腸和肝組織中 TNF-α、IL-8和 IL-15基因的表達，而TGF-β1基因在20 d時表達上調(diào)，并隨脅迫時間的延長而降低。而過度和微弱的炎癥反應都會導致免疫平衡的喪失，使機體更容易受到病原體的侵害[12]。大口黑鱸鰓、腸和肝組織中的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表達水平在脅迫后均顯著增加，Bax表達上調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)。這些結果表明毒死蜱慢性脅迫促進了凋亡的發(fā)生。細胞凋亡的執(zhí)行因子caspase-3的相對蛋白表達水平明顯高于對照組和姜黃素改善組，進一步證實了毒死蜱對細胞凋亡的誘導作用（圖1）。

圖1 慢性毒死蜱誘導氧化應激和免疫紊亂網(wǎng)絡圖Figure 1 Network map of oxidative stress and immune disorders induced by chronic chlorpyrifos

姜黃素是一種多酚化合物，在調(diào)節(jié)轉錄因子和細胞因子等信號分子方面發(fā)揮著有益作用[13]。本研究結果表明，CPF脅迫導致腸緊密連接蛋白Claudin7和Occludin的表達顯著下調(diào)，而日糧中添加姜黃素可顯著增加其表達量，從而改善毒死蜱脅迫引起的腸屏障功能損傷。此外，姜黃素對環(huán)境毒性的抗肝毒性作用已被廣泛報道，主要通過抑制肝臟炎癥、降低氧化應激[14]、增加解毒酶的表達[15]和維持線粒體功能來介導，從而保護肝臟免受纖維化和氧化損傷[16]。但是姜黃素如何通過調(diào)節(jié)Nrf2來改善由慢性毒死蜱脅迫引起的氧化損傷和免疫紊亂，以及是否能顯著降低肌肉中毒死蜱殘留尚不清楚。但從我們的結果來看，與毒死蜱脅迫組相比，姜黃素顯著促進了Nrf2的表達；顯著提高了keap1的表達，從而激活下游抗氧化基因的表達，發(fā)揮抗氧化應激作用。同時，與對照組相比，姜黃素顯著增加了鰓、腸和肝組織的TGF-β1、IL-10和Bcl-2表達水平，從而起到抗凋亡和抗炎的作用。此外，姜黃素處理組肌肉中毒死蜱殘留要顯著低于毒死蜱脅迫組。在毒死蜱脅迫后期，姜黃素組Caspase-3、Caspase-8基因的表達大幅上調(diào)，但在前期卻顯著低于毒死蜱脅迫組，這表明只要毒死蜱脅迫處理都會誘導大口黑鱸的炎癥反應和細胞凋亡，而姜黃素在脅迫前期可有效改善毒死蜱引起的組織炎癥和凋亡；隨著氧化應激的加劇，這種改善作用逐漸削弱。綜上，姜黃素通過調(diào)控Nrf2的表達，激活抗氧化系統(tǒng)，發(fā)揮抗氧化功能，降低大口黑鱸受到的脅迫損傷，并可能影響肌肉品質(zhì)。

雖然補充姜黃素的有益效果在這項研究中得到了證實，但尚不清楚這些保護作用能持續(xù)多久。從毒死蜱在肌肉中的富集結果來看，CU組CPF在20、40和60 d內(nèi)的生物累積量不顯著，但仍有增加的趨勢（圖2）。毒死蜱在體內(nèi)并不能很快降解，而是緩慢地代謝為CPO（氧合毒死蜱）和TCP（3,5,6-三氯吡啶-2-苯酚），從而引起持續(xù)的氧化損傷。因此，這些結果證明，姜黃素并不能改變毒死蜱引起的不可逆損害，只是延遲了毒死蜱的損傷時間，肝臟中Caspase-3和keap1的蛋白表達水平進一步證實了這一點，這可能與姜黃素低的吸收效率相關[17]。因此，長期接觸毒死蜱引起的代謝紊亂會干擾魚類的正常生長，增加水產(chǎn)品的食品安全風險。

圖2 毒死蜱和姜黃素處理對肌肉中毒死蜱殘留濃度的影響Figure 2 Effects of chlorpyrifos and curcumin on the bioaccumulation of chlorpyrifos in muscle

綜上所述，該研究通過模擬自然水體中魚類受到的慢性毒死蜱脅迫環(huán)境，構建了毒死蜱脅迫以及姜黃素改善條件下大口黑鱸抗氧化和免疫應答的實驗模型，揭示了慢性毒死蜱脅迫下抗氧化和免疫相關因子調(diào)控炎癥發(fā)生的分子機制，同時為低劑量毒死蜱脅迫下魚類的治療手段提供有價值的參考資料。